Name: Nanoinjection paires et test délectrophysiologie à lécran de la bioactivité des composés en utilisant le Drosophila melanogaster Système de fibre géant (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Découvrez une méthode de nanoinjection couplée à l'électrophysiologie pour évaluer la bioactivité des composés neuromodulateurs sur le système de fibre géante de Drosophila melanogaster. Cette technique permet un suivi en temps réel des effets sur les circuits neuronaux.

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Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Mari et le laboratoire Godenschwege, en particulier Aline Yonezawa, pour les commentaires et l&#39;aide à ce protocole. Ce travail a été financé par l&#39;Institut national des troubles neurologiques et des maladies de subvention à la bande FM R21NS06637 et TAG; AB a été financé par le nombre National Science prix de la Fondation 082925, URM: biologie intégrative pour les futurs chercheurs.

1. Électrophysiologie Rig Set-up <ol><li> L&#39;équipement requis pour la plate-forme d&#39;électrophysiologie set-up est décrite en détail par Augustin et al. dans le présent Journal 14. S&#39;il vous plaît se référer à cet article pour une explication détaillée des appareils électrophysiologiques nécessaires. </li><li> Modifier la plate-forme décrit précédemment électrophysiologie set-up 14 par l&#39;ajout d&#39;un micromanipulateur sixième, qui détient le nanoinjector. Pour un accès facile à la tête de l&#39;animal, il doit être placé entre les deux micromanipulateurs électrode de stimulation comme le montre la figure 2. </li><li> Avant de commencer l&#39;expérience, veiller à ce que vous avez une gamme à l&#39;aise sur tous les axes de rotation avec tous les micromanipulateurs, et que toutes les électrodes ainsi que la micropipette d&#39;injection (voir étape 2) peut atteindre l&#39;animal. </li></ol> 2. Nanoinjection Set-up <ol><li> Le nanoinjection set-up nécessite une Nanoliter2000 (World Precisisur les instruments, Sarasota, Floride, Etats-Unis) ou de type similaire de l&#39;injecteur qui permet des injections contrôlées en quantités nanolitre. </li><li> Préparer aiguille d&#39;injection en utilisant les micropipettes de verre sont fournies avec l&#39;injecteur en les tirant à une résistance de 80-100 MQ avec une électrode de traction. </li><li> Pour les injections lisses, il est nécessaire de biseauter les micropipettes à une ouverture de 11 à 17 um à un angle de 45 degrés (figure 3). </li><li> Lentement remblayer la micropipette d&#39;injection avec de l&#39;huile synthétique à l&#39;aide d&#39;une seringue Hamilton selon les instructions du manuel Nanoliter2000, veiller à ce que les bulles d&#39;air sont présents. </li><li> Fixez soigneusement la micropipette sur la nanoinjector et se préparent à charger le composé en vidant l&#39;excédent d&#39;huile selon les instructions du manuel Nanoliter2000. </li><li> Placez l&#39;injecteur sur le micromanipulateur et charger le composé selon les instructions dans le manuel Nanoliter2000. Assurez-vous que la pointe de la micropipette ne se brise pas au cours de cetteProcédure. </li><li> Réglez la quantité désirée de nanolitres être injectés dans la boîte de commande de l&#39;injecteur selon les instructions du manuel Nanoliter2000. S&#39;il vous plaît noter que le montant total injecté ne doit pas dépasser 100 nl. Nous avons constaté que de plus grandes quantités de solutions de contrôle salines peuvent affecter la fonction du circuit de GFS. </li><li> Il est essentiel d&#39;avoir l&#39;injecteur débranché de la boîte de commande lors de l&#39;acquisition d&#39;enregistrement à l&#39;exception de l&#39;injection lui-même, depuis l&#39;alimentation électrique de l&#39;nanoinjector interfère avec les enregistrements, qui est visible comme un bruit de fond (Figure 4). Cependant, ne pas déconnecter l&#39;alimentation de la boîte de commande comme il le re-régler. </li></ol> 3. Drosophila melanogaster Préparation <ol><li> Anesthésier 2 à 6 mouches d&#39;un jour avec CO 2 ou sur la glace comme décrit précédemment 14,15. </li><li> Une fois immobile, utilisez une paire de pince à épiler pour transférer l&#39;animal à un réseau Wi petite plaquee de la