Name: Coloration immunohistochimique de B7-H1 (PD-L1) sur la paraffine Diapositives de tissus adénocarcinome pancréatique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Apprenez la coloration immunohistochimique de B7-H1 (PD-L1) sur coupes de paraffine pour caractériser son expression dans l'adénocarcinome pancréatique. Cette méthode permet de visualiser les mécanismes immunosuppresseurs du microenvironnement tumoral.

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EB, KMB, et HX contribuent à parts égales. Cette étude a été financée par le NCI SPORE de cancers gastro-intestinaux P50 CA062924, CA148964 NIH K23, Lustgarten Foundation, Viragh Fondation, le Prix du jeune chercheur ASCO, NIH 5T32 CA0090701-28 Subvention de formation, Sol Goldman Centre cancer du pancréas, de la Fondation nationale du pancréas.

B7-H1/PD-L1, un membre de la famille B7 du système immunitaire réglementaires protéines de surface cellulaire, joue un rôle important dans la régulation négative des réponses à médiation cellulaire immunitaire grâce à son interaction avec son récepteur, la mort programmée-1 (PD -1) 1,2. La surexpression de B7-H1 par les cellules tumorales a été observée dans un certain nombre de cancers humains, y compris le mélanome, le glioblastome et les carcinomes du poumon, du sein, du côlon, de l&#39;ovaire, et des cellules rénales, et a été montré pour affecter anti-tumorales T- 3-8 immunité cellulaire. Récemment, B7-H1 expression par les tissus adénocarcinome pancréatique a été identifié comme un marqueur pronostique potentiel de 9,10. De plus, le blocage de B7-H1 dans un modèle murin de cancer du pancréas a été montré pour produire une réponse anti-tumorale 11. Ces données suggèrent l&#39;importance de la B7-H1 comme une cible thérapeutique potentielle. Anticorps blocus anti-B7-H1 sont donc l&#39;objet d&#39;essais cliniques pour l&#39;homme multipledes tumeurs solides, y compris le mélanome et le cancer du poumon, du côlon, du rein, de l&#39;estomac et du pancréas 12. Pour finalement être en mesure d&#39;identifier les patients qui bénéficieront de B7-H1 ciblage des thérapies, il est essentiel d&#39;étudier la corrélation entre l&#39;expression et la localisation de B7-H1 et la réponse du patient au traitement avec des anticorps blocus B7-H1. Examiner l&#39;expression de B7-H1 dans les tissus humains adénocarcinome pancréatique par immunohistochimie vous donnera une meilleure compréhension de la façon dont cette molécule de signalisation co-inhibiteur contribue à la suppression de l&#39;immunité anti-tumorale dans le micro de la tumeur. L&#39;anticorps anti-B7-H1 monoclonal (clone 5H1) développé par Chen et ses collègues a été montré pour produire des résultats fiables dans cryosections coloration de plusieurs types de tissus humains néoplasiques 4,8, mais des taches sur paraffine diapositives a été un défi que récemment 13-18. Nous avons développé le staini B7-H1protocole ng pour les diapositives inclus en paraffine des tissus adénocarcinome pancréatique. Le protocole de coloration B7-H1 décrit ici produit conforme coloration membranaire et cytoplasmique de B7-H1 avec petit retour en arrière. 1. De-parafinization <ol><li> Cuire glisse à 55 ° C pendant 20 min. </li><li> Dans une hotte chimique, immerger les lames dans du xylène pendant 10 min. </li><li> Immerger les lames dans du xylène frais pendant 10 min. </li><li> Plonger les lames dans de l&#39;éthanol à 100% pendant 5 min. </li><li> Plonger les lames dans de l&#39;éthanol 100% frais pendant 5 min. </li><li> Plonger les lames dans de l&#39;éthanol à 95% pendant 5 min. </li><li> Plonger les lames dans l&#39;éthanol à 80% pendant 5 min. </li><li> Plonger les lames dans de l&#39;eau désionisée pendant 5 min. </li></ol> 