Hydrophobe sel modifié Nafion pour l'immobilisation d'enzymes et de stabilisation

L'objectif général de cette procédure est de synthétiser un polymère mycélien de stabilisation et d'immobilisation enzymatique. Pour y parvenir, mélangez d'abord la suspension néon avec le sel de bromure d'ammonium chélaté, puis vortexez le mélange afin de remplacer la forme protéinée du nafion par des sels d'ammonium. La deuxième étape consiste à sécher le polymère obtenu en versant le mélange dans un bac en téflon et en laissant évaporer les solvants.

Ensuite, faire tremper le polymère dans de l'eau déionisée pendant 12 à 24 heures afin d'éliminer le sel en excès. Après l'extraction du sel, rincer le polymère à l'eau, puis laisser sécher complètement le polymère par évaporation. La dernière étape consiste à transférer le polymère dans un flacon propre et à le resuspendre dans un solvant pour son utilisation dans l'immobilisation enzymatique. En fin de compte, ce polymère pour l'immobilisation enzymatique est utilisé afin d'améliorer la stabilité des enzymes lors des dosages d'activité.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car bien que la procédure paraisse extrêmement simple, l'étape de séchage est cruciale pour la fabrication d'un polymère fonctionnel. La démonstration de la procédure sera réalisée par shu, une étudiante diplômée de mon laboratoire, afin d'initier la modification du nafion par des sels d'ammonium de Nerium. Mesurer un excès molaire triple par rapport aux groupes acides sulfoniques présents sur le polymère de nafion, à l'aide du sel de bromure d'alkylammonium.

Transférez le sel de bromure d'ammonium alkylique dans un flacon en verre de manière énergique. Secouez un flacon contenant une suspension de nafion à 5 % poids par volume pendant environ 30 secondes afin de garantir une suspension uniforme du nafion en solution. Prélevez deux millilitres de la suspension de nafion ainsi remise en suspension à l’aide d’une pipette et ajoutez-les au flacon en verre contenant le sel de bromure d'ammonium AGU.

Vortexez le flacon à 900 tr/min pendant 10 à 15 minutes. Ensuite, versez la solution visqueuse dans un plateau de pesée en plastique et utilisez une pipette pour transférer toute solution résiduelle du flacon vers le plateau de pesée. Dans cet exemple, le plateau est partiellement recouvert et laissé sur le banc de laboratoire afin que les solvants s'évaporent complètement du plateau à un taux d'évaporation qui prend plus de six heures.

Une évaporation complète de tout le solvant à une vitesse d'évaporation appropriée doit laisser un film transparent jaune ou brun au fond du plateau de pesée, comme illustré ici. Si le solvant s'évapore trop rapidement, un matériau croûteux ou cristallin se formera au lieu d'un film transparent, ce qui indique que la structure micellaire du polymère a été détruite. Si l'évaporation du solvant est trop lente ou si le sel d'ammonium réagit trop longtemps en absorbant trop de vapeur d'eau, un gel orangé collant ou un matériau cristallin blanc se formera.

Dans les deux cas, la procédure doit être recommencée. Une fois que tout le solvant s'est évaporé au taux d'évaporation approprié, remplir le plateau de pesée avec 10 à 20 millilitres d'eau désionisée de 18 mégohm·cm, couvrir et laisser tremper pendant 12 à 24 heures afin d'éliminer les sels excédentaires de bromure d'alkylammonium et de HBr. Douze à vingt-quatre heures plus tard, pipeter l'eau et ajouter suffisamment d'eau désionisée pour remplir le plateau. Veiller toujours à pipeter en s'éloignant du film polymère afin d'éviter d'en perdre une partie.

Rincer un total de trois fois après les rinçages. Laisser le plateau de pesée à découvert jusqu'à ce que le polymère soit complètement sec. Une fois parfaitement sec, le polymère doit former un film plastique transparent et légèrement fragile.

En revanche, les polymères qui n'ont pas été correctement séchés présenteront une apparence très différente après l'extraction du sel, comme illustré ici. À l'aide d'une spatule, retirez soigneusement le film séché du plateau de pesée et transférez-le dans un flacon en verre propre. Ajoutez deux millilitres d'éthanol et trois billes en céramique pour mélange, puis vortexez pendant quatre heures ou jusqu'à ce que le film polymère soit complètement resuspendu.

La solution de nathe modifiée par l'ammonium alcalin est désormais prête à être utilisée pour l'immobilisation de l'enzyme. Si l'enzyme à immobiliser est une enzyme sèche, peser un milligramme de l'enzyme dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et ajouter un millilitre d'une solution tampon phosphate à cent millimolaire, pH 7, afin d'obtenir une solution d'enzyme à un milligramme par millilitre. Transférer 120 microlitres de la solution d'enzyme à un milligramme par millilitre dans un nouveau tube.

Ajouter 60 microlitres de la solution d'ammonium ALK modifiée au nafion et vortexer pendant 10 secondes. Le rapport entre l'enzyme et la solution polymère doit être maintenu à deux pour un, si ce mélange doit être augmenté pour un grand nombre de réplicats. Enfin, pipeter 60 microlitres de la solution enzyme-polymère au fond de chacune des trois cuvettes séparées d'un centimètre carré et laisser sécher toute la nuit.