cire molle dentaire par le ramasser de ses jambes. S&#39;il vous plaît noter que la mouche des fruits mâle pèse environ 1,0 mg et une mouche à fruit femelle pèse environ 1,2 mg, ce qui composé à poids corporel ratio est différent chez les mouches mâles et femelles. Par conséquent, il est recommandé d&#39;utiliser un seul sexe pour les expériences. </li><li> Comme décrit précédemment 14,15, soigneusement monter du côté battant dorsale et veiller à ce que le thorax et la tête sont immobilisées avec de la cire dentaire mou placé autour du corps. Étaler soigneusement les ailes de telle sorte qu&#39;elles se trouvaient perpendiculaire au thorax (Figure 2, C). La mouche doit être montée avec le moins de dommages possible. </li></ol> 4. Nanoinjection Jumelé / électrophysiologie <ol><li> Placez la volée monté sur la plate-forme d&#39;électrophysiologie avec sa tête vers les électrodes de stimulation. </li><li> Empaler l&#39;animal avec le stimulant, sol correspondant et des électrodes d&#39;enregistrement tel que décrit précédemment 14,15 (Figure 2, C). Sauf indication contraire souhaité, électrode d&#39;enregistrement seul endroit dans le DLM et l&#39;autre dans le muscle TTM. Le muscle DLM est situé dans le thorax entre les antérieurs dorso-centrales poils et la ligne médiane de la mouche. Le muscle TTM est situé près des attaches d&#39;aile, entre les postérieurs et antérieurs Supra-Alar poils de la mouche 7. </li><li> Aligner la micropipette d&#39;injection contenant le composé avec le centre de la ocelles trois situés sur la partie médiane postérieure de la tête, mais ne pas injecter encore (Figure 2, C). </li><li> Avant l&#39;injection du composé obtenir un enregistrement de base de la GF et GF TTM à DLM voies de la fibre géante (GFS, figure 1) par la stimulation du cerveau. Pour ce faire, activer les fibres géantes (GFS) avec 10 trains de 10 stimuli (40-50 mV) chaque donnée pour une durée de 0,03 ms à 100 Hz avec un délai de 1 seconde entre les trains 14,15 (figure 4). Le type sauvage vole shOuld être en mesure de suivre un-to-one à ce rythme de stimulation à la fois pour DLM et les voies de TTM. Jeter la volée si le GF et GF DLM aux voies TTM ne suivent pas la stimulation de 100 Hz à un ratio de 1:1. </li><li> Mettre à la stimulation continue de la GF avec des impulsions uniques à 1 Hz (Figure 4). </li><li> Rapidement brancher l&#39;injecteur dans la boîte de contrôle. Même si le bruit de fond va interférer avec les enregistrements de stimulation 1 Hz, ne pas abandonner. </li><li> Insérer soigneusement la micropipette injection dans la capsule de tête de la mouche juste au-dessous de la cuticule, et injecter la quantité désirée de composé dans l&#39;hémolymphe de la volée tout en maintenant la stimulation de 1 Hz (figure 4). Grâce au système circulatoire ouvert de la mouche, le système nerveux tout entier seront exposés au composé en quelques secondes. Bien qu&#39;un site d&#39;injection particulier n&#39;est pas critique pour délivrer des composés dans l&#39;hémolymphe, on trouve la région des ocelles, qui sont de localiserd médial du côté le plus dorsale de la capsule céphalique, d&#39;être un site pratique qui permet une injection facile qui mène à une distribution rapide et même du composé. </li><li> Retirer immédiatement micropipette d&#39;injection à partir du site d&#39;injection et de débrancher l&#39;injecteur du boîtier de commande tout en continuant le 1 Hz GF stimulation jusqu&#39;à 1 min après l&#39;injection (figure 4). </li><li> Dans le but de révéler des effets plus subtils de composés sur la SFP, l&#39;accent sur les fibres géantes (GFS) avec 10 trains de 10 stimuli à 100 Hz avec un délai de 1 seconde entre les trains. Continuer à tester la fonction des voies de GF avec ce paradigme toutes les 5 minutes jusqu&#39;à 15 minutes (Figure 4). Toutefois, des intervalles plus courts ou plus longs périodes de surveillance sont également possibles. </li><li> Afin de tester si le composé a un effet au niveau des jonctions neuromusculaires (NMJs) de la SFP, et peut-être affiner les effets du composé, procéder pour activer le moteur neurones directionTLY par la stimulation thoracique. Pour ce faire, retirez les électrodes de stimulation dans les yeux et de les