2. Récupération antigène <ol><li> Immerger les lames dans du Tris-EDTA (pH 9,0) et de la chaleur dans une cocotte-minute à 125 ° C pendant 30 secondes, puis 90 ° C pendant 10 sec. </li><li> Laissez refroidir diapositives pendant 60 min. </li><li> Immerger les lames dans du TBST pendant 5 min; Repemoins deux fois. </li></ol> 3. Tachant <ol><li> Essuyez solutions autour du tissu sur les diapositives. Marquer un cercle autour du tissu avec un stylo hydrophobe. </li><li> Placer les lames dans une chambre humide et éviter le séchage du tissu sur la lame pendant le processus de coloration entier. Déposer une goutte (environ 200 pi ou plus pour couvrir complètement la zone de tissu) du bloc de peroxydase dans le cercle hydrophobe sur la diapositive et diapositives incuber dans le bloc peroxydase pendant 5 min. </li><li> Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min. </li><li> Déposer une goutte de BLOCK ACE tampon de blocage sur chaque lame et incuber pendant 15 min. </li><li> Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min. </li><li> Déposer une goutte de solution d&#39;avidine sur chaque lame et incuber pendant 15 min. </li><li> Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min. </li><li> Déposer une goutte de solution de biotine sur chaque lame et incuber pendant 15 min. </li><li> Rincer slides avec TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min. </li><li> Incuber les lames avec 1:1000 dilution des anticorps de souris anti-B7-H1 anticorps monoclonal (clone 5H1) ou une souris IgG1 κ isotype contrôle dans 200 ul TBST à 4 ° C pendant la nuit pendant 22 heures + / - 1 heure. La concentration finale de l&#39;anticorps dans du TBST vaut 2.57 pg / ml. </li><li> Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min. Répéter deux fois. </li><li> Incuber les lames avec un rat biotine anti-souris conjugué anticorps IgG1 secondaire à une concentration 1:500 (dans 200 ul solution de chèvre 2% de sérum) pendant 30 min. </li><li> Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min. Répéter deux fois. </li><li> Déposer une goutte de streptavidine-biotine (doit être préparé au moins 30 minutes avant de l&#39;utiliser) sur chaque lame et incuber pendant 15 min. </li><li> Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min. Répéter deux fois. </li><li> Déposer une goutte de réactif d&#39;amplification (dilué 2:1 avec du TBST) sur chaque lame et incuber pendant 4 min. </li><li> Rincer les lames avec TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min. Répéter deux fois. </li><li> Déposer une goutte de streptavidine-HRP sur chaque lame et incuber pendant 15 min. </li><li> Rincer les lames avec du TBST, puis mettre dans TBST pendant 5 min. Répéter deux fois. </li><li> Déposer une goutte de 3,3-diaminobenzidine (DAB) et substrat chromogène sur chaque diapositive et développer la couleur pendant 2 min. </li><li> Immédiatement après le développement de la couleur, laver les lames avec ddH 2 O pendant 1-2 min. </li><li> Incuber les lames avec une goutte d&#39;hématoxyline pendant 90 sec. </li><li> Laver avec ddH 2 O pendant 1-2 min. </li><li> Laver à l&#39;eau savonneuse robinet pendant 1-2 min. </li><li> Laver avec ddH 2 O pendant 1-2 min. </li></ol> 4. La déshydratation et de montage <ol><li> Immerger les lames dans l&#39;éthanol à 80% pendant 3 min. </li><li> Immerger les lames dans l&#39;éthanol à 95% pendant 3 min. </li><li> Immerger les lames dans l&#39;éthanol à 100% pendant 5 min. Répéter. </li><li> Immerger les lames dans du xylène pendant 5 min. Répéter. </li><li> Ajouter une goutte deCytoseal 60 à la lame et le lieu de la lamelle. </li></ol> Le tableau 1 dresse la liste des réactifs utilisés dans les procédures décrites ci-dessus.

