Name: Hydrophobe sel modifié Nafion pour limmobilisation denzymes et de stabilisation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Découvrez la synthèse d'un polymère Nafion modifié hydrophobe pour l'immobilisation et la stabilisation d'enzymes. Cette méthode améliore la stabilité enzymatique lors des dosages d'activité.

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Les auteurs tiennent à remercier l&#39;Office of Naval Research, United Soybean Board, et la National Science Foundation pour le financement.

1. Modification de Nafion avec sels d&#39;ammonium quaternaire <ol><li> Agiter une bouteille de suspension Nafion 5% p / v vigoureusement pendant environ. 30 secondes pour s&#39;assurer que le Nafion est suspendu de manière uniforme dans la solution. </li><li> Introduire à la pipette sur 2 mL de la Nafion désormais remis en suspension dans un flacon en verre (volume du flacon peut contenir de 2,5 ml à 10 ml). </li><li> Mesurer un excès de 3 fois molaire (par rapport à des groupes acide sulfonique sur le polymère Nafion) du sel de bromure d&#39;ammonium alkyle (masses appropriées sont indiquées dans le tableau 1) et l&#39;ajouter à la fiole contenant le 2 mL de Nafion. </li><li> Vortex du flacon à 1500 rpm pendant 10-15 minutes. </li><li> Verser la solution visqueuse dans un bac en plastique de pesage qui mesure environ. 3 x 3 po, et d&#39;utiliser une pipette pour transférer toute solution résiduelle de la fiole sur le plateau de pesée. </li><li> Permettre aux solvants pour évaporer du bateau poids, en laissant un jaune / brun, un film transparent sur ​​le fond du plateau de pesage (Figure 2). Le taux d&#39;évaporation des solvants devrait être telle qu&#39;elle prend plus de 6 heures pour tout le solvant s&#39;évapore. Si le solvant s&#39;évapore trop vite, un matériau blanc croustillant formeront, au lieu d&#39;un film transparent qui indique que la structure micellaire du polymère a été détruit, et vous devez redémarrer la procédure. Si l&#39;évaporation du solvant est trop lent, un déshumidificateur peut être nécessaire, parce que trop lente de l&#39;évaporation conduit généralement à un collant, un gel orange et vous devez redémarrer la procédure. Plages de température typiques pour l&#39;évaporation du solvant sont de 20 à 37 ° C. Les conditions réelles pour le séchage sont fonction de l&#39;humidité relative et la température dans la chambre, mais il est important que le séchage est lent pour maintenir la structure des micelles, mais pas trop lent pour permettre la formation de gel. </li><li> Remplissez la pesée bateau avec 18M Qcm de l&#39;eau déminéralisée (10-20 ml d&#39;eau), la couverture, et laisser tremper pendant 12-24 heures pour éliminer l&#39;excès de sels d&#39;alkyl ammonium bromure et HBr. </li><li&gt; Versez (ou une pipette) à l&#39;eau et rincer 3 fois avec DI assez d&#39;eau pour remplir le bac à chaque fois. Veillez à ne pas perdre de la pellicule de polymère au cours de cette étape. </li><li> Laissez le plateau de pesée de s&#39;asseoir à découvert jusqu&#39;à ce que le polymère est complètement sec À ce stade, le polymère doit être un film clair et un peu cassant en plastique. Encore une fois, si l&#39;air est très humide, un déshumidificateur peut être nécessaire pour compléter l&#39;évaporation dans les meilleurs délais. </li><li> Avec une spatule, retirez délicatement le film séché à partir du bac de pesage et de le transférer dans un flacon en verre propre. </li><li> Ajouter 2 ml d&#39;éthanol et 3 perles en céramique de mélange, et le vortex pendant 4 heures ou jusqu&#39;à ce que le film de polymère est complètement remis en suspension. </li></ol> 2. Immobilisation d&#39;enzymes dans TBAB-mise à jour pour le Nafion tests d&#39;activité <ol><li> Pour une enzyme sec, peser 1-10 mg de l&#39;enzyme dans un microtube de 1,5 mL, et ajouter 1 mL de 100 mM de tampon phosphate pH 7 pour créer un 1-10 mg / ml solution enzymatique. For une enzyme qui est en solution, utiliser