remplacer sur les côtés antérieurs du thorax afin de stimuler les neurones moteurs avec 10 trains de 10 stimuli à 100 Hz. </li></ol> Remarque: Les traces d&#39;électrophysiologie montrés dans la vidéo ne correspondent pas à des effets de l&#39;injection de colorant pur. 5. Les résultats représentatifs Effet d&#39;un antagoniste sur l&#39;ISP aux DLM synapse du système fibre géant Methyllycaconitine citrate (MLA) est un antagoniste nAChR qui est spécifique pour les sous-types a7 nAChR. Le PSI à DLMn synapse dans la voie de GF-DLM est dépendante de la sous-type Dα7 nAChR pour un bon fonctionnement, tandis que l&#39;enlèvement génétique de sous-type Dα7 nAChR est sans effet sur ​​la voie GF-MTT 5,6. Afin de démontrer la spécificité et la sensibilité de notre test nous avons injecté député à différentes concentrations (0, 0,02, 0,04, 0.08, 0,12 ng / mg, 46 nl injecté) dans la tête de l&#39;animal (n = 10 pour un traitement Composé; n = 15 pour le traitement solution saline). Seules les mouches mâles (de type sauvage génotype sauvage 10E) ont été utilisés, et l&#39;effet du composé a été contrôlée pour un total de 15 minutes après l&#39;injection. La figure 5 représente la différence entre les enregistrements de référence obtenues avant l&#39;injection et ceux obtenus après l&#39;injection en réponse à l&#39;entraide judiciaire et la solution de contrôle solution saline. Nous avons trouvé que l&#39;injection de l&#39;entraide judiciaire pour conséquence l&#39;incapacité de la voie de GF-DLM de suivre un-à-un à 100 Hz par des stimulations de l&#39;ETG dans le cerveau alors que la voie GF-TTM est demeurée inchangée. (Figure 5, trace Haut et milieu, t-test effectué entre les contrôles salins [0 ng / mg] et les différentes concentrations de MLA à chaque point de temps, sauf si les données sont non-paramétrique [normalité et l&#39;égalité des variances testé], sinon nous utilisons un test de Mann-Whitney. * p &lt;0,001). Toutefois, une r one-to-oneÉPONSE de la DLM a été observée lorsque les neurones moteurs ont été stimulées directement (figure 5, trace en bas), ce qui démontre que la fonction de la JNM DLM et TTM n&#39;est pas affectée par le député. MLA est apparu pour atteindre son maximum d&#39;effet 1 minute après l&#39;injection pour 0,04, 0,08 et 0,12 ng / mg de MLA injecté, comme aucun autre changement significatif n&#39;a été noté au cours des 15 minutes suivantes de période d&#39;essai. En outre, le composé a atteint un effet maximum à 0,08 ng / mg depuis plus fortes réponses n&#39;ont pas été observés avec la dose plus élevée de 0,12 ng / mg. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Le diagramme de fibre géante du système de la fibre géante (GFS). Les fibres géantes (GFS, montré en rouge) synapse électrique (Gap jonctions) ainsi que chimiquement (cholinergique) sur un périphérique Interneuron synapse (PSI, en vert) et le neurone Tergo Muscle Trochanteral (TTMn, représenté en jaune) 5. Le PSI DLMn (dorsale neurone musculaire longitudinale, représentée en bleu) de connexion dépend de Dα7 sous-type nAChR 6. Enfin, la jonction neuromusculaire (JNM) de l&#39;TTMn et le DLMn sur le saut (TTM, en violet) et les muscles de vol (DLM, en violet) est glutamatergique. Remarque: Le GF à la connexion ISP est à la fois électrique et chimique. Cependant, chez les mutants shakB (qui ne disposent pas des jonctions communicantes), aucune réponse ne peut être enregistré à partir du DLM sur la stimulation de l&#39;ETG dans le cerveau, ce qui démontre que le composant chimique en l&#39;absence de connexions électriques ne suffit pas d&#39;évoquer un potentiel d&#39;action dans le PSI 5,16-18. Parce que le GF à la connexion ISP est dépendante de jonctions lacunaires, ce chiffre montre que la jonction GAP à la synapse pour des raisons de simplicité. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Micromanipulateurs set-haut. <ol class="ualpha"><li> Une modification de set-up d&#39;un protocole déjà publié 14 est utilisée pour ajuster le micromanipulateur d&#39;injection pour les enregistrements appariés avec GFS nanoinjections simultanées. La préparation à la mouche montée est orienté à la tête de la mouche vers l&#39;expérimentateur. Le micromanipulateur d&#39;injection (N ° 1) est placé en face de l&#39;expérimentateur entre les deux manipulateurs pour les électrodes de stimulation (2 tungstène et # N ° 3). Les deux micromanipulateurs pour les électrodes d&#39;enregistrement de verre (n ° 4 et 5) sont placés sur le côté gauche et droite, respectivement. Le micromanipulateur pour l&#39;électrode de masse de tungstène (# 6) est placé le plus loin dans le dos soit sur le côté gauche (quels) ou sur le côté droit. </li><li> Une vue rapprochée du sommet de l&#39;arrangement des différentes électrodes et micropipette d&#39;injection. </li><li> Un correctement monté D. melanogaster empalé avec des électrodes et micropipette d&#39;injection prête pour l&#39;injection. Notez que l&#39;animal corpsest monté avec son thorax horizontalement et ses ailes déployées. La cire est bien enroulé autour de son corps empêchant l&#39;animal de se déplacer. En outre, l&#39;électrode de masse (# 6, dans l&#39;abdomen), les électrodes d&#39;enregistrement de verre (# 4 et # 5, dans le thorax, a souligné par des contours noirs), et les électrodes de stimulation (# 2 et # 3, une dans chaque oeil ) sont empalés en place, comme décrit précédemment 14. La micropipette d&#39;injection (# 1) est correctement aligné avec le centre de la ocelles trois (encerclée). Insertion de la micropipette d&#39;injection doit être placée dans ce domaine. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Micropipette d&#39;injection biseauté. Un schéma d&#39;une micropipette correctement biseauté est montré ici. L&#39;ouverture électrode doit être biseauté à un angle de 45 degrés et une ouverture entre 11 à 17 um. Une micropipette l&#39;injection proprement dite en biseau est crucial pour une injection en douceur avec un minimum dAmage à la mouche. <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Schéma d&#39;ensemble du protocole nanoinjection / électrophysiologie. Un diagramme représentant de l&#39;ensemble du régime de la nanoinjection / protocole d&#39;électrophysiologie. Commencez par l&#39;obtention d&#39;un enregistrement de base en stimulant les fibres géantes (GFS) à 100 Hz avec 10 trains de 10 stimuli chacune (un seul train illustré ici). Avant l&#39;injection, de commencer les stimulations 1 Hz une seconde. Pendant le temps d&#39;injection (injecteurs tout est branché sur le boîtier de commande), vous pourrez observer le bruit de fond important, cependant, ne pas interrompre les enregistrements. Après l&#39;injection (et de l&#39;injecteur est débranché de la boîte de commande), continuer la stimulation de 1 Hz pendant environ 1 minute de plus. Enfin, passez à souligner le GFS avec 10 trains de 10 stimuli à 100 Hz et de continuer à tester la fonction des voies de GF avec ce paradigme toutes les 5 minutes jusqu&#39;à 15 minutes. Remarque: Les enregistrements wavant manipulé pour créer l&#39;économie générale et ne représentent pas un résultat spécifique obtenu. Pas à l&#39;échelle, et non pas toutes les traces sont visibles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3597/3597fig4large.jpg">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img src="/files/ftp_upload/3597/3597fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Les effets de la MLA dans le SFG. <ol class="ualpha"><li> Une représentation graphique des effets de la α7 nAChR antagoniste methyllycaconitine citrate (MLA) sur la voie de GF-DLM de la mouche des fruits à différentes concentrations (0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 ng / mg n = 10 pour le traitement composé.; n = 15 pour le traitement salin). Seulement une minute après l&#39;injection, un effet significatif et immédiat a été observée avec 0,04 ng / mg de MLA. Un effet significatif a également été vu avec 0.8ng/mg et 0.12ng/mg de l&#39;entraide judiciaire à 100Hz stimulation de la SFP. Aucune différence significative n&#39;a été notée entre les contrôles salines et de 0,02 ng / mg de MLA. En outre, aucun i changereffet n a été observée après une post-injection minute pendant le temps testé (15 minutes). Un t-test a été effectué entre les contrôles salins (0 ng / mg) et les différentes concentrations de MLA à chaque point dans le temps. Les niveaux sont signalés en moyenne + / - SEM, * p &lt;0,001. </li><li> Traces