<ol><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+B7s%3A+playing+a+pivotal+role+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity.</a> J. Immunother. 30, 251-260 (2007).</li>
<li>Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1%2C+a+third+member+of+the+B7+family%2C+co-stimulates+T-cell+proliferation+and+interleukin-10+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion.</a> Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).</li>
<li>Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+improves+myeloid+dendritic+cell-mediated+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity.</a> Nat. Med. 9, 562-567 (2003).</li>
<li>Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDong%2C+H+%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. 8, 793-800 (2002).</li>
<li>Dong, H., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+pathway+and+its+role+in+the+evasion+of+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity.</a> J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).</li>
<li>Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+blockade+augments+adoptive+T-cell+immunotherapy+for+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma.</a> Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).</li>
<li>Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+and+PD-1+by+monoclonal+antibodies+potentiates+cancer+therapeutic+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity.</a> Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costimulatory+B7-H1+in+renal+cell+carcinoma+patients%3A+Indicator+of+tumor+aggressiveness+and+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).</li>
<li>Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+up-regulated+expression+in+human+pancreatic+carcinoma+tissue+associates+with+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression.</a> J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).</li>
<li>Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+regulation+of+the+costimulatory+molecule+B7-H1+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer.</a> Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).</li>
<li>Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+or+B7-DC+induces+an+anti-tumor+effect+in+a+mouse+pancreatic+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model.</a> Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).</li>
<li>Wang, S., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+cancer+therapies+targeting+CD137+and+B7-H1%2FPD-1+cosignal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).</li>
<li>Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+glycoprotein+blockade%3A+a+novel+strategy+to+enhance+immunotherapy+in+patients+with+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma.</a> Urology. 66, 10-14 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+B7-H1+is+associated+with+poor+prognosis+in+renal+cell+carcinoma+patients+with+long-term+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up.</a> Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).</li>
<li>Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+B7-H1+expression+in+clear+cell+carcinoma+of+the+kidney+for+prognostication+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy.</a> Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).</li>
<li>Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-expressed+B7-H1+and+B7-DC+in+relation+to+PD-1%2B+T-cell+infiltration+and+survival+of+patients+with+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma.</a> Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).</li>
<li>Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+%28B7-H1%29+expression+by+urothelial+carcinoma+of+the+bladder+and+BCG-induced+granulomata%3A+associations+with+localized+stage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression.</a> Cancer. 109, 1499-1505 (2007).</li>
<li>Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).</li>
<li>Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+B7-H1+and+B7-1+expressions+in+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma.</a> World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).</li>
<li>Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+therapeutic+potential+of+the+programmed+death-1+ligand%2Fprogrammed+death-1+pathway+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer.</a> Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).</li>
<li>Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+inflammatory+response+with+B7-h1+expression+in+human+melanocytic+lesions+supports+an+adaptive+resistance+mechanism+of+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape.</a> Sci. Transl. Med. 4, 127ra37(2012).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La coloration immunohistochimique de B7-H1 sur cryocoupes a été rapporté dans les études antérieures pour une variété de cancers 3,4. Cependant, cliniques échantillons tumoraux sont généralement disponibles que sous la forme de blocs de paraffine. L&#39;anticorps monoclonal 5H1 a plus récemment été appliquée avec succès à la coloration des tissus tumoraux inclus en paraffine y compris le carcinome à cellules rénales, cancer du col, cancer de la vessie et le mélanome 13-18. B7-H1 taches sur la paraf...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> CSA Système </td><td> Dako </td><td> K1500 </td><td> Comprend les réactifs suivants mentionnés dans le protocole: bloc peroxydase streptavidine-biotine, complexe, de réactifs d&#39;amplification, la streptavidine-HRP et le substrat chromogène DAB et </td></tr><tr><td> Avidine / biotine Blocage Kit </td><td> Vecteur </td><td> SP-2001 </td><td></td></tr><tr><td> Bloquer ACE </td><td> Serotec </td><td> BUF029 </td><td></td></tr><tr><td> La biotine anti-IgG1 de souris </td><td> BD </td><td> 553441 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse IgG1 Isotype contrôle K </td><td> eBioscience </td><td> 14-4714-85 </td><td></td></tr><tr><td> TBS (Tris-buffered saline), 10X </td><td> Cellgro </td><td> 46-012 CM- </td><td> 10xTBS contient 80 g / L de NaCl et 24,2 g / L Tirs; Diluée à 1X avec ddH2O pour les lavages; </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1379 </td><td> Ajouté 1 ml à 1 L d&#39;1X TBS pour faire TBST </td></tr><tr><td> Target Retrieval, 20x </td><td> Celerus Vague </td><td> 014-3000-000 </td><td> Dilué à 1 avec ddH 2 O </td></tr><tr><td> 190 preuve Alcool éthylique </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 111000190 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Proof Alcool éthylique </td><td> PHARMO-AAPER </td><td> 111000200 </td><td></td></tr><tr><td> Xylène </td><td> VWR </td><td> 95057-827 </td><td></td></tr><tr><td> Hématoxyline </td><td> Richard-Allan scientifique </td><td> 72804 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Richard-Allan scientifique </td><td> 8310-4 </td><td></td></tr><tr><td> Lamelles de </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td></td></tr><tr><td> Chambre d&#39;humidité </td><td> Sigma </td><td> H6644 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 1. Réactifs et matériel. </td></tr></tbody></table>