un acide bicinchoninique (BCA) test 13 pour déterminer la quantité de protéines, et ajouter une quantité appropriée de tampon phosphate 100 mM pour amener la concentration de protéines à 1-10 mg / ml. 1-10 ml mg / correspond typiquement à 1-50 nanomoles / mL. </li><li> À 120 pi de 1 mg / ml solution enzymatique, ajouter 60 ul de la solution de Nafion d&#39;ammonium modifié alkyle, et vortex pendant 10 secondes. (Ce mélange peut être étendu à un grand nombre de répétitions. Garder le rapport solution enzymatique à polymère à 2:1.) </li><li> Introduire à la pipette 60 pi de la solution enzymatique / polymère dans le bas de 3 séparées de 1 cm 2 cuves, et laisser sécher pendant la nuit. </li></ol> 3. Le dosage de l&#39;enzyme immobilisée déshydrogénase NAD-dépendante <ol><li> Pour la cuvette, ajoutez 1,3 ml de 50 mM de pyrophosphate de sodium (pH 8,8), 1,5 ml de 15 mM NAD (fraîchement préparée), et 0,1 mL d&#39;eau. </li><li> Placer la cuvette dans un spectrophotomètre UV / VIS (c.-à-Evolut ThermoScientificion 260 Bio et Thermo Spectronic Genesys 20) fixée à une longueur d&#39;onde de 340 nm. </li><li> Zéro du spectromètre, puis ajouter 0,1 ml d&#39;éthanol. Mélanger les réactifs par pipetage doucement la solution de haut en bas 5 fois. Pour un blanc, utiliser 0,1 ml d&#39;eau supplémentaire au lieu de la 0,1 mL d&#39;éthanol. </li><li> Enregistrez l&#39;absorbance à 340 nm à 5 minutes après les réactifs ont été ajoutés à la cuvette et 20 minutes après. Tracer les deux points de données pour obtenir une pente qui peut être utilisé pour le calcul d&#39;activité. </li></ol> 4. Dosage de la immobilisées PQQ-dépendants déshydrogénases <ol><li> Pour la cuvette, ajoutez 1,5 ml de phosphate de sodium (pH 7,3) et 200 ul de 600 uM PMS. </li><li> Placer la cuvette dans un spectrophotomètre UV / Vis réglé à une longueur d&#39;onde de 600 nm, puis zéro le spectromètre. </li><li> Ajouter 100 ul de 700 DCIP ul et 200 ul du substrat d&#39;intérêt (l&#39;éthanol, l&#39;acétaldéhyde, le glycérol, le glucose, ou de glycéraldéhyde), et mélanger les réactifs par un léger pipetage la solutions de haut en bas 5 fois. Pour un blanc, utiliser 200 pi d&#39;eau au lieu du substrat d&#39;intérêt. </li><li> Enregistrez l&#39;absorbance à 600 nm à 5 minutes après les réactifs ont été ajoutés à la cuvette et 20 minutes après. </li></ol> 5. Dosage de la glucose-oxydase immobilisée <ol><li> Ensemble de la cuvette, ajouter 2,0 ml d&#39;une solution contenant 0,2 M d&#39;acide p-hydroxybenzoïque, l&#39;azoture de sodium 0,02% (p / v), la peroxydase 128 U, 0,3 mM de 4-aminoantipyrine, une M de phosphate de potassium, et 50 mM de glucose. Mélanger la solution par aspiration et refoulement 5 fois. </li><li> Placer la cuvette dans un ensemble spectrophotomètre UV / Vis à une longueur d&#39;onde de 510 nm. </li><li> Enregistrez l&#39;absorbance à 510 nm à 5 minutes après les réactifs ont été ajoutés à la cuvette et encore moins 20 minutes après. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs La structure micellaire du polymère Nafion modifié peut être perturbé par le séchage du sel d&#39;origine / polymère co-moulé film trop fast. La figure 2 montre un mélange sel / polymère qui a été séché correctement résultant d&#39;une manière transparente, brun léger film. Un film qui sèche trop rapide peut entraîner opaques, de flocons de polymère blanc en raison du fait que le processus de séchage peut détruire la structure micellaire. Une fois que le Nafion polymère modifié et de l&#39;enzyme ont été mélangés et co-coulée sur le fond d&#39;une cuvette, les dosages d&#39;activité enzymatique peut être utilisé pour évaluer la stabilité de l&#39;enzyme dans le film polymère. Tableaux 2-4 montrent les résultats d&#39;analyse de deux enzymes déshydrogénases et la glucose oxydase immobilisée dans divers films de Nafion modifiés, respectivement. Notez la plus grande activité des enzymes qui sont immobilisées vs les enzymes en solution tampon, montrant que les polymères Nafion modifiés peuvent en fait accroître l&#39;activité de certaines enzymes (appelé suractivité). D&#39;autres enzymes ont des limitations de transport qui réduisent leur activité spécifique lorsque les immobiliser dans le polymère (cellulases et amylases, c.