Name: Méthode pour lisolement et lidentification des ARNm, les microARN et composants protéiques des complexes ribonucléoprotéiques partir dextraits cellulaires utilisant RIP-Chip (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Découvrez l'isolement des complexes ribonucléoprotéiques par immunoprécipitation pour identifier les ARNm cibles des protéines liant l'ARN. Cette méthode facilite l'étude de la régulation post-transcriptionnelle.

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Department of Defense (Prix Idée W81XWH-07-0406) - Pour Ulus Atasoy NIH RO1 A1080870 - Pour Ulus Atasoy NIH R21 A1079341 - Pour Ulus Atasoy Université de Missouri fonds institutionnels - Pour Ulus Atasoy

Préparation Expérience Avant de commencer l&#39;expérience, il est essentiel d&#39;avoir tous les réactifs, les contenants et les ustensiles RNase libres. Traiter la verrerie avec inhibiteur de RNase (RNaseZAP, Ambion) suivie d&#39;un rinçage à l&#39;eau traitée au DEPC. Assurez-vous que tous les réactifs sont confirmés comme RNase. 1. Préparer mRNP Lysate <ol><li> Cultiver et récolter les cellules des tissus en croissance exponentielle pour produire entre 2-5 mg de protéines totales pour chaque RIP. <ol class="lalpha"><li> Deux P150 boîtes de culture sont généralement suffisants. </li><li> Pour chaque RBP objet d&#39;une enquête, le total des quantités cellulaires numériques et les protéines doivent être optimisées afin de maximiser l&#39;ARNm cible appropriée et les interactions pratiques commerciales restrictives. </li><li> RIP pour qRT-PCR peut exiger lysat cellulaire moins (environ 400 ug de protéine totale) grâce à son amplification et la méthode de détection en particulier pour les pratiques commerciales restrictives abondance élevés tels que HuR, AUF1, TIAR. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Sédimenter les cellules par centrifugation à 200 xg pendant 8-10 min à 4 ° C, puis laver trois fois avec PBS glacé. </li><li> Après lavage final, tapotez doucement la partie inférieure du tube et resuspendre le culot cellulaire dans des volumes égaux de tampon de lyse préparée polysome (PLB) avec les inhibiteurs de la protéase et la RNase. <ol class="lalpha"><li> Il est recommandé de mesurer le volume exact de culot cellulaire. </li></ol></li><li> Mélange pipette doucement (ne pas vortexer) pour briser les amas de cellules et incuber lysat sur glace pendant 5 min. </li><li> Centrifugeuse à 13.000 xg pendant 20 min à 4 ° C pour effacer le lysat de débris. </li><li> Transférer immédiatement effacé surnageant dans le tube de centrifugeuse pré-réfrigérés. </li><li> Garder sur la glace et conserver à -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Congélation immédiate complète la lyse des cellules correcte et empêche la liaison indésirable. Passez par le dégel RIP échantillon immédiatement suivant et conserver les échantillons sur la glace pour éviter la dégradation des ARN. &lt;/ Li&gt; <li> Ce lysat peut être stocké pendant jusqu&#39;à six mois à -80 ° C. Eviter de multiplier les cycles de congélation-décongélation, car cela peut conduire à des protéines et / ou la dégradation de l&#39;ARNm. </li></ol></li><li> Quantifier la concentration de protéines dans le lysat en utilisant un dosage standard de protéines Bradford. </li></ol> 2. Protéine d&#39;enveloppe A billes de sépharose avec des anticorps et Wash <ol><li> Pré-houle protéine A-Sepharose (PAS) des perles pendant la nuit dans NT2 tampon (volumes 3-4) avec 5% de SAB. Stocker à 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Le stockage à long terme de plusieurs mois à 4 ° C est possible lorsque complété avec de l&#39;azide de sodium à 0,1%. </li><li> Billes de Sepharose protéines doit être choisie en fonction de l&#39;isotype de l&#39;anticorps RBP cible. Un protéines G, et A / G ont toutes des cibles spécifiques d&#39;isotype et de modification de l&#39;affinité cible. Un protéines perles de sépharose ont été utilisés en fonction de la spécificité et de l&#39;affinité isotype des anticorps anti-protéines HuR. </li></ol></li><li> Avant toute utilisation, enlever l&#39;excès de tampon NT2, de sorteque les perles finales au rapport du tampon est de 1:1. </li><li> En utilisant des tubes de 1,5 ml microtubes RNase, retirez PAS 100 pl de suspension et ajouter 30 pg d&#39;anticorps pour chaque réaction IP individuelle (c.