coloration immunohistochimique de b7-h1 (pd-l1) sur la paraffine diapositives de tissus adénocarcinome pancréatique

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, un membre de la famille B7 du système immunitaire réglementaires protéines de surface cellulaire, joue un rôle important dans la régulation négative des réponses à médiation cellulaire immunitaire grâce à son interaction avec son récepteur, la mort programmée-1 (PD -1) 1,2. La surexpression de B7-H1 par les cellules tumorales a été observée dans un certain nombre de cancers humains, y compris le mélanome, le glioblastome et les carcinomes du poumon, du sein, du côlon, de l&#39;ovaire, et des cellules rénales, et a été montré pour affecter anti-tumorales T- 3-8 immunité cellulaire. Récemment, B7-H1 expression par les tissus adénocarcinome pancréatique a été identifié comme un marqueur pronostique potentiel de 9,10. De plus, le blocage de B7-H1 dans un modèle murin de cancer du pancréas a été montré pour produire une réponse anti-tumorale 11. Ces données suggèrent l&#39;importance de la B7-H1 comme une cible thérapeutique potentielle. Anticorps blocus anti-B7-H1 sont donc l&#39;objet d&#39;essais cliniques pour le mulsieurs tumeurs solides humaines, y compris le mélanome et le cancer du poumon, du côlon, du rein, de l&#39;estomac et du pancréas 12. Pour finalement être en mesure d&#39;identifier les patients qui bénéficieront de B7-H1 ciblage des thérapies, il est essentiel d&#39;étudier la corrélation entre l&#39;expression et la localisation de B7-H1 et la réponse du patient au traitement avec des anticorps blocus B7-H1. Examiner l&#39;expression de B7-H1 dans les tissus humains adénocarcinome pancréatique par immunohistochimie vous donnera une meilleure compréhension de la façon dont cette molécule de signalisation co-inhibiteur contribue à la suppression de l&#39;immunité anti-tumorale dans le micro de la tumeur. L&#39;anticorps anti-B7-H1 monoclonal (clone 5H1) développé par Chen et ses collègues a été montré pour produire des résultats fiables dans cryosections coloration de plusieurs types de tissus humains néoplasiques 4,8, mais des taches sur paraffine diapositives a été un défi que récemment 13-18. Nous avons devenfuie le protocole de coloration B7-H1 pour les diapositives inclus en paraffine des tissus adénocarcinome pancréatique. Le protocole de coloration B7-H1 décrit ici produit conforme coloration membranaire et cytoplasmique de B7-H1 avec petit retour en arrière.

Une coloration immunohistochimique succès de B7-H1 fera la démonstration de l&#39;expression hétérogène de B7-H1 (brun signaux développement de la couleur DAB) dans l&#39;adénocarcinome du pancréas. Certaines cellules d&#39;adénocarcinome du pancréas ont une expression essentiellement membranaire de B7-H1 (figure 1A) tandis que d&#39;autres ont une expression soit essentiellement cytoplasmique de B7-H1 ou peu d&#39;expression de B7-H1 (figures 2 et 3). Épithélium pancréatique normal con...

B7-H1 (PD-L1) et sa liaison au PD-1 fournissent une importante induite par la tumeur de signal immunosuppresseur dans le micro de la tumeur. Une technique de coloration immunohistochimique pour caractériser l&#39;expression et la localisation de B7-H1 dans l&#39;adénocarcinome pancréatique est décrite ici.

Coloration immunohistochimique de B7-H1 (PD-L1) sur la paraffine Diapositives de tissus adénocarcinome pancréatique

B7-H1/PD-L1, un membre de la famille B7 des protéines de surface cellulaire de régulation immunitaire, joue un rôle important dans la régulation négative de la réponse cellulo-médiée...