-à-dont les substrats sont assez grandes macromolécules). <table border="1"><tbody><tr><td> Sel d&#39;ammonium quaternaire utilisé </td><td> 3 fois plus </td></tr><tr><td> T3A (bromure de tétrapropylammonium) </td><td> 32,37 mg / ml </td></tr><tr><td> TBAB (bromure de tétrabutylammonium) </td><td> 39,19 mg / ml </td></tr><tr><td> TPAB (bromure de tétrapentylammonium) </td><td> 46,01 mg / ml </td></tr><tr><td> TEHA (bromure de triethylhexylammonium) </td><td> 32,37 mg / ml </td></tr><tr><td> TMHA (bromure de trimethylhexylammonium) </td><td> 27,25 mg / ml </td></tr><tr><td> TMOA (bromure de trimethyloctylammonium) </td><td> 30,66 mg / ml </td></tr><tr><td> TMDA (bromure de trimethyldecylammonium) </td><td> 34,07 mg / ml </td></tr><tr><td> TMDDA (bromure de trimethyldodecylammonium) </td><td> 37,48 mg / ml </td></tr><tr><td> TMTDA (bromure de trimethyltetradecylammonium) </td><td&gt; 40,89 mg / ml </td></tr><tr><td> TMHDA (bromure de triméthylhexadécylammonium) </td><td> 44,31 mg / ml </td></tr><tr><td> TMODA (bromure de trimethyloctadecylammonium) </td><td> 47,71 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Montants de sels d&#39;ammonium tétra-alkyle à utiliser pour le Nafion modification de polymères. <table border="1"><tbody><tr><td> Type de Nafion </td><td> L&#39;activité enzymatique (U / g) </td></tr><tr><td> Tampon (aucun polymère) </td><td> 16,63 ± 8,11 </td></tr><tr><td> Nafion (un-mod.) </td><td> 9,25 ± 2,21 </td></tr><tr><td> TMTDA </td><td> 3,23 ± 2,92 </td></tr><tr><td> TBAB </td><td> 3,93 ± 3,33 </td></tr><tr><td> TMDDA </td><td> 4,19 ± 1,04 </td></tr><tr><td> TMOA </td><td> 3,51 ± 1,11 </td></tr><tr><td> TMDA </td><td> 8,00 ± 4,53 </td></tr><tr><td> TMHA </td><td> 1,68 ± 1,39 </td></tr><tr><td> TMHDA </td><td> 4,83 ± 0,99 </td></tr><tr><td> TMODA </td><td> 10,45 ± 3,20 </td></tr></tbody></table> Tableau 2 NAD-dépendante activité glucose déshydrogénase immobilisée dans sélectionnés polymères modifiés Nafion billet: activité immobilisée est une fonction de l&#39;activité initiale spécifique de l&#39;enzyme).. <table border="1"><tbody><tr><td> Type de Nafion </td><td> L&#39;activité enzymatique (mU / g) </td></tr><tr><td> Tampon (aucun polymère) </td><td> 7,18 ± 0,51 </td></tr><tr><td> Nafion (un-mod.) </td><td> 70,1 ± 0,5 </td></tr><tr><td> TMTDA </td><td> 133 ± 6 </td></tr><tr><td> TBAB </td><td> 244 ± 4 </td></tr><tr><td> TMDDA </td><td> 221 ± 6 </td></tr><tr><td> TMOA </td><td> 1,78 ± 0,63 </td></tr><tr><td> TMDA </td><td> 206 ±5 </td></tr><tr><td> TEHA </td><td> 40,1 ± 50,6 </td></tr><tr><td> TMHDA </td><td> 0 </td></tr><tr><td> TMODA </td><td> 1,45 ± 0,06 </td></tr></tbody></table> Tableau 3 PQQ-dépendante activité glucose déshydrogénase immobilisée dans sélectionnés polymères modifiés Nafion billet: activité immobilisée est une fonction de l&#39;activité initiale spécifique de l&#39;enzyme).. <table border="1"><tbody><tr><td> Type de Nafion </td><td> L&#39;activité enzymatique (U / g) </td></tr><tr><td> Tampon (aucun polymère) </td><td> 103,61 ± 3,15 </td></tr><tr><td> Nafion (un-mod.) </td><td> 19,93 ± 10,10 </td></tr><tr><td> TMTDA </td><td> 247,25 ± 12,49 </td></tr><tr><td> TBAB </td><td> 152,27 ± 5,29 </td></tr><tr><td> TMDDA </td><td> 262,05 ± 6,26 </td></tr><tr><td> TMOA </td><td> 129,18 ± 2,31 </td></tr&gt; <tr><td> TMDA </td><td> 141,23 ± 1,97 </td></tr><tr><td> TMHA </td><td> 131,75 ± 2,89 </td></tr><tr><td> TMHDA </td><td> 132,50 ± 1,18 </td></tr><tr><td> TMODA </td><td> 136,50 ± 0,96 </td></tr></tbody></table> . Représentant Tableau 4 glucose oxydase spécifique immobilisé dans certains polymères Nafion modifiés (note: l&#39;activité immobilisé est une fonction de l&#39;activité initiale spécifique de l&#39;enzyme). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3949/3949fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma de constitution TBAB en Nafion polymère et une utilisation ultérieure dans l&#39;immobilisation d&#39;enzymes. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3949/3949fig2.jpg" /> Figure 2. Photographie optique d&#39;un premier co-casting des films de Nafion et TBAB. Séchage lent donne un film transparent, brun clair couvrant la boTTOM du plateau de pesage.