échantillon des réponses DLM à 100 Hz de stimulation. Trace du haut montre les réponses du muscle avant l&#39;injection député lors de la stimulation GF dans le cerveau. Notez que le muscle est capable de répondre à chaque stimulus one-to-one à 100 Hz. Moyen de trace affiche les réponses de la DLM après injection de MLA (0,12 ng / mg). Notez que le muscle n&#39;est pas en mesure de répondre à chaque stimulus one-to-one à 100 Hz. (Astérisques). Trace du bas montre les réponses de la DLM de la même préparation (0,12 ng / mg) lors de la stimulation directe des neurones moteurs dans le thorax. Parce que DLM répond one-to-one à 100 Hz avec une stimulation thoracique, l&#39;échec de réponses avec des stimulations du cerveau peut être attribuée à l&#39;cholinergique PSI-DLMn connexion. </li><li> Une représentation graphique des effets à des concentrations différentes d&#39;entraide judiciaire (0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12 ng / mg) sur la voie de GF-TTM. Aucun effet significatif n&#39;a été observée entre une solution saline (0 ng / mg) et les injections de composés à aucun moment. Un t-test a été effectué entre les contrôles salins (0 ng / mg) et les différentes concentrations de MLA à chaque instant, * p &lt;0,001. </li><li> Traces échantillon des réponses TTM à 100 Hz de stimulation. Trace du haut montre les réponses du muscle avant l&#39;injection député lors de l&#39;activation GF avec une stimulation dans le cerveau. Notez que le muscle est capable de répondre à tous les stimuli à 100 Hz. Moyen trace montre les réponses de la DLM après injection de MLA (0,12 ng / mg). Les réponses du muscle à la stimulation TTM du GF dans le cerveau reste en tête-à-un. Trace du bas montre les réponses de la TTM de la même préparation à 100 Hz de stimulation des neurones moteurs dans le thorax (0,12 ng / mg). </li></ol>

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<li>Gorczyca, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cholinergic+synapse+in+the+giant+fiber+pathway+of+Drosophila+using+conditional+mutations+of+acetylcholine+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis.</a> J. Neurogenet. 1, 289-313 (1984).</li>
<li>Allen, M. J., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+component+of+the+mixed+GF-TTMn+synapse+in+Drosophila+melanogaster+uses+acetylcholine+as+its+neurotransmitter%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter.</a> The European journal of neuroscience. 26, 439-445 (2007).</li>
<li>Mejia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+for+in+vivo+screening+of+toxins+using+the+Drosophila+Giant+Fiber+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">A novel approach for in vivo screening of toxins using the Drosophila Giant Fiber circuit.</a> Toxicon. 56, 1398-1407 (2010).</li>
<li>Stork, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+function+of+the+blood-brain+barrier+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila.</a> J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Le bio-essai nanoinjection / électrophysiologie présentée ici permet de dépistage rapide de composés dans le système nerveux de la mouche des fruits. C&#39;est un roman dans la technique in vivo qui nécessite de petites quantités d&#39;un composé de susciter un effet sur ​​une variété de cibles moléculaires dans un circuit neuronal bien caractérisé. Cette méthode peut être utilisée pour tester la bioactivité des composés différents, à partir de toxines inconnues disponibles dans le commerce des agents ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Électrodes de verre d&#39;enregistrement: verre borosilicate capillaires </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 1B100F-4 </td><td> 1.0mm OD, 0.58mm ID </td></tr><tr><td> Stimulateur </td><td> Instruments de gazon </td><td> Modèle S48 </td><td></td></tr><tr><td> Amplificateur </td><td> Obtenir Instruments Inc </td><td> 5A Modèle </td><td></td></tr><tr><td> Acquisition de données Logiciels: Digidata </td><td> Molecular Devices </td><td> Modèle 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Logiciel de collecte de données: pCLAMP </td><td> Molecular Devices </td><td> Version 10 </td><td></td></tr><tr><td> Stéréomicroscope