-à-spécifique RBP et contrôle isotypique). </li><li> Ajouter 100-200 ul de tampon NT2 à l&#39;anticorps talon mix. <ol class="lalpha"><li> Mélange peut être conservé pendant plusieurs semaines à 4 ° C quand il est complété avec de l&#39;azide de sodium à 0,1%. </li><li> Un anticorps d&#39;isotype apparié ou toute sérums normaux de même espèce doit être utilisé en parallèle comme un contrôle de l&#39;anticorps contre l&#39;ARN de fond. </li></ol></li><li> Ajouter anticorps approprié mélange de billes et incuber pendant la nuit, tumbling fin sur l&#39;extrémité à 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Optimiser le titre d&#39;anticorps de la protéine spécifique à l&#39;étude (pg 1, 5, 10 ou 30 de l&#39;anticorps est généralement suffisant). </li></ol></li><li> Préparer anticorps billes revêtues immédiatement avant l&#39;utilisation d&#39;un lavage avec 1 ml deglacée NT2 tampon de 5 fois. <ol class="lalpha"><li> Laver mélange de billes par centrifugation à 13.000 xg pendant 1-2 min à 4 ° C. </li><li> Retirez délicatement le maximum de surnageant avec pipette à la main ou un aspirateur mais attention à ne pas perturber le culot. </li><li> Lavage aide à éliminer les anticorps non liés ainsi que les contaminants RNase partir d&#39;un mélange d&#39;anticorps. </li></ol></li><li> Une fois que le dernier lavage est terminé, remettre en suspension les billes dans 700 ul d&#39;glacé NT2 tampon suivi d&#39;un traitement avec des inhibiteurs de RNase différents pour protéger les ARNm cibles, y compris 10 pl de RNase Rupture à 40 U / ul, 10 ul de 100 mM TNT et 15 ul d&#39;EDTA (15 mM). Amener le volume à 1000 pi avec NT2 tampon. <ol class="lalpha"><li> Complexes de vanadyle ribonucléoside ne sont pas utilisés en raison de l&#39;effet inhibiteur de l&#39;EDTA. </li></ol></li></ol> 3. Immunoprécipitation et de l&#39;ARN Précipitations <ol><li> Étape facultative Préclair:<ol class="lalpha"><li> Pour réduire le fond, des perles et des anticorps de contrôle peut être utilisé pour pré-clair lysat. Cela peut réduire de signal à la sortie. </li><li> Cette étape peut être nécessaire de réduire le fond lorsque vous faites IP suivie par microarray. Il n&#39;est généralement pas nécessaire pour IP suivie par qRT-PCR. </li><li> Préclair avec 15 pg de contrôle isotypique pour 30 min / 4 ° C fin tombant sur la fin. </li><li> Ajouter 50 ul de billes PAS pré-gonflée non enrobées avec l&#39;anticorps de l&#39;étape 2.1. </li><li> Incuber 30 min / 4 ° C avec rotation sur l&#39;extrémité fin </li><li> Centrifuger à 10000 xg à 4 ° C. Conserver le surnageant pour la propriété intellectuelle. </li></ol></li><li> Ajouter 100 ul de lysat clarifié isolé (environ 2-5 mg) de mélange d&#39;anticorps préparée. <ol class="lalpha"><li> Dilution lysat aidera à réduire le fond et la liaison non spécifique. </li><li> Montant de la contribution lysat peut varier en fonction de la méthode de détection et l&#39;abondance des RBP ol&#39;efficacité de l&#39;anticorps r RBP comme indiqué dans 1.1.C. étape </li></ol></li><li> (Optionnel) Mélanger immédiatement tube en effleurant doucement plusieurs fois suivi par une brève centrifugation à 10.000 xg à 4 ° C à billes de granulés et de retirer immédiatement 100 pl de surnageant comme une représentation ARNm total des intrants pour l&#39;analyse qPCR en utilisant des techniques d&#39;isolement d&#39;ARN. <ol class="lalpha"><li> Cette étape consiste à confirmer que l&#39;entrée lysat ARN est optimale pour la propriété intellectuelle et ne doivent être effectuées que d&#39;une étape de contrôle ou comme une étape de dépannage suivant RIP avec des résultats ARN pauvres. </li></ol></li><li> Envelopper dans un tube de parafilm afin d&#39;assurer une fermeture hermétique et laisser incuber à 4 ° C pendant 2 à 4 heures, tumbling fin sur l&#39;extrémité. <ol class="lalpha"><li> Timing sur incubation doit être optimisée en fonction de l&#39;abondance cible et doit être minimisée pour éviter réarrangement complexe ou de dégradation. Pour certaines pratiques commerciales restrictives courtes incubations peuvent être plus optimale. </li></ol></li><li> Perles pellets à 5.000 XGFou 5 min à 4 ° C et conserver le surnageant pour l&#39;analyse par Western blot potentiel. Boutique aliquotes à -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Des aliquotes de surnageant avec de grandes quantités de protéine cible résiduel peut indiquer une défaillance de la protéine à être précipité par billes de sépharose. </li></ol></li><li> Comme décrit précédemment, laver perles 5 fois avec 1 ml de tampon glacé NT2 et centrifugation (5000 xg pendant 5 min à 4 ° C), puis enlever le surnageant avec pipette à la main ou un aspirateur. <ol class="lalpha"><li> Méthodes de lavage plus rigoureuses peuvent être utilisés pour réduire le fond en le complétant NT2 tampon avec le désoxycholate de sodium, l&#39;urée ou le SDS. </li><li> Conserver les échantillons sur la glace autant que possible et de travailler rapidement pour minimiser la dégradation de l&#39;ARNm cible. </li></ol></li><li> En option: Enregistrer une petite aliquote (10%) du mélange de billes ou d&#39;exécuter un échantillon supplémentaire en parallèle pour vérifier l&#39;efficacité de la protéine cible IP en utilisant une analyse par Western blot.