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</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Dans le mode opératoire décrit, les sels d&#39;ammonium tétra-alkyle sont utilisés pour modifier le Nafion commerciale pour créer des polymères micellaires qui peuvent être utilisés pour immobiliser et stabiliser les enzymes. Les tests décrits dans le spectacle procédure que le polymère peut être utilisé pour immobiliser une grande variété d&#39;enzymes avec une forte rétention de l&#39;activité. Si l&#39;enzyme d&#39;intérêt a une activité très faible ou qui est impur, une concentration plus élevée peut être nécessaire...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Nafion </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 70160 </td></tr><tr><td> Sels de bromure de Tetra alkylammonium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> n / a </td></tr><tr><td> L&#39;alcool déshydrogénase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3263 </td></tr><tr><td> Nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) </td><td> Simga-Aldrich </td><td> N7004 </td></tr><tr><td> Pyrophosphate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8010 </td></tr><tr><td> Méthosulfate de phénazine (PMS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9625 </td></tr><tr><td> 2,6-dichloroindophénol (DCIP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1878 </td></tr><tr><td> La glucose oxydase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7141 </td></tr><tr><td> L&#39;acide 4-hydroxybenzoïque </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 240141 </td></tr><tr><td> L&#39;azoture de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8032 </td></tr><tr><td> Peroxydase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8375 </td></tr><tr><td> 4-aminoantipyrine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 06800 </td></tr><tr><td> UV / Vis Spectrophotomètre </td><td> Thermo </td><td> Evolution 260 Bio ou Spectronic Genesys 20 </td></tr><tr><td> Vortex Genie </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Balance analytique </td><td></td><td></td></tr></tbody></table&gt;

hydrophobe sel modifié nafion pour l&#39;immobilisation d&#39;enzymes et de stabilisation

Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization

Au cours de la dernière décennie, il a été une richesse d&#39;application pour les enzymes immobilisées et stabilisé, y compris la biocatalyse, les biocapteurs et les cellules de biocarburants. 1-3 Dans la plupart des applications bioélectrochimiques, des enzymes ou des organites sont immobilisés sur une surface de l&#39;électrode avec l&#39;utilisation d&#39;un certain type de matrice de polymère. Cet échafaudage polymère doit maintenir les enzymes stable et permettre la diffusion facile des molécules et des ions dans et hors de la matrice. La plupart des polymères utilisés pour ce type d&#39;immobilisation sont basées sur des polyamines ou des polyols - polymères qui imitent l&#39;environnement naturel des enzymes qu&#39;ils encapsuler et de stabiliser l&#39;enzyme par le biais d&#39;hydrogène ou une liaison ionique. Une autre méthode pour stabiliser les enzymes implique l&#39;utilisation de micelles, qui contiennent des régions hydrophobes qui peuvent encapsuler et de stabiliser les enzymes. 4,5 En particulier, le groupe a développé Minteer un polymère micellaire basée sur Nafion disponible dans le commerce. 