Isolement de la chromatine par purification d'ARN (CHIRP)

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer les régions d'ADN associées à un ARN non codant spécifique à l'aide de QPCR ou de séquençage à haut débit. Cela est réalisé en réticulant les cellules afin de piéger les interactions ADN-ARN natives in vivo. Dans une deuxième étape, les cellules sont lysées puis soumises à de la sonication pour solubiliser le lysat cellulaire et fragmenter la chromatine en petits morceaux.

Ensuite, des oligonucléotides antisens biotinylés sont ajoutés au lysat cellulaire afin d'enrichir spécifiquement les complexes R-N-A-D-N-A d'intérêt, permettant d'obtenir des résultats qui précisent l'identité des sites génomiques liés aux ARN non codants, selon des analyses par QPCR ou par séquençage à haut débit. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'hybridation in situ R-N-A-D-N-A (R-N-A-D-N-A FISH) est que chirp permet d'obtenir des cartes génomiques complètes des sites de fixation des ARN non codants avec une résolution proche du niveau de la paire de bases. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine des ARN non codants, telles que la manière dont les roX, ARN et les mouches mâles assurent la compensation de dose.

Les implications de cette technique vont jusqu'aux thérapies des maladies liées aux ARN non codants, car elle permet de mieux comprendre comment les ARN non codants régulent les états de la chromatine et l'expression des gènes. Pour cette expérience d'isolement de chromatine par purification d'ARN, ou ChIRP, 40 millions de cellules seront récoltées après centrifugation, le PBS sera décanté et le liquide résiduel sera éliminé en aspirant soigneusement selon un angle, puis le culot cellulaire sera décollé en tapotant le fond du tube Falcon. Ajouter du glutaraldéhyde 1 % fraîchement préparé, en commençant par un petit volume, resuspendre le culot cellulaire, compléter jusqu'au volume final, puis retourner le tube pour mélanger et laisser réticuler pendant 10 minutes à température ambiante sur un agitateur horizontal ou rotatif. Arrêter la réaction de réticulation en ajoutant un dixième du volume de glycine 1,25 M, puis laisser sur l'agitateur à température ambiante pendant cinq minutes ; les cellules prendront alors une couleur orange vif.

Ensuite, centrifuger à 2000 RCF pendant cinq minutes, décantez et aspirez le surnageant, puis lavez le culot avec 20 millilitres de PBS glacé, centrifugez à nouveau, aspirez le surnageant et remettez en suspension le culot réticulé dans du PBS glacé. Transférez chaque millilitre de cellules dans un tube Eppendorf et centrifugez à 2000 RCF pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, utilisez une pipette pour retirer soigneusement autant de PBS que possible.

Flash, congeler rapidement toutes les pastilles cellulaires dans de l'azote liquide et conserver indéfiniment à moins 80 degrés Celsius. Pour préparer le lysat cellulaire destiné à la technique chirp, décongeler les pastilles cellulaires congelées réticulées à température ambiante. Secouer énergiquement pour détacher et mélanger la pastille cellulaire.

Faire centrifuger les culots et utiliser une pointe de pipette de 10 microlitres pointue pour éliminer tout reste de PBS sur une balance électronique précise au milligramme près. Peser la masse d'un tube Eppendorf vide. Peser chaque culot et noter son poids.

Ajouter un volume égal à 10 fois celui du tampon de lyse, supplémenté avec l'inhibiteur de protéase fraîchement ajouté PMSF et du super ace, dans chaque tube et resuspendre le culot. Le lysat cellulaire doit être agité immédiatement après sa préparation. Transférer au maximum 1,5 millilitre de lysat dans chaque tube conique de 15 millilitres et insérer les sondes de sonication en les vissant fermement.

Placez ensuite les tubes dans un bio-rupteur et soniquez à quatre degrés Celsius au réglage maximal avec des impulsions de 30 secondes allumées et 45 secondes éteintes. Vérifiez le lysat toutes les 30 minutes. Poursuivez la sonication jusqu'à ce que le lysat cellulaire ne soit plus trouble.

Cela peut prendre de 30 minutes à quatre heures selon le nombre de tubes, le volume d'échantillon, la température du bain et la durée de la sonication. Lorsque le lysat devient limpide, transférez cinq microlitres dans un nouveau tube einor. Ajoutez le tampon DNA protéase K et la protéase K, vortexez pour homogénéiser, puis centrifugez brièvement. Incubez pendant 45 minutes à 50 degrés Celsius après avoir extrait l'ADN à l'aide d'un kit de purification PCR.

Vérifiez la taille de l'ADN sur un gel d'agarose à 1 %. La majorité du smearing d'ADN doit se situer entre 100 et 500 paires de bases, ce qui indique une sonication complète. Centrifugez des aliquots d'un millilitre des échantillons soniqués à 16 100 RCF pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, transférez le surnageant dans de nouveaux tubes Eppendorf et congélez rapidement à l'azote liquide pour commencer la procédure de décongélation CHIRP. Faites décongeler les tubes de chromatine à température ambiante pour un échantillon CHIRP typique.

À l'aide d'un millilitre de lyzat, prélevez 10 microlitres pour l'entrée en ARN et 10 microlitres pour l'entrée en ADN, puis placez-les dans des tubes einor. Conservez-les sur glace jusqu'à nouvel ordre. Transférez un millilitre de chaque échantillon de chromatine dans un tube falcon de 15 millilitres.

