Méthode pour l'isolement et l'identification des ARNm, les microARN et composants protéiques des complexes ribonucléoprotéiques partir d'extraits cellulaires utilisant RIP-Chip

L'objectif de cette vidéo est de démontrer la méthode d'isolement et d'identification des ARN et des composants protéiques des complexes ribonucléoprotéiques à partir d'extraits cellulaires, en utilisant des méthodes d'immunoprécipitation. Bonjour, je m'appelle Garrett Dom et je suis étudiant diplômé au sein du département de biologie moléculaire, de microbiologie et d'immunologie à l'Université du Missouri, où je travaille sous la direction du Dr. Eli Sso. Grâce aux progrès réalisés dans le séquençage à haut débit et l'analyse efficace par puces à ADN, l'expression génique globale et son analyse sont devenues des formes simples et facilement accessibles de collecte de données dans de nombreux modèles de recherche et de maladies.

Cependant, l'étude des niveaux d'ARNm du gène cible à l'état stationnaire ne correspond pas toujours directement aux niveaux protéiques à l'état d'équilibre. La régulation post-transcriptionnelle des gènes constitue une explication probable de la divergence entre les deux. Cette régulation est induite par les interactions des protéines liant l'ARN.

La régulation post-traductionnelle affecte la localisation, la stabilité et la traduction des ARNm en formant un complexe ribonucléoprotéique avec les ARNm cibles. L'identification de ces nouvelles cibles d'ARNm inconnues à partir d'extraits cellulaires présents dans ce complexe est essentielle pour comprendre les mécanismes et fonctions de la protéine liant l'ARN, ainsi que leur effet résultant sur la production protéique. Ce protocole décrit une méthode appelée ribo protéine, immunoprécipitation, ou RIP, qui permet d'identifier les ARNm spécifiques associés au complexe ribonucléoprotéique.

Avant de commencer l'expérience, il est essentiel de disposer de tous les réactifs, récipients et ustensiles. Traitez la verrerie libre d'ARN avec un inhibiteur d'ARNase, tel que RNA ZAP d'ambion, puis rincez avec de l'eau traitée au DPCI. Assurez-vous que tous les réactifs sont confirmés comme étant libres d'ARN. La première étape de la procédure consiste à récolter le complexe ribonucléoprotéique à partir du lysat cellulaire : récoltez des cellules tissulaires en croissance exponentielle afin d'obtenir entre deux et cinq milligrammes de protéines totales par échantillon utilisé ; généralement, deux boîtes de culture P 150 suffisent.

Ici, nous récoltons les lignées cellulaires humaines de cancer du sein MB 2 31 et MC seven et nous étudions les interactions ribonucléoprotéiques de la protéine lieuse d'ARN. Il est important de noter que, pour chaque protéine lieuse d'ARN étudiée, le nombre total de cellules et les quantités de protéines doivent être optimisés afin de maximiser les interactions appropriées entre l'ARNm cible et la protéine lieuse d'ARN. Récupérez les cellules par centrifugation à 1000 tr/min pendant environ huit à dix minutes à quatre degrés Celsius, puis lavez-les trois fois avec du PBS glacé. Après le dernier lavage, secouez doucement le fond du tube et remettez en suspension le culot cellulaire dans des volumes égaux de tampon de lyse polysomal préparé contenant des inhibiteurs d'ARNases et de protéases.

Il est recommandé de mesurer avec précision le volume exact du culot cellulaire, de pipeter doucement le mélange pour rompre les agrégats cellulaires, puis d'incuber le lysat sur de la glace pendant cinq minutes. Centrifuger à 13 000 ×g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius afin d'éliminer les débris ; transférer immédiatement le surnageant clarifié vers des tubes microcentrifugeurs RNAs Free prérefroidis, maintenir sur glace et stocker à moins 80 degrés Celsius.

Ce lysat peut être conservé jusqu'à six mois à moins 80 degrés Celsius. Évitez les cycles répétés de congélation-décongélation, car cela peut entraîner une dégradation des protéines et/ou des ARNm. Il est préférable d'effectuer l'IP immédiatement.