</li></ol> 4. DNase et la protéinase K Traitements <ol><li> Après le lavage, les billes remettre les avec 100 ul de tampon NT2 supplémenté avec 5 ul de RNase-free DNase 1 (2 U / pl). </li><li> Conserver à 37 ° C pendant 5-10 min. Ajouter 1 ml de tampon NT2 et centrifuger à 5000 xg pendant 1 min à température ambiante. <ol class="lalpha"><li> Un petit (~ 10%) aliquote de billes peuvent être utilisés pour vérifier l&#39;efficacité IP par analyse SDS-PAGE. </li></ol></li><li> Resuspendre PAS concentré dans 100 ul de tampon NT2, 5 pi protéinase K (10 mg / ml), et 1 pi SDS à 10%. </li><li> Incuber le mélange remis en suspension de billes pendant 30 min à 55 ° C dans un bain d&#39;eau, doucement effleurant à toutes les 10 min. <ol class="lalpha"><li> Protéinase K facilitera la libération des composants RNP. </li></ol></li><li> Perles granulés dans 5000 xg pendant 5 min à température ambiante (RT) et recueillir le surnageant (~ 100 pi). </li><li> Ajouter 200 ul de tampon NT2 à billes, centrifuge 5000 xg pendant 2 min à température ambiante, ramasser le surnageant (~ 200 pi), et des perles de rejet. </li><li> Combinez surnageants (100 pi et 200 pi) et ajouter 300 ul couche inférieure de l&#39;acide phénol-CHCl 3. </li><li> Vortex, 1 min RT (ou 37 ° C dans un shaker) et centrifuger à 16000 xg à température ambiante pendant 1 min. </li><li> Recueillir 250 ul de la couche supérieure (NE PAS perturber l&#39;interface), ajouter 25 ul d&#39;acétate de sodium à pH 5,2, 625 ul EtOH à 100% et 5 glycoblue pi, et bien mélanger. </li><li> Rangez la nuit à -20 ° C. <ol class="lalpha"><li> Pour assurer une récupération correcte de l&#39;ARN, l&#39;addition de glycoblue va augmenter la visibilité de la culot d&#39;ARN, en agissant comme une molécule porteuse. </li></ol></li><li> Le lendemain, les tubes de mélange par inversion 3-5 fois, tournent à 12.000 xg à 4 ° C pendant 30 min et éliminer le surnageant. </li><li> Ajouter 1 ml de EtOH à 70% à la pastille bleue et mélanger par inversion ou vortex. </li><li> Centrifuger 12.000 xg à 4 ° C pendant 2 min. </li><li> Discard surnageant et centrifuger 12.000 xg pendant 1 min à 4 ° C. </li><li> Retirez tout ETOH résiduelle de 70% avec une pipette et l&#39;air sec de bouletage à TA pendant 5 min. </li><li> Remettre en suspension dans ul 20-40 du RNase / DNase eau ou un autre volume approprié selon les besoins. <ol class="lalpha"><li> L&#39;échantillon est maintenant prêt pour d&#39;autres applications en aval tels que qRT-PCR ou puces à ADN. </li><li> Spectrophotométrie Nanodrop peut être utilisée pour évaluer la concentration d&#39;échantillon, mais de précieux échantillons, il peut être avantageux d&#39;éviter échantillons nanodropping car il peut être inutile et relativement imprécis. Nous vous proposons des échantillons de normalisation à transcrits du gène d&#39;entretien ménager pour évaluer la pureté et l&#39;efficacité IP pour les échantillons précieux de rendement ou faible. </li></ol></li></ol> 5. Les résultats représentatifs Si la procédure est optimisé et réalisé correctement, l&#39;immunoprécipitation devrait donner enrichissement significatif des ARNm cibles. Typiquement, En fonction de la RBP et son ARNm cible (s), nous voyons enrichissement d&#39;environ 10 - à 50 fois lorsqu&#39;elle est évaluée par qRT-PCR. De nombreux objectifs de pratiques commerciales restrictives peuvent être découverts en masse en utilisant l&#39;analyse des microréseaux. Cependant, cette méthode est plus sensible à la dégradation par rapport à qRT-PCR. En fonction de la RBP, le nombre de cibles et de l&#39;efficacité de la réaction, puces à ADN peuvent révéler des centaines de nouvelles cibles, ou il ne peut découvrir quelques-uns, le cas échéant. Par exemple, l&#39;un des mieux caractérisés ARN protéines HuR obligatoire, post-transcriptionnel régule l&#39;expression et la traduction de nombreux gènes importants physiologiques 1, 2. L&#39;isolement du HuR-ribonucleo complexe via le protocole RIP-Chip dans les lignes cellulaires du cancer du sein, par exemple, a révélé l&#39;enrichissement de plusieurs objectifs importants Hur connus, y compris β-actine en utilisant qRT-PCR comme le montre la figure 1. Dans les deux lignées de cellules cancéreuses β-actine est enrichie 12 - à 15 fois. En règle générale, lorsqu&#39;il est effectué correctement, nous voyons une importante enrichment de β-actine dans différentes lignées cellulaires. Toutefois, si le RIP ne révèle aucun enrichissement significatif pour β-actine cela indique un problème avec le RIP et la procédure peut être répétée. Par ailleurs, l&#39;analyse des microréseaux d&#39;échantillons immunoprécipités provenant de ces lignées cellulaires ont révélé des sous-ensembles distincts d&#39;expression de cibles Hur en récepteurs aux œstrogènes différents (ER) de cellules positives MCF-7 de cancer par rapport aux ER négatives lignes du sein MB-231 de cellules cancéreuses comme le montre la figure 2 1. Ces objectifs se répartissent en plusieurs catégories: les objectifs Hur connus et inconnus qui étaient soit associés ou non associés au cancer. Par exemple, CALM2 et CD9 sont à la fois les gènes du cancer qui n&#39;ont pas été précédemment identifiées comme cibles Hur. Utilisation de la puce à ADN et en confirmant avec qRT-PCR, CALM2 et CD9 sont révélés être de 5 - à 180 fois enrichi dans le culot HuR indiquant une interaction importante entre la protéine et HuR ces gènes cibles. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpg&quot; alt = &quot;Figure 1&quot; /&gt; Figure 1. Immunoprécipitation et RIP MB-231 (ER-) et MCF-7 (ER +) des cellules cancéreuses du sein. Immunoprécipitations ont été réalisées à partir de MB-231 ou MCF-7 lysats cellulaires en utilisant anti-HuR anticorps monoclonal (3A2) et IgG1 isotype contrôle. IP A. ouest de HuR révélé bande de taille attendue détectée par 3A2. Groupe d&#39;experts sur le droit révèle quantités de HuR en entrée lysats occasion à partir de deux lignées cellulaires, avec β-tubuline comme un contrôle du chargement. B. Vérification par RT-PCR quantitative a montré quinze et onze fois enrichissements de β-actine, une cible HuR connu, dans les PI 3A2 du MB-231 et MCF-7, respectivement. Toutes les valeurs ont été normalisées à ΔΔCT GAPDH. Des expériences ont été faites en double exemplaire (n = 2). <img src="/files/ftp_upload/3851/3851fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. HuR RIP-CHIP identifie différents profils génétiques dans ER + et les cellules cancéreuses du sein ER-.Immunoprécipitations ont été réalisées à partir de Hur MB-231 ou MCF-7 lysats cellulaires en utilisant un anticorps IgG1 et HuR contrôle isotypique hybridé à Illumina tableaux Sentrix (47.000 gènes). Les signaux de commande ont été soustraites. Les résultats représentent les données cumulatives de 12 tableaux différents. Des expériences ont été réalisées en triple exemplaire (n = 3) pour chaque lignée cellulaire avec des contrôles correspondants. Les échelles sont log2.

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</ol>

Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts.

En raison de la nature de cette expérience, l&#39;optimisation et l&#39;expérience seront les seuls moyens garantis pour réussir à acquérir les résultats escomptés. Dans de nombreuses étapes de cette procédure, la température et un traitement efficace des réactifs et les produits sont d&#39;une importance capitale. Une bonne planification et l&#39;exécution de la technique aidera à assurer que l&#39;expérience a été réalisée dans un délai approprié aux températures optimales recommandées. Un problème majeur avec les expériences d&#39;isolement d&#39;ARN est la sensibilité des ARN à la dégradation par les RNases. Tous les réactifs doivent être RNase et stocké ou utilisé dans des récipients sans RNase. Il s&#39;agit d&#39;une étape essentielle pour assurer l&#39;intégrité de votre échantillon d&#39;ARNm. Même lorsque l&#39;expérience est réalisée correctement, cependant, le résultat souhaité ne peut être atteint en raison de la nature de l&#39;interaction entre le RBP et ses ARNm cibles. Un problème potentiel est faible, voire avoir aucun signal de l&#39;ARN isolé par RIP-Chip.Bien qu&#39;il y ait peut être un signal à partir d&#39;ARN total, cela peut être le résultat d&#39;une protéine de liaison insuffisante étant tiré vers le bas par les billes. La première étape de dépannage consiste à confirmer que le lysat cellulaire a utilisé l&#39;expression adéquate de la RBP spécifique. Lors de la confirmation, la protéine peut être isolée après le dernier lavage NT2 et remises en suspension dans du tampon de Laemmli ou un autre tampon approprié de dénaturation et on a chauffé à 95 ° C pendant 5 min. Analyse par Western blot peut être utilisé sur ces échantillons en coordination avec lysat d&#39;entrée ainsi que les contrôles négatifs pour assurer suffisamment de tirer vers le bas de la protéine associée. En outre, parce que la lyse de la cellule est nécessaire pour accéder à ces composants, le risque d&#39;interactions anormales ou indésirables entre les protéines normalement séparés et de l&#39;ARNm peut être mis en place. Ces interactions pourraient se lier et &quot;absorber&quot; vos ARNm cibles ou des protéines de liaison à travers des interactions non spécifiques. De plus, les protéines de ces co variantnditions peuvent se replier en de multiples variations et leurs motifs de liaison peut devenir inaccessible à leurs ARNm cibles, empêchant leurs interactions. Ces deux renforcer l&#39;importance de travailler de manière efficace ainsi que l&#39;utilisation des températures optimales énumérées à limiter ces interactions indésirables. De plus, l&#39;optimisation des conditions de lavage pour