wvec la fibre optique d&#39;éclairage anneau microscope </td><td> AmScope </td><td> SM-4T Modèle HL250-AR </td><td></td></tr><tr><td> Dissection portée pour le montage </td><td> AmScope </td><td> SM-2TZ </td><td></td></tr><tr><td> Kite Manuel Micromanipulateur &amp; inclinable base </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> Modèle # M3301 Kite: Modèle # KITE-M3-L </td><td></td></tr><tr><td> Drosophila melanogaster sauvage 10E génotype (souche de type sauvage) </td><td> Bloomington Stock centre </td><td> Stock # 3892 </td><td></td></tr><tr><td> Vertical pipette extracteur </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modèle 700c </td><td></td></tr><tr><td> Micropipettes de verre d&#39;injection: verre borosilicate capillaires </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> Catalogue # 4878 </td&gt; <td> 1.14mm OD, ID 0.5mm </td></tr><tr><td> Huile de silicone </td><td> Pêcheur </td><td> Catalogue # S159-500 </td><td></td></tr><tr><td> Chanfreiner </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td> KT Brown Type d&#39; Modèle # BV-10 </td><td></td></tr><tr><td> Nanoliter2000 </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> Catalogue # B203XVY </td><td></td></tr><tr><td> Colorant alimentaire bleu </td><td> McCormick </td><td> N / A </td><td> Ingrédients: Eau, Propylène Glycol, FD &amp; C Blue 1, et 0,1% (conservateur) propylparaben. </td></tr><tr><td> Methyllycaconitine citrate (MLA) </td><td> Bioscience Tocris </td><td> Catalogue # 1029 </td><td></td></tr><tr><td> Bâtonnets de cire en plastique </td><td> Hygenic Corporation (Akron Ohio aux Etats-Unis) </td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table>

nanoinjection paires et test d&#39;électrophysiologie à l&#39;écran de la bioactivité des composés en utilisant le drosophila melanogaster système de fibre géant

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Criblage de composés pour l&#39;activité in vivo peut être utilisé en tant que première étape d&#39;identifier des candidats qui peuvent être développés en 1,2 agents pharmacologiques. Nous avons développé un roman nanoinjection / électrophysiologie dosage qui permet la détection des effets modulateurs de composés bioactifs sur la fonction d&#39;un circuit neuronal qui sert de médiateur de la réaction de fuite chez Drosophila melanogaster 3,4. Notre test in vivo, qui utilise le système de Drosophila fibre géante (GFS, Figure 1) permet le dépistage des différents types de composés, tels que de petites molécules ou des peptides, et exige que des quantités minimales à obtenir un effet. En outre, le GFS Drosophila offre une grande variété de cibles moléculaires potentielles sur les neurones ou les muscles. Les fibres géantes (GFS) synapse électrique (Gap jonctions) ainsi que chimiquement (cholinergique) sur une synapse périphérique Interneuron (PSI) et le Tergo Muscle Trochanteral neurone (TTMn) 5 </sup&gt;. Le PSI à DLMn (dorsale neurone musculaire longitudinale) de connexion dépend de Dα7 récepteurs nicotiniques de l&#39;acétylcholine (nAChR) 6. Enfin, la jonction neuromusculaire (JNM) de l&#39;TTMn et le DLMn avec le saut (TTM) et les muscles de vol (DLM) sont glutamatergique 7-12. Ici, nous montrons comment injecter des quantités nanolitre d&#39;un composé, tout en obtenant électrophysiologiques des enregistrements intracellulaires du système de fibre géante 13 et la façon de surveiller les effets du composé sur la fonction de ce circuit. Nous montrons la spécificité du test avec du citrate de methyllycaconitine (MLA), un antagoniste nAChR, qui perturbe le PSI à DLMn connexion, mais pas le GF TTMn connexion ou la fonction de la jonction neuromusculaire au saut ou les muscles de vol. Avant de commencer cette vidéo, il est essentiel que vous regardez attentivement et se familiariser avec la vidéo intitulée &quot;JoVE enregistrements électrophysiologiques de la voie des fibres Géant de D. melanogaster &quot;de Augustin et al 7, comme la vidéo présentée ici est conçu comme une extension de cette technique existante. Ici, nous utilisons la méthode électrophysiologique des enregistrements et de se concentrer en détail que sur l&#39;ajout des nanoinjections appariés et de la technique de surveillance.