6,7 Nafionlui-même est un polymère micellaire qui permet la diffusion de canal assistée de protons et d&#39;autres cations de petite taille, mais les micelles et les canaux sont extrêmement faibles et le polymère est très acide en raison de chaînes latérales d&#39;acides sulfoniques, ce qui est défavorable pour l&#39;immobilisation d&#39;enzymes. Cependant, lorsque le Nafion est mélangé avec un excès de sels d&#39;ammonium d&#39;alkyle hydrophobes tels que le bromure de tétrabutylammonium (TBAB), les cations ammonium quaternaire remplacer les protons et les contre-ions deviennent des groupes sulfonate sur les chaînes latérales polymères (figure 1). Il en résulte dans les grandes micelles et les canaux dans le polymère qui permettent la diffusion de substrats de grande taille et des ions qui sont nécessaires pour la fonction enzymatique de type nicotinamide adénine dinucléotide (NAD). Cette modification de Nafion polymère a été utilisé pour immobiliser de nombreux différents types d&#39;enzymes ainsi que des mitochondries pour une utilisation dans des biocapteurs et les cellules de biocarburants. 8-12 Cet article décrit une nouvelle procédure pour la fabrication de ce microellar membrane polymère immobilisation d&#39;enzymes qui peuvent stabiliser les enzymes. La synthèse de la membrane immobilisation d&#39;enzymes micellaire, la procédure d&#39;immobilisation d&#39;enzymes dans la membrane, et les essais pour étudier l&#39;activité enzymatique spécifique de l&#39;enzyme immobilisée sont détaillées ci-dessous.

Cet article décrit la procédure de synthèse d&#39;une membrane Nafion modifié hydrophobiquement enzyme immobilisation et comment immobiliser des protéines et / ou des enzymes au sein de la membrane et de tester leur activité spécifique.

Hydrophobe sel modifié Nafion pour l&#39;immobilisation d&#39;enzymes et de stabilisation

Au cours de la dernière décennie, les enzymes immobilisées et stabilisées ont fait l'objet de nombreuses applications, notamment en biocatalyse, pour les biocapteurs et les biocarburants...

L'objectif général de cette procédure est de synthétiser un polymère mycélien de stabilisation et d'immobilisation enzymatique. Pour y parvenir, mélangez d'abord la suspension néon avec le sel de bromure d'ammonium chélaté, puis vortexez le mélange afin de remplacer la forme protéinée du nafion par des sels d'ammonium. La deuxième étape consiste à sécher le polymère obtenu en versant le mélange dans un bac en téflon et en laissant évaporer les solvants.Ensuite, faire tremper le polymère dans de l'eau déionisée pendant 12 à 24 heures afin d'éliminer le sel en excès. Après l'extraction du sel, rincer le polymère à l'eau, puis laisser sécher complètement le polymère par évaporation. La dernière étape consiste à transférer le polymère dans un flacon propre et à le resuspendre dans un solvant pour son utilisation dans l'immobilisation enzymatique. En fin de compte, ce polymère pour l'immobilisation enzymatique est utilisé afin d'améliorer la stabilité des enzymes lors des dosages d'activité.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car bien que la procédure paraisse extrêmement simple, l'étape de séchage est cruciale pour la fabrication d'un polymère fonctionnel. La démonstration de la procédure sera réalisée par shu, une étudiante diplômée de mon laboratoire, afin d'initier la modification du nafion par des sels d'ammonium de Nerium. Mesurer un excès molaire triple par rapport aux groupes acides sulfoniques présents sur le polymère de nafion, à l'aide du sel de bromure d'alkylammonium.Transférez le sel de bromure d'ammonium alkylique dans un flacon en verre de manière énergique. Secouez un flacon contenant une suspension de nafion à 5 % poids par volume pendant environ 30 secondes afin de garantir une suspension uniforme du nafion en solution. Prélevez deux millilitres de la suspension de nafion ainsi remise en suspension à l’aide d’une pipette et ajoutez-les au flacon en verre contenant le sel de bromure d'ammonium AGU.Vortexez le flacon à 900 tr/min pendant 