chaque protéine cible spécifique sera critique pour optimiser la pureté de l&#39;interaction. Les conditions de lavage plus strictes peuvent être nécessaires. Par exemple, le tampon de lavage peuvent être complétés avec du SDS ou d&#39;une quantité appropriée d&#39;urée pour réduire les interactions non spécifiques et de fond dans votre signal. Ce sera totalement dépendante de RBP cible de l&#39;expérimentateur, ainsi que l&#39;ARNm cible dans leurs propres conditions physiologiques. Certaines conditions ne conviennent pas à certains outils d&#39;analyse d&#39;ARNm, qui doivent être notées dans la préparation des échantillons. Enfin, bien que RIP est couronnée de succès dans l&#39;enrichissement de l&#39;ARNRBP-interactions, un problème bien connu avec RIP (CHIP) méthode est l&#39;incapacité à identifier les domaines spécifiques de liaison de la RBP sur les ARNm cibles transitoires. Plusieurs techniques de réticulation peut être utilisé, suivi par RIP pour isoler les cibles de séquence uniques, mais l&#39;utilisation des ondes courtes UV tend à conduire à des dégâts d&#39;acide nucléique. Une nouvelle méthode connue sous le nom de PAR-CLIP, ou la réticulation photoactivable ribonucléoside et immuoprecipitation, emploie longueur d&#39;onde UV pour intégrer thiouridine en ARN naissants permettant l&#39;identification des sites de liaison spécifiques d&#39;interactions ARN à la fois stables et transitoires. Dans l&#39;ensemble, RIP-Chip a été établi comme un excellent outil pour isoler et d&#39;étudier les interactions entre les protéines liant l&#39;ARN et leurs cibles ARNm par notre groupe ainsi que de nombreux autres groupes de recherche. Bien que de nature délicate et la pratique, l&#39;exécution correcte de cette procédure donnera l&#39;isolement de ces complexes RNP, qui, jusqu&#39;à récemment, ont été inaccessible de découverte et d&#39;analyse.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 1 M de dithiothréitol </td><td> Pêcheur </td><td> BP172-5 </td><td> TNT </td></tr><tr><td> DNase 1 </td><td> Ambion </td><td> 2235 </td><td> RNase </td></tr><tr><td> Acide éthylènediamine Tetraccetic </td><td> Pêcheur </td><td> BP118-500 </td><td> EDTA </td></tr><tr><td> Le glycogène </td><td> Ambion </td><td> 9516 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1 </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td><td> pH 7,0 </td></tr><tr><td> Igepal Nonidet P-40 </td><td> USB </td><td> 78641 </td><td> NP40 </td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> Pêcheur </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M de MgCl 2 </td><td> Pêcheur </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> NT2 tampon </td><td> * Voir ci-dessous </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampon de lyse polysome </td><td> * Voir ci-dessous </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Comprimés inhibiteurs de la protéase cocktail </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> Protéines Perles A Sepharose </td><td> Sigma </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> Protéinase K </td><td> Pêcheur </td><td> BP1700-100 </td><td></td></tr><tr><td> RNase Out inhibiteur de RNase </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td> 40 U / ul </td></tr><tr><td> 1 M de NaCl </td><td> Pêcheur </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Dodécyl sulfate de sodium </td><td> Pêcheur </td><td> BP166-500 </td><td> SDS </td></tr><tr><td> 1 M de Tris-HCl </td><td> Pêcheur </td><td&gt; BP153-500 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-026 </td><td></td></tr><tr><td> Complexes ribonucléoside vanadyle </td><td> Nouvelle-Angleterre Labs </td><td> S1402S </td><td> VRC </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> Préparation en vue de réactif </td></tr><tr><td> Préparer les réactifs dans RNase / DNase, traitée au DEPC verrerie </td></tr><tr><td> Tampon de lyse polysome </td></tr><tr><td> 100 mM KCl </td></tr><tr><td> MgCl2 5 mM </td></tr><tr><td> HEPES 10 mM (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 0,5% NP40 </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 100 unités / ml de RNase Out </td></tr><tr><td> 400 VRC uM </td></tr><tr><td> Tablette cocktail inhibiteur de la protéase </td></tr><tr><td> 5 ml de tampon de lyse polysome </td></tr><tr><td> Ajouter 50 ul d&#39;HEPES 1 M (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 500 pi de 1 M KCL </td></tr><tr><td> 25 pl de 1 M MgCl 2 </td></tr><tr><td> 25 ul de NP40 </td></tr><tr><td> 4,7 ml de RNase DNase H 2 O </td></tr><tr><td> 50 pl de 1 M DTT </td></tr><tr><td> 12,5 ul de 100 U / ml de RNase Out </td></tr><tr><td> 200 ul de cocktail d&#39;inhibiteurs de protéase (dissous selon le fabricant) </td></tr><tr><td> 10 pl 200 mM VRC (au moment de l&#39;utilisation) </td></tr><tr><td> NT2 tampon </td></tr><tr><td> 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) </td></tr><tr><td> NaCl 150 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 1 mM </td></tr><tr><td> 0,05% de NP40 </td></tr><tr><td> 1 L de tampon NT2 </td></tr><tr><td> 50 ml de Tris (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 30 ml de NaCl 5 M </td></tr><tr><td> 1 ml 1 M MgCl <sub&gt; 2 </td></tr><tr><td> 500 ul NP40 </td></tr><tr><td> 820 ml de RNase DNase H 2 O </td></tr></tbody></table>