Un rapide<em&gt; In vivo</em&gt; Test pour tester des composés neuromodulateurs en utilisant le système de fibre géante (GFS) de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Est décrite. Nanoinjections dans la tête de l&#39;animal ainsi que des enregistrements électrophysiologiques de la SFP peut révéler la bioactivité des composés sur les neurones ou les muscles.

Nanoinjection paires et test d&#39;électrophysiologie à l&#39;écran de la bioactivité des composés en utilisant le Drosophila melanogaster Système de fibre géant

Le criblage de composés pour l'activité in vivo peut être utilisé comme première étape pour identifier des candidats susceptibles d'être développés en agents pharmacologiques1,2. Nous...

Dans cette vidéo, nous allons montrer comment injecter des quantités d’un composé exprimées en litres tout en obtenant des enregistrements électrophysiologiques du système de fibres géantes, et comment surveiller les effets de ce composé sur le fonctionnement de ce circuit. Avant de commencer cette vidéo, il est essentiel que vous regardiez attentivement et que vous vous familiarisiez avec la vidéo JoVE intitulée Enregistrements électrophysiologiques de la voie des fibres géantes de *Melanogaster* par Augustine et al. Étant donné que la vidéo présentée ici vise à compléter cette technique existante, le matériel requis pour le montage du dispositif d’électrophysiologie est décrit en détail par Augustine et al. Dans cette revue, nous modifions le montage du dispositif d’électrophysiologie précédemment décrit en y ajoutant un sixième micro-manipulateur, qui maintient un injecteur ano.Pour un accès facile à la tête de l'animal, celle-ci doit être placée entre les deux micromanipulateurs d'électrodes de stimulation. Le montage d'injection nanolitrique nécessite un injecteur de type Nanoliter 2000 ou équivalent, ainsi qu'une aiguille d'injection préparée à l'aide des micropipettes en verre fournies avec l'injecteur, étirées jusqu'à une résistance de 80 à 100 mégas. Pour des injections régulières, il est nécessaire d'affûter les micropipettes afin d'obtenir une ouverture de 11 à 17 micromètres selon un angle de 45 degrés.Remplissez lentement la micropipette d'injection avec de l'huile synthétique à l'aide d'une seringue Hamilton, comme indiqué dans le manuel du Nanoliter 2000, en veillant à ne pas introduire de bulles d'air. Fixez soigneusement la micropipette sur le nanoinjecteur et préparez-la au chargement du composé en éliminant l'excès d'huile, conformément aux instructions du mode de chargement du Nanoliter 2000. Le composé, comme indiqué dans le manuel du Nanoliter 2000.Veillez à ce que la pointe de la micropipette ne se casse pas pendant cette procédure. Réglez la quantité souhaitée de nanolitres à injecter sur la boîte de commande de l'injecteur, comme indiqué dans le manuel du NANOLITER 2000. Veuillez noter que la quantité totale injectée ne doit pas dépasser 100 nanolitres.Placez un Nanolitre 2000 sur le micromanipulateur situé entre les deux micromanipulateurs d'électrodes de stimulation. Débranchez l'injecteur de la boîte de commande pendant l'acquisition des enregistrements, sauf lors de l'injection elle-même. Toutefois, ne débranchez pas l'alimentation électrique de la boîte de commande, car cela la réinitialiserait. Anesthésiez les mouches âgées de deux à six jours avec du CO2 ou par les yeux, comme décrit précédemment.Une fois en place, utilisez une paire de pinces pour transférer l'animal sur une petite plaque recouverte de cire dentaire molle, en le prenant par les pattes comme décrit précédemment. Montez soigneusement la drosophile avec le dos vers le haut et assurez-vous que le thorax et la tête soient immobilisés à l’aide de cire dentaire molle placée autour du corps. Étalez délicatement les ailes afin qu’elles s’étendent perpendiculairement