10 à 15 minutes. Ensuite, versez la solution visqueuse dans un plateau de pesée en plastique et utilisez une pipette pour transférer toute solution résiduelle du flacon vers le plateau de pesée. Dans cet exemple, le plateau est partiellement recouvert et laissé sur le banc de laboratoire afin que les solvants s'évaporent complètement du plateau à un taux d'évaporation qui prend plus de six heures.Une évaporation complète de tout le solvant à une vitesse d'évaporation appropriée doit laisser un film transparent jaune ou brun au fond du plateau de pesée, comme illustré ici. Si le solvant s'évapore trop rapidement, un matériau croûteux ou cristallin se formera au lieu d'un film transparent, ce qui indique que la structure micellaire du polymère a été détruite. Si l'évaporation du solvant est trop lente ou si le sel d'ammonium réagit trop longtemps en absorbant trop de vapeur d'eau, un gel orangé collant ou un matériau cristallin blanc se formera. Dans les deux cas, la procédure doit être recommencée. Une fois que tout le solvant s'est évaporé au taux d'évaporation approprié, remplir le plateau de pesée avec 10 à 20 millilitres d'eau désionisée de 18 mégohm·cm, couvrir et laisser tremper pendant 12 à 24 heures afin d'éliminer les sels excédentaires de bromure d'alkylammonium et de HBr. Douze à vingt-quatre heures plus tard, pipeter l'eau et ajouter suffisamment d'eau désionisée pour remplir le plateau. Veiller toujours à pipeter en s'éloignant du film polymère afin d'éviter d'en perdre une partie.Rincer un total de trois fois après les rinçages. Laisser le plateau de pesée à découvert jusqu'à ce que le polymère soit complètement sec. Une fois parfaitement sec, le polymère doit former un film plastique transparent et légèrement fragile.En revanche, les polymères qui n'ont pas été correctement séchés présenteront une apparence très différente après l'extraction du sel, comme illustré ici. À l'aide d'une spatule, retirez soigneusement le film séché du plateau de pesée et transférez-le dans un flacon en verre propre. Ajoutez deux millilitres d'éthanol et trois billes en céramique pour mélange, puis vortexez pendant quatre heures ou jusqu'à ce que le film polymère soit complètement resuspendu.La solution de nathe modifiée par l'ammonium alcalin est désormais prête à être utilisée pour l'immobilisation de l'enzyme. Si l'enzyme à immobiliser est une enzyme sèche, peser un milligramme de l'enzyme dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et ajouter un millilitre d'une solution tampon phosphate à cent millimolaire, pH 7, afin d'obtenir une solution d'enzyme à un milligramme par millilitre. Transférer 120 microlitres de la solution d'enzyme à un milligramme par millilitre dans un nouveau tube.Ajouter 60 microlitres de la solution d'ammonium ALK modifiée au nafion et vortexer pendant 10 secondes. Le rapport entre l'enzyme et la solution polymère doit être maintenu à deux pour un, si ce mélange doit être augmenté pour un grand nombre de réplicats. Enfin, pipeter 60 microlitres de la solution enzyme-polymère au fond de chacune des trois cuvettes séparées d'un centimètre carré et laisser sécher toute la nuit.La stabilité de l'enzyme au sein du film polymère peut ensuite être évaluée par des dosages d'activité enzymatique, comme illustré. Pour commencer ce dosage, ajoutez les réactifs suivants dans le tube en verre revêtu avec le polymère nafion modifié et l'enzyme déshydrogénase dépendante du NAD : 1,3 millilitre de pyrophosphate de sodium à 50 millimolaire, 1,5 millilitre de nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) fraîchement préparé à 15 millimolaire et 0,1 millilitre d'eau.Placer la cuvette dans un spectrophotomètre UV-visible réglé sur une longueur d'onde de 340 nanomètres. Ajouter 0,1 millilitre d'éthanol dans la cuvette et mélanger les réactifs en pipetant doucement la solution cinq fois vers le haut et vers le bas ; pour le témoin, utiliser 0,1 millilitre d'eau supplémentaire au lieu de 0,1 