méthode pour l&#39;isolement et l&#39;identification des arnm, les microarn et composants protéiques des complexes ribonucléoprotéiques partir d&#39;extraits cellulaires utilisant rip-chip

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

À la suite de la mise au point de séquençage à haut débit et l&#39;analyse par microréseau efficace, l&#39;analyse d&#39;expression génique globale est devenue une forme simple et facilement disponible de collecte de données. Dans la recherche de nombreux modèles de la maladie cependant, l&#39;état d&#39;équilibre de l&#39;ARNm du gène cible ne sont pas toujours directement en corrélation avec les taux de protéines stables de l&#39;État. Régulation post-transcriptionnelle est une explication probable de la divergence entre les deux. Poussé par la liaison de protéines liant l&#39;ARN (RBP), régulation post-transcriptionnelle affecte localisation des ARNm, la stabilité et la traduction en formant une ribonucléoprotéine (RNP) complexe avec des ARNm cibles. L&#39;identification de ces cibles inconnues de novo d&#39;ARNm à partir d&#39;extraits cellulaires dans le complexe RNP est essentielle à la compréhension des mécanismes et des fonctions de la RBP et leur effet résultant sur la production de protéines. Ce protocole décrit une méthode appelée RNP immunoprécipitation de microréseau (RIP-Chip), qui permet l&#39;identification de sARNm SPECIFIQUE associé dans le complexe de ribonucléoprotéine, sous l&#39;évolution des conditions expérimentales, avec des options pour optimiser une expérience pour le chercheur individuel. Avec cet outil expérimental important, les chercheurs peuvent étudier les mécanismes complexes associés à la régulation post-transcriptionnelle, ainsi que les interactions ribonucléoprotéiques autres.

Une étape par étape pour le protocole isolement et l&#39;identification des complexes ARN associés via RIP-Chip.

Méthode pour l&#39;isolement et l&#39;identification des ARNm, les microARN et composants protéiques des complexes ribonucléoprotéiques partir d&#39;extraits cellulaires utilisant RIP-Chip

Grâce au développement du séquençage à haut débit et de l'analyse efficace par puces à ADN, l'analyse globale de l'expression génique est devenue une méthode simple et ...

L'objectif de cette vidéo est de démontrer la méthode d'isolement et d'identification des ARN et des composants protéiques des complexes ribonucléoprotéiques à partir d'extraits cellulaires, en utilisant des méthodes d'immunoprécipitation. Bonjour, je m'appelle Garrett Dom et je suis étudiant diplômé au sein du département de biologie moléculaire, de microbiologie et d'immunologie à l'Université du Missouri, où je travaille sous la direction du Dr. Eli Sso. Grâce aux progrès réalisés dans le séquençage à haut débit et l'analyse efficace par puces à ADN, l'expression génique globale et son analyse sont devenues des formes simples et facilement accessibles de collecte de données dans de nombreux modèles de recherche et de maladies.Cependant, l'étude des niveaux d'ARNm du gène cible à l'état d'équilibre ne correspond pas toujours directement aux niveaux protéiques à l'état stationnaire. La régulation post-transcriptionnelle des gènes constitue une explication probable de la divergence entre les deux. Cette régulation est induite par les interactions des protéines liant l'ARN.La régulation post-transcriptionnelle affecte la localisation, la stabilité et la traduction des ARNm en formant un complexe ribonucléoprotéique avec les ARNm cibles. L'identification de ces nouvelles cibles d'ARNm inconnues à partir d'extraits cellulaires présents dans ce complexe est essentielle pour comprendre les mécanismes et fonctions de la protéine liant l'ARN, ainsi que leur effet résultant sur la production protéique. Ce protocole décrit une méthode appelée ribo protéine, immunoprécipitation ou RIP, qui permet d'identifier les ARNm spécifiques associés au complexe ribonucléoprotéique.Avant de commencer l'expérience, il est essentiel de disposer de tous les réactifs, récipients et ustensiles. Traitez le matériel en verre exempt d'ARNases avec un inhibiteur de RNase, tel que RNA ZAP d'Ambion, puis rincez à l'eau traitée au DPCI. Assurez-vous que tous les réactifs sont confirmés comme exempts d'ARNases. La première étape de la procédure consiste à récolter le complexe ribonucléoprotéique à partir du lysat