Réalisez une quantification rapide de la concentration en protéines et du lysat à l’aide d’un dosage protéique Bradford standard. Ensuite, nous devrons préparer les matériaux nécessaires à l’isolement de notre protéine d’intérêt spécifique. Prégonflez d’abord la protéine.

Incuber des billes Sphero toute la nuit dans du tampon NT deux supplémenté avec 5 % de BSA à quatre degrés Celsius. Utiliser le tampon NT deux dans un rapport de quatre pour un avec les billes PAS. Un entreposage à long terme pouvant aller jusqu'à plusieurs mois à quatre degrés Celsius est possible.

Lorsqu'il est supplémenté avec 0,1 % d'azide de sodium avant utilisation, éliminer l'excès de tampon NT deux afin que le rapport final entre les billes et le tampon soit de un pour un. À l'aide de tubes microcentrifugeurs de 1,5 millilitre exempts d'ARN, prélever 100 microlitres de la suspension SRO et ajouter 30 microgrammes d'anticorps pour chaque réaction d'IP individuelle. Par exemple, dans notre expérience, nous utilisons un anticorps who are, qui est un anticorps IgG1 de souris.

Par conséquent, notre anticorps témoin est également une IgG. Ensuite, ajoutez 100 à 200 microlitres de tampon NT2 au mélange d'anticorps et de billes. En outre, un anticorps apparié par isotype ou un sérum normal total de la même espèce doit être utilisé en parallèle comme contrôle d'anticorps contre l'ARN de fond.

Ajouter l'anticorps approprié au mélange de billes et incuber toute la nuit en agitant doucement à quatre degrés Celsius. Préparer les billes recouvertes d'anticorps immédiatement avant utilisation en les lavant avec un millilitre de tampon NT2 froid à la glace, cinq fois ; laver les billes par centrifugation à 13 000 ×g pendant une à deux minutes à quatre degrés. Retirer soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette manuelle ou d’un aspirateur.

Ce lavage permet d'éliminer l'anticorps non lié ainsi que les contaminants d'ARN provenant du mélange d'anticorps. Une fois le dernier lavage terminé, resuspendre les billes dans 700 microlitres de tampon T deux glacé, puis ajouter divers inhibiteurs d'ARN afin de protéger les ARNm cibles, notamment 10 microlitres d'ARN, 10 microlitres de DTT à 100 millimolaire et 15 microlitres d'EDTA. Compléter le volume à 900 microlitres avec du tampon NT deux.

Ensuite, nous allons immunoprécipiter le complexe cible. Nous recommandons vivement d'utiliser une étape de pré-élimination afin de réduire le signal de fond dans votre analyse d'ARN après la procédure de RIP : effectuez la pré-élimination avec 15 microgrammes d'anticorps témoin d'isotype pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Ajoutez 50 microlitres de billes PAS préalablement gonflées, non revêtues d'anticorps.

Incuber 30 minutes à quatre degrés Celsius avec rotation, puis centrifuger à 10 000 ×g à quatre degrés Celsius. Deuxième culot. Conserver le surnageant pour IP.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de lysat clarifié isolé contenant environ deux à cinq milligrammes de protéine au mélange d'anticorps préparé. La dilution du lysat permet de réduire le fond parasite ; enveloppez le tube dans du parafilm pour assurer un scellement étanche et incubez à quatre degrés Celsius pendant quatre heures sous agitation lente, puis centrifugez le tube à 5 000 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et conservez le surnageant pour une analyse éventuelle en le stockant à moins 80 degrés Celsius comme décrit précédemment. Lavez les billes cinq fois avec un millilitre de tampon T2 glacé et centrifugez à chaque fois.

Ensuite, retirez le surnageant à l’aide d’une pipette manuelle ou d’un aspirateur. Des méthodes plus rigoureuses peuvent être utilisées afin de réduire le fond en complétant le tampon NT2 avec du désoxycholate de sodium, de l’urée ou du SDS. Conservez les échantillons sur de la glace le plus possible et travaillez rapidement pour minimiser la dégradation de l’ARNm cible.