millilitre d'éthanol. Cinq minutes après l'ajout des réactifs à la cuvette, enregistrer l'absorbance à 340 nanomètres.Enregistrez à nouveau l'absorbance 20 minutes après l'ajout des réactifs au qve ; ces deux points de données seront tracés afin d'obtenir une pente pouvant être utilisée pour les calculs d'activité afin de mesurer l'activité spécifique enzymatique du pq immobilisé. Pipetez ces réactifs dans le qve copolymerisé avec le polymère nafion modifié et la déshydrogénase dépendante du PQQ. 1,5 millilitre de phosphate de sodium et 200 microlitres de sulfate de méthyle de pH à 600 micromolaire ou PMS.Placez le vete dans un spectrophotomètre UV-visible réglé sur une longueur d'onde de 600 nanomètres et faites le zéro. Ajoutez 100 microlitres d'un mélange composé de 700 microlitres de chloroéthanol ou de DCIP et de 200 microlitres du substrat d'intérêt. Mélangez les réactifs en aspirant et en expulsant la solution doucement cinq fois à l'aide d'une pipette pour obtenir un blanc.Utilisez 200 microlitres d'eau au lieu du substrat d'intérêt. Cinq minutes après l'ajout des réactifs, enregistrez l'absorbance à 600 nanomètres.Enregistrer à nouveau l'absorbance 20 minutes après l'ajout des réactifs pour commencer ce dosage. Ajouter à la Q VET co-élaborée avec le polymère de nafion modifié et la glucose oxydase. Deux millilitres d'une solution contenant les composants suivants : 0,2 molaire d'acide para-hydroxybenzoïque, 0,02 % d'azoture de sodium, 128 unités de peroxydase, 0,3 millimolaire de 4-aminoantipyrine, un molaire de phosphate de potassium et 50 millimolaires de glucose.Préparez la solution en pipetant cinq fois vers le haut et vers le bas. Placez le Q vet dans un spectrophotomètre UV-visible réglé sur une longueur d'onde de 510 nanomètres. Cinq minutes après l'ajout des réactifs au qve.Enregistrez l'absorbance à 510 nanomètres. Ensuite, enregistrez à nouveau l'absorbance 20 minutes après l'ajout des réactifs. Ce tableau présente les résultats de dosage de l'activité de la glucose déshydrogénase dépendante du NAD, immobilisée et sélectionnée sur des polymères de nafion modifiés.Il a été observé que la glucose déshydrogénase dépendante du NAD, immobilisée, présentait une activité spécifique inférieure à celle de l'enzyme en solution tamponnée. Cela s'explique par le fait que les membranes polymériques réduisent le transport des molécules de grande taille ; bien que le glucose, substrat de ce dosage, soit de petite taille, le coenzyme NAD doit diffuser à l'intérieur et à l'extérieur de la membrane. Pour la déshydrogénase dépendante du NAD, la limitation du transport due à l'immobilisation dans le polymère diminue l'activité enzymatique observée.Le tableau suivant présente les résultats d'essais d'activité de la glucose déshydrogénase dépendante du PQQ immobilisée sur divers polymères de nafion modifiés. Il est important de noter ici l'activité plus élevée des enzymes immobilisées sur la plupart des films de nafion par rapport aux enzymes en solution tampon. Étant donné que la glucose déshydrogénase dépendante du PQQ est une protéine associée à la membrane, le nafion modifié hydrophobe fournit un environnement plus proche de celui d'une membrane que le tampon, ce qui stabilise la glucose déshydrogénase dépendante du PQQ sous sa forme active et améliore ainsi l'activité enzymatique.Enfin, les résultats représentatifs de l'activité spécifique de la glucose oxydase. Les polymères de nafion modifiés immobilisés et sélectionnés sont présentés dans ce tableau. Les dosages enzymatiques pour chacun des polymères avec chacune des trois enzymes montrent que les tendances de l'activité spécifique relative par rapport à l'enzyme en solution dépendent du système enzymatique.Par conséquent, le polymère exact nécessaire à chaque enzyme doit être optimisé. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que l'étape de séchage est critique pour cette procédure particulière.

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