cellulaire : récoltez des cellules tissulaires en croissance exponentielle afin d'obtenir entre deux et cinq milligrammes de protéines totales par échantillon utilisé ; généralement, deux boîtes de culture P150 suffisent.Ici, nous récoltons les lignées cellulaires humaines de cancer du sein MB 2 31 et MC seven et étudions les interactions ribonucléoprotéiques de la protéine liante de l'ARN. Il est important de noter que, pour chaque protéine liante de l'ARN étudiée, le nombre total de cellules et les quantités de protéines doivent être optimisés afin de maximiser les interactions appropriées entre l'ARNm cible et la protéine liante de l'ARN. Récupérez les cellules par centrifugation à 1000 tr/min pendant environ huit à dix minutes à quatre degrés Celsius, puis lavez-les trois fois avec du PBS glacé. Après le dernier lavage, secouez doucement le fond du tube et remettez en suspension le culot cellulaire dans des volumes égaux de tampon de lyse polysomal préparé contenant des inhibiteurs d'ARNases et de protéases.Il est recommandé de mesurer avec précision le volume exact du culot cellulaire, de mélanger délicatement à l’aide d’une pipette pour rompre les agrégats cellulaires, puis d’incuber le lysat sur de la glace pendant cinq minutes. Centrifuger à 13 000 ×g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius afin d’éliminer les débris ; transférer immédiatement le surnageant clarifié vers des tubes microcentrifugeurs RNAs Free prérefroidis, maintenir sur glace et stocker à moins 80 degrés Celsius.Ce lysat peut être conservé jusqu'à six mois à moins 80 degrés Celsius. Évitez les cycles répétés de congélation-décongélation, car cela peut entraîner une dégradation des protéines et/ou des ARNm. Il est préférable d'effectuer l'IP immédiatement.Réalisez rapidement une quantification de la concentration en protéines et du lysat à l’aide d’un dosage protéique Bradford standard. Ensuite, nous devrons préparer les matériaux nécessaires à l’isolement de notre protéine d’intérêt spécifique. Pré-enfler d’abord la protéine.Incuber des billes Sphero toute la nuit dans du tampon NT deux supplémenté avec 5 % de BSA à quatre degrés Celsius. Utiliser le tampon NT deux dans un rapport de quatre à un avec les billes PAS. Un entreposage à long terme pouvant aller jusqu'à plusieurs mois à quatre degrés Celsius est possible.Lorsqu'il est complété avec 0,1 % d'azide de sodium avant utilisation, éliminer l'excès de tampon NT deux afin que le rapport final entre les billes et le tampon soit de un pour un. À l'aide de tubes microcentrifugeurs de 1,5 millilitre sans ARN, prélever 100 microlitres de la suspension SRO et ajouter 30 microgrammes d'anticorps pour chaque réaction d'IP individuelle. Par exemple, dans notre expérience, nous utilisons un anticorps who are, qui est un anticorps IgG1 de souris.Par conséquent, notre anticorps témoin est également une IgG. Ensuite, ajoutez 100 à 200 microlitres de tampon NT2 au mélange d'anticorps et de billes. En outre, un anticorps apparié par isotype ou un sérum normal total de la même espèce doit être utilisé en parallèle comme contrôle d'anticorps contre l'ARN de fond.Ajouter l'anticorps approprié au mélange de billes et incuber toute la nuit en agitant doucement à quatre degrés Celsius. Préparer les billes recouvertes d'anticorps immédiatement avant utilisation en les lavant avec un millilitre de tampon NT2 froid à la glace, cinq fois ; laver les billes par centrifugation à 13 000 ×g pendant une à deux minutes à quatre degrés. Retirer soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette manuelle ou d’un aspirateur.Ce lavage permet d'éliminer l'anticorps non lié ainsi que les contaminants d'ARN provenant du mélange d'anticorps. Une fois le dernier lavage terminé, resuspendre les billes dans 700 microlitres de tampon T deux glacé, puis ajouter divers inhibiteurs d'ARN afin de protéger les ARNm cibles, notamment 10 microlitres d'ARN, 10 microlitres de DTT à 100 millimolaire et 15 microlitres d'EDTA. Compléter le volume à 900 microlitres avec du tampon NT deux.Ensuite, nous allons immunoprécipiter le complexe cible. Nous recommandons vivement d'utiliser une étape de pré-élimination afin de réduire le signal de fond dans votre analyse d'ARN après la procédure de RIP : effectuez la pré-élimination avec 15 microgrammes d'anticorps témoin d'isotype pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Ajoutez 50 microlitres de billes PAS préalablement gonflées, non revêtues d'anticorps.Incuber 30 minutes à quatre degrés Celsius avec rotation, puis centrifuger à 10 000 ×g à quatre degrés Celsius. Deuxième culot. Conserver le surnageant pour l'IP.Ensuite, ajoutez 100 microlitres de lysat clarifié isolé contenant environ deux à cinq milligrammes de protéine au mélange d'anticorps préparé. La dilution du lysat permet de réduire le fond