La stabilité de l'enzyme au sein du film polymère peut ensuite être évaluée par des dosages d'activité enzymatique, comme illustré. Pour commencer ce dosage, ajoutez les réactifs suivants dans le tube en verre revêtu avec le polymère nafion modifié et l'enzyme déshydrogénase dépendante du NAD : 1,3 millilitre de pyrophosphate de sodium à 50 millimolaire, 1,5 millilitre de nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) fraîchement préparé à 15 millimolaire et 0,1 millilitre d'eau.

Placer la cuvette dans un spectrophotomètre UV-visible réglé sur une longueur d'onde de 340 nanomètres. Ajouter 0,1 millilitre d'éthanol dans la cuvette et mélanger les réactifs en pipetant doucement la solution cinq fois vers le haut et vers le bas ; pour le témoin, utiliser 0,1 millilitre d'eau supplémentaire au lieu de 0,1 millilitre d'éthanol. Cinq minutes après l'ajout des réactifs à la cuvette, enregistrer l'absorbance à 340 nanomètres.

Enregistrez à nouveau l'absorbance 20 minutes après l'ajout des réactifs au qve ; ces deux points de données seront tracés afin d'obtenir une pente pouvant être utilisée pour les calculs d'activité afin de mesurer l'activité spécifique enzymatique du pq immobilisé. Pipetez ces réactifs dans le qve copolymerisé avec le polymère nafion modifié et la déshydrogénase dépendante du PQQ. 1,5 millilitre de phosphate de sodium et 200 microlitres de sulfate de méthyle de pH à 600 micromolaire ou PMS.

Placez le vete dans un spectrophotomètre UV-visible réglé sur une longueur d'onde de 600 nanomètres et faites le zéro. Ajoutez 100 microlitres d'un mélange composé de 700 microlitres de chloroéthanol ou de DCIP et de 200 microlitres du substrat d'intérêt. Mélangez les réactifs en aspirant et en expulsant la solution doucement cinq fois à l'aide d'une pipette pour obtenir un blanc.

Utilisez 200 microlitres d'eau au lieu du substrat d'intérêt. Cinq minutes après l'ajout des réactifs, enregistrez l'absorbance à 600 nanomètres.

Enregistrer à nouveau l'absorbance 20 minutes après l'ajout des réactifs pour commencer ce dosage. Ajouter à la Q VET co-élaborée avec le polymère de nafion modifié et la glucose oxydase. Deux millilitres d'une solution contenant les composants suivants : 0,2 molaire d'acide para-hydroxybenzoïque, 0,02 % d'azoture de sodium, 128 unités de peroxydase, 0,3 millimolaire de 4-aminoantipyrine, un molaire de phosphate de potassium et 50 millimolaires de glucose.

Préparez la solution en pipetant cinq fois vers le haut et vers le bas. Placez le Q vet dans un spectrophotomètre UV-visible réglé sur une longueur d'onde de 510 nanomètres. Cinq minutes après l'ajout des réactifs au qve.

Enregistrez l'absorbance à 510 nanomètres. Ensuite, enregistrez à nouveau l'absorbance 20 minutes après l'ajout des réactifs. Ce tableau présente les résultats de dosage de l'activité de la glucose déshydrogénase dépendante du NAD, immobilisée et sélectionnée sur des polymères de nafion modifiés.

Il a été observé que la glucose déshydrogénase dépendante du NAD, immobilisée, présentait une activité spécifique inférieure à celle de l'enzyme en solution tamponnée. Cela s'explique par le fait que les membranes polymériques réduisent le transport des molécules de grande taille ; bien que le glucose, substrat de ce dosage, soit de petite taille, le coenzyme NAD doit diffuser à l'intérieur et à l'extérieur de la membrane. Pour la déshydrogénase dépendante du NAD, la limitation du transport due à l'immobilisation dans le polymère diminue l'activité enzymatique observée.

Le tableau suivant présente les résultats d'essais d'activité de la glucose déshydrogénase dépendante du PQQ immobilisée sur divers polymères de nafion modifiés. Il est important de noter ici l'activité plus élevée des enzymes immobilisées sur la plupart des films de nafion par rapport aux enzymes en solution tampon. Étant donné que la glucose déshydrogénase dépendante du PQQ est une protéine associée à la membrane, le nafion modifié hydrophobe fournit un environnement plus proche de celui d'une membrane que le tampon, ce qui stabilise la glucose déshydrogénase dépendante du PQQ sous sa forme active et améliore ainsi l'activité enzymatique.

Enfin, les résultats représentatifs de l'activité spécifique de la glucose oxydase. Les polymères de nafion modifiés immobilisés et sélectionnés sont présentés dans ce tableau. Les dosages enzymatiques pour chacun des polymères avec chacune des trois enzymes montrent que les tendances de l'activité spécifique relative par rapport à l'enzyme en solution dépendent du système enzymatique.

Par conséquent, le polymère exact nécessaire à chaque enzyme doit être optimisé. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que l'étape de séchage est critique pour cette procédure particulière.