Enfin, nous utiliserons des traitements par ADN et protéinase K suivis d'une précipitation de l'ARN afin d'isoler les ARN des protéines nucléaires ribonucléoprotéiques après avoir lavé et remis en suspension les billes dans 100 microlitres de tampon N NT deux supplémenté avec cinq microlitres d'ADN sans ARN un. Conserver les échantillons à 37 degrés Celsius pendant cinq à dix minutes. Ajouter un millilitre de tampon N NT deux et centrifuger à 5 000 G pendant cinq minutes.

Jeter le SUPERNAT Reese après centrifugation du complexe protéique sur les billes SROs et ajouter 100 microlitres de tampon NT2 avec 5 microlitres de protéinase K à 10 milligrammes par millilitre et 1 microlitre de SDS à 10 %. Incuber le mélange de billes resuspendues pendant 30 minutes dans un bain-marie à 55 degrés Celsius, en agitant doucement toutes les 10 minutes. La protéinase K facilitera la libération des composants ribonucléoprotéiques. Centrifuger pour récupérer les billes.

Ajouter 5 000 ×g pendant cinq minutes à température ambiante, récupérer le surnageant, dont le volume devrait être d’environ 100 microlitres. Ensuite, ajouter deux billes, puis 200 microlitres de tampon NT2, centrifuger à 5 000 ×g pendant deux minutes. Récupérer environ 200 microlitres de surnageant et jeter les billes.

Combiner le super natin et ajouter 300 microlitres d'acide phénol de la couche inférieure en vortexant. Incuber une minute à température ambiante, puis centrifuger à vitesse maximale pendant une minute à température ambiante. Prélever 250 microlitres de la couche supérieure.

Veillez à ne pas perturber l'interface, car cela entraînerait une contamination. Ajoutez à l'échantillon d'ARN 25 microlitres d'acétate de sodium à un pH de 5,2, 625 microlitres d'éthanol glacé à 100 % et cinq microlitres de glyco bleu ; mélangez soigneusement. Conservez la solution toute la nuit à moins 20 degrés Celsius.

En outre, afin de garantir une récupération adéquate de l'ARN. L'ajout de glyco bleu augmentera la visibilité du culot d'ARN en agissant comme une molécule porteuse le jour suivant, mélanger les tubes par retournement trois à cinq fois, puis centrifuger à 12 000 G à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes et éliminer le surnageant. Ajouter un millilitre d'éthanol glacé à 70 % au culot bleu et mélanger par inversion ou vortexage, puis centrifuger.

Échantillon à 12 000 G à quatre degrés Celsius pendant deux minutes. Jeter le surnageant et centrifuger à 12 000 G pendant une minute à quatre degrés Celsius. Éliminer tout éthanol résiduel à 70 % à l’aide d’une pipette et sécher le culot à l’air.

Ajouter la température ambiante pendant cinq minutes. Rediluer dans 20 à 40 microlitres d’eau exempte d’ARN et d’ADN. L’échantillon est désormais prêt à être quantifié par spectrométrie NanoDrop et à subir des applications en aval, telles que la PCR quantitative en temps réel ou l’analyse par puces à ADN, après isolement des ARN. Les puces à ADN et la PCR quantitative en temps réel ont été réalisées afin de révéler les cibles d’ARNm de la protéine liant l’ARN, ainsi que leur enrichissement résultant de l’immunoprécipitation.

La confirmation par immunotransfert révèle une isolation propre de la protéine cible. La PCR quantitative démontre l'enrichissement relatif de la cible d'ARNm, l'actine bêta, par rapport aux témoins IgG. Alors que l'analyse par puces à ADN révèle des profils génétiques distincts entre les lignées cellulaires de cancer du sein MC7 et MB231, l'immunoprécipitation de ribonucléoprotéines s'est imposée comme un excellent outil permettant d'isoler et d'étudier les interactions entre les protéines liant l'ARN et leurs cibles ARN, utilisé par notre équipe ainsi que par de nombreux autres groupes de recherche. Bien que cette méthode soit sensible par nature et dans sa mise en œuvre, une exécution correcte de ce protocole permettra d'isoler ces complexes de ribonucléoprotéines, auxquels on n'avait pas pu accéder auparavant pour la découverte et l'analyse.