au thorax.Placer la drosophile montée sur le dispositif d'électrophysiologie avec la tête orientée vers les électrodes de stimulation, puis piquer l'animal avec les électrodes de stimulation, de mise à la masse et d'enregistrement correspondantes. Comme décrit précédemment, le muscle DLM est situé dans le thorax, entre les poils dorsaux centraux antérieurs et la ligne médiane de la drosophile. Le muscle TTM se trouve près des insertions des ailes, entre les poils postérieurs et antérieurs, et les poils supra-alaires internes de la drosophile. Aligner la micropipette d'injection contenant le composé avec le centre des trois osli situés sur la partie postérieure médiale de la tête, mais ne pas encore injecter. Avant l'injection du composé, obtenir un enregistrement de base des voies du système de la fibre géante allant de la fibre géante au muscle TTM et de la fibre géante au muscle DLM, par stimulation cérébrale, en activant les fibres géantes à l'aide de 10 trains de 10 stimuli à 100 hertz.Avec un délai d'une seconde entre les trains. Une mouche de type sauvage devrait être capable de suivre un-à-un à ce taux de stimulation pour les deux voies DLM et TTM. Jeter la mouche.Si les voies de la fibre géante vers le DLM et de la fibre géante vers le TTM ne suivent pas la stimulation à 100 hertz selon un rapport un pour un, passez à une stimulation continue de la fibre géante par des impulsions simples à un hertz. Branchez rapidement l'injecteur sur la boîte de commande, même si le bruit de fond perturbera les enregistrements de la stimulation à un hertz.Ne l'interrompez pas avec précaution. Insérez la micro-pipette d'injection dans la capsule céphalique de la mouche juste sous la surface. Injectez la quantité souhaitée de composé tout en maintenant la stimulation à un hertz.Retirer immédiatement la micropipette d'injection de l'ensemble d'injection et débrancher l'injecteur de la boîte de commande tout en poursuivant la stimulation à un hertz du fibre géante pendant une minute après l'injection. Afin de révéler des effets plus subtils des composés sur le système des fibres géantes, stimuler les fibres géantes avec 10 trains de 10 stimuli à 100 hertz avec un délai d'une seconde entre les trains. Continuer à tester la fonction des voies des fibres géantes selon ce protocole toutes les cinq minutes jusqu'à 15 minutes.Dans l'exemple présenté ici, la voie du fibre géant vers le TTM est restée inchangée après l'injection du composé, tandis que la voie du fibre géant vers le DLM a été affectée. Afin de tester si le composé exerce un effet au niveau des jonctions neuromusculaires du système des fibres géantes et éventuellement préciser l'ampleur de cet effet, stimuler directement les motoneurones par une stimulation thoracique. Retirer les électrodes de stimulation des yeux et les replacer sur les faces antérieures du thorax, puis appliquer 10 trains de 10 stimuli à 100 hertz afin de stimuler les motoneurones. Dans cet exemple, lorsque la stimulation est délivrée via le cerveau, la voie DLM ne suit pas de manière fiable.Cependant, la jonction neuromusculaire du DLM répond de manière un-à-un à 100 hertz avec une stimulation thoracique, excluant ainsi la jonction neuromusculaire comme cible particulière du composé injecté ; la cible du composé peut alors être restreinte aux connexions entre la fibre géante et le PSI, ou entre le PSI et le motoneurone du DLM.

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Nanoinjection paires et test délectrophysiologie à lécran de la bioactivité des composés en utilisant le Drosophila melanogaster Système de fibre géant (Vidéo) | JoVE Journal

Nanoinjection paires et test d'électrophysiologie à l'écran de la bioactivité des composés en utilisant le Drosophila melanogaster Système de fibre géant

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