Ajoutez deux millilitres de tampon d'hybridation dans chaque tube. Ensuite, décongelez les sondes à température ambiante. Ces oligonucléotides biotinylés en mosaïque sont étiquetés selon leur position le long de l'ARN et répartis en deux pools.

Le pool pair contient toutes les sondes portant un numéro pair. Et le pool impair contient les sondes portant un numéro impair. Toutes les expériences sont réalisées en utilisant les deux pools, qui servent de contrôles internes l'un par rapport à l'autre.

L'un des aspects les plus difficiles du protocole véritable est que toutes les étapes d'hybridation et de lavage doivent être effectuées à 37 degrés. Pour garantir une température expérimentale constante, réalisez toutes les étapes dans ou près d'un four d'hybridation. Ajoutez le volume approprié de sondes à des tubes spécifiques. Mélangez soigneusement et incubez à 37 degrés pendant quatre heures avec agitation ; commencez l'agitation 20 minutes avant la fin de l'hybridation.

Préparez les billes magnétiques C une. Utilisez 100 microlitres par 100 pico-moles de sondes. Lavez avec un millilitre de tampon de lyse non supplémenté trois fois en utilisant l'aimant Dyna mag deux bandes pour séparer les billes du tampon.

Après le dernier lavage, resuspendre les billes dans le volume initial de tampon de lyse et compléter avec du PMSF frais et un inhibiteur de protéase. Une fois la réaction d'hybridation de quatre heures terminée, ajouter 100 microlitres de billes à chaque tube et mélanger. Incuber correctement à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avec agitation, puis laver les billes avec un millilitre de tampon de lavage préchauffé à 37 degrés Celsius lors du premier lavage.

Utilisez une bande magnétique Dyna Mag 15 pour séparer les billes, décantez et resuspendez dans un millilitre de tampon de lavage, puis transférez dans un tube EOR de 1,5 millilitre. Incubez à 37 degrés Celsius sous agitation pendant cinq minutes lors des lavages suivants, centrifugez chaque tube dans une mini-centrifugeuse et placez l'échantillon sur une bande magnétique Dyna Mag 2 pendant une minute avant de décantez l'échantillon. Essuyez toute goutte avec un essuie-tout Kim et resuspendez dans un millilitre.

Laver avec le tampon, incuber à 37 degrés Celsius sous agitation pendant cinq minutes. Répéter jusqu'à un total de cinq lavages ; au dernier lavage, resuspendre. Bien resuspendre les billes, prélever 100 microlitres et les mettre de côté pour l'isolement de l'ARN, puis réserver 900 microlitres pour la fraction d'ADN.

Placer tous les tubes sur la bande magnétique pour tubes Dyna Mag et éliminer le tampon de lavage. Après une brève centrifugation, replacer le tube sur la bande magnétique à l’aide d’une micropipette de 10 microlitres à embout fin. Éliminer complètement le tampon de lavage résiduel de chaque tube.

Les fractions d'ARN et d'ADN sont ensuite isolées à partir des échantillons ChIRP pour la quantification et le séquençage. Cette figure montre l'enrichissement de la télomérase humaine, de l'ARN ou de Turk provenant de cellules HELOC par rapport à GA dh. Un ARN cellulaire abondant servant de contrôle négatif.

La majorité de l'ARN Turk présent dans la cellule, environ 88 %, a été récupérée par une technique de chirp, tandis que seulement 0,46 % de l'ARN GA DH a été obtenu, démontrant un facteur d'enrichissement d'environ 200 fois. Des sondes non spécifiques, telles que des sondes ciblant l'ARN LAC Z, qui n'est généralement pas exprimé dans les cellules de mammifères, peuvent être utilisées comme contrôles négatifs supplémentaires. Régions d'ADN censées se lier à l'objectif. Les ARN longs non codants sont généralement enrichis par rapport aux régions négatives lorsqu'ils sont mesurés par QPCR.

Cette figure montre la validation par PCR quantitative de quatre sites liés à Hotair dans des fibroblastes primaires de prépuce humain, déterminée par l'exécution de la chirp SSE dans la même lignée cellulaire, tandis que les sites d'ADN Turk et GA DH servent de régions de contrôle négatif. Les deux jeux de sondes, pairs et impairs, ont produit un enrichissement comparable des sites liés à Hotair attendus par rapport aux régions négatives. Un critère caractéristique des véritables sites de fixation d'ARN non codants longs.

Une carte globale des sites de fixation des ARN non codants longs peut être obtenue par séquençage à haut débit de l'ADN enrichi par CHIRP, comme illustré par ces données provenant de l'ARN non codant long *trla* Rocks two, qui est connu pour interagir avec le chromosome X d'une manière nécessaire à la compensation de dose. Les échantillons pairs et impairs ont été séquencés séparément, et leurs bruits uniques ont été éliminés afin de produire une piste de signaux superposés, chaque pic indiquant un site fort de fixation de Rocks two. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important d'appliquer scrupuleusement une technique exempte d'ARNases.

D'autres méthodes, comme le transfert de protéines, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que quelles protéines interagissent avec l'ARN non codant d'intérêt après son développement. CHI a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie de l'ARN pour cartographier l'activité de l'ARN dans des cellules en culture et dans des tissus fixés.