parasite ; enveloppez le tube avec du parafilm pour assurer un scellement étanche et incubez à quatre degrés Celsius pendant quatre heures sous agitation rotative. Ensuite, centrifugez les billes à 5 000 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et conservez le surnageant pour une analyse éventuelle en le stockant à moins 80 degrés Celsius comme décrit précédemment. Lavez les billes cinq fois avec un millilitre de tampon T2 glacé et centrifugez.Ensuite, retirez le surnageant à l’aide d’une pipette manuelle ou d’un aspirateur. Des méthodes plus rigoureuses peuvent être utilisées afin de réduire le fond en complétant le tampon NT2 avec du désoxycholate de sodium, de l’urée ou du SDS. Conservez les échantillons sur de la glace autant que possible et travaillez rapidement pour minimiser la dégradation de l’ARNm cible.Enfin, nous utiliserons des traitements par ADN et protéinase K suivis d'une précipitation de l'ARN afin d'isoler les ARN des ribonucléoprotéines nucléaires après avoir lavé et resuspendu les billes dans 100 microlitres de tampon N NT deux supplémenté avec cinq microlitres d'ADN sans ARN un. Conserver les échantillons à 37 degrés Celsius pendant cinq à dix minutes. Ajouter un millilitre de tampon N NT deux et centrifuger à 5 000 ×g pendant cinq minutes.Jetez le SUPERNAT Reese en centrifugeant les protéines pour former un culot de SROs, puis ajoutez 100 microlitres de tampon NT2 avec 5 microlitres de protéinase K à 10 milligrammes par millilitre et 1 microlitre de SDS à 10 %. Incubez le mélange de billes remises en suspension pendant 30 minutes dans un bain-marie à 55 degrés Celsius, en agitant doucement toutes les 10 minutes. La protéinase K facilitera la libération des composants ribonucléoprotéiques. Cédez les billes par centrifugation.Ajouter 5 000 ×g pendant cinq minutes à température ambiante, puis recueillir le surnageant, dont le volume doit être d’environ 100 microlitres. Ensuite, ajouter deux billes et 200 microlitres de tampon NT2, puis centrifuger à 5 000 ×g pendant deux minutes. Recueillir environ 200 microlitres de surnageant et jeter les billes.Combiner le super natin et ajouter 300 microlitres d'acide phénol de la couche inférieure en vortexant pendant une minute à température ambiante, puis centrifuger à vitesse maximale pendant une minute à température ambiante. Récupérer 250 microlitres de la couche supérieure.Soit très prudent de ne pas perturber l'interface, car cela entraînerait une contamination. Ajouter à l'échantillon d'ARN 25 microlitres d'acétate de sodium à un pH de 5,2, 625 microlitres d'éthanol glacé à 100 % et cinq microlitres de glyco bleu ; bien mélanger. Conserver toute la nuit à moins 20 degrés Celsius.En outre, afin d'assurer une récupération adéquate de l'ARN. L'ajout de glyco bleu augmentera la visibilité du culot d'ARN en agissant comme une molécule porteuse le jour suivant, mélanger les tubes par retournement trois à cinq fois, puis centrifuger à 12 000 G à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes et éliminer le surnageant. Ajouter un millilitre d'éthanol glacé à 70 % au culot bleu et mélanger par inversion ou vortexage, puis centrifuger.Échantillon à 12 000 G à quatre degrés Celsius pendant deux minutes. Jeter le surnageant et centrifuger à 12 000 G pendant une minute à quatre degrés Celsius. Éliminer tout éthanol résiduel à 70 % à l’aide d’une pipette et sécher le culot à l’air. Ajouter la température ambiante pendant cinq minutes. Rediluer dans 20 à 40 microlitres d’eau exempte d’ARN et d’ADN. L’échantillon est désormais prêt à être quantifié par spectrométrie NanoDrop, ainsi que pour des applications ultérieures telles que la PCR quantitative en temps réel ou l’analyse par puces à ADN après isolement des ARN. Les puces à ADN et la PCR quantitative en temps réel ont été réalisées afin de révéler les cibles d’ARNm de la protéine liant l’ARN, ainsi que leur enrichissement résultant de l’immunoprécipitation.La confirmation par immunotransfert révèle une isolation propre de la protéine cible. La PCR quantitative démontre l'enrichissement relatif de la cible d'ARNm, l'actine bêta, par rapport aux témoins IgG. Alors que l'analyse par puces à ADN révèle des profils génétiques distincts entre les lignées cellulaires de cancer du sein MC7 et MB231, l'immunoprécipitation de ribonucléoprotéines s'est imposée comme un excellent outil permettant d'isoler et d'étudier les interactions entre les protéines liant l'ARN et leurs cibles ARN, outil utilisé par notre équipe ainsi que par de nombreux autres groupes de recherche. Bien que cette méthode soit sensible par nature et dans sa mise en œuvre, une exécution correcte de ce protocole permettra d'isoler ces complexes de ribonucléoprotéines, auparavant inaccessibles à la découverte et à l'analyse.

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