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser des techniques de coloration immunohistochimique pour évaluer l'expression de B seven H one PD L one sur des sections de tissu pancréatique adénocarcinomateux humain inclus en paraffine. Cela est réalisé en premier lieu en éliminant la paraffine et en réhydratant les sections tissulaires découpées. La deuxième étape de la procédure consiste en la récupération des antigènes, qui implique l'utilisation d'un autocuiseur pour colorer le tissu.Une procédure de coloration par anticorps est suivie d'étapes d'amplification du signal et de développement de la couleur avec la DAB. Les étapes finales consistent à déshydrater et monter le tissu. Une fois terminé.La microscopie et l’analyse d’image permettent de visualiser la protéine B seven H one membranaire et cytoplasmique. Cette approche peut contribuer à répondre à des questions essentielles dans l’étude du carcinome endocrinien pancréatique, en améliorant notre compréhension du rôle de B seven one BTL one dans la suppression de l’immunité anti-tumorale au sein du microenvironnement tumoral. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la coloration sur sections cryogéniques, réside dans son optimisation pour l’utilisation de sections de tissus inclus en paraffine, qui sont généralement plus accessibles et plus faciles à conserver.Une coloration fiable par anticorps sur des lames n'est pas possible sans avoir préalablement éliminé le paraffine. Ainsi, pour préparer des lames contenant des tissus inclus dans la paraffine, faites d'abord chauffer les lames à 55 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ensuite, dans une hotte chimique, une série de sept bains chimiques est utilisée pour éliminer la paraffine ; tout d'abord, immergez les lames dans du xylène pendant 10 minutes.Ensuite, plongez les lames dans un second bain de xylène frais pendant 10 minutes. Troisièmement, immergez les lames dans de l'éthanol à 100 % pendant cinq minutes. Quatrièmement, plongez à nouveau les lames dans de l'éthanol frais à 100 % pendant cinq minutes.Cinquièmement, immergez les lames dans de l’éthanol à 95 % pendant cinq minutes. Sixièmement, immergez les lames dans de l’éthanol à 80 % pendant cinq minutes. Enfin, rincez les lames à l’eau déionisée pendant cinq minutes.Une fois le paraffine retiré, il est ensuite nécessaire de rendre l'antigène accessible. Plongez d'abord les lames dans du tampon Tris EDTA. Chauffez ensuite les lames dans une cocotte-minute selon un programme en deux étapes.Chauffez-les d'abord à 125 degrés Celsius pendant 30 secondes. Ensuite, à 90 degrés Celsius pendant 10 secondes. Puis laissez reposer les lames à l'air libre pour les refroidir à température ambiante.Après avoir laissé refroidir les lames pendant une heure, laver les lames deux fois avec du TBST, cinq minutes par bain. Les lames peuvent maintenant être colorées individuellement. Commencer par éponger la solution de TBST autour du tissu, puis tracer un cercle autour du tissu avec un stylo hydrophobe.Pendant toute la durée de cette procédure, évitez le dessèchement du tissu en conservant les lames dans une chambre humidifiée. Lorsqu'elles ne sont pas immergées, déposez une goutte de blocage de la peroxydase à l'intérieur du cercle hydrophobe sur la lame. Attendez cinq minutes, puis rincez la peroxydase avec du TBST.Ensuite, plongez les lames dans du TBST pendant cinq minutes. Retirez les lames de la solution et secouez doucement pour éliminer l'excès de TBST. Placez maintenant une goutte de tampon bloquant CE sur chaque lame et incubez-les à température ambiante pendant 15 minutes.Nettoyez les lames à l'aide d'un rinçage suivi d'un bain de cinq minutes dans le TBST. Ensuite, déposez une goutte de solution Vidan sur chaque lame et laissez agir pendant 15 minutes. Éliminez l'AVADON selon le même protocole de rinçage et de bain dans le TBST.Appliquez maintenant la biotine. Attendez cinq minutes, puis nettoyez les lames à nouveau avec du TBST. Incubez ensuite les lames avec une dilution d'anticorps monoclonal de souris ou d'un anticorps contrôle.Dans du TBST, laisser l'anticorps se conjuguer à quatre degrés Celsius pendant 22 heures. Le jour suivant, laver les lames avec du TBST trois fois comme précédemment. Chaque lavage comprend un rinçage A-T-B-S-T et un bain de cinq minutes.Ce protocole de triple lavage est répété plusieurs fois par la suite lors du retrait de l'anticorps primaire. Préparez la solution du complexe STR titine Bio ITIN. Elle doit être préparée au moins 30 minutes avant son utilisation.Incubez maintenant les lames avec l'anticorps secondaire de chèvre anti-US conjugué à la biotine, dans une solution de sérum de chèvre, pendant 30 minutes. Pendant cette incubation, suivez les instructions du kit DACO pour préparer la solution chromogène de substrat DAB. La solution peut être conservée à quatre degrés à l'abri de la lumière pendant un maximum de huit heures.Après l'incubation, effectuez un lavage triple avec du TBST. Ensuite, déposez une goutte de complexe de streptavidine-biotine sur chaque lame. Incubez les lames pendant 15 minutes, puis lavez-les trois fois avec du TBST.Ensuite, appliquez une goutte de réactif d'amplification sur chaque lame. Attendez quatre minutes, puis rincez les lames trois fois avec du TBST. Une fois le réactif d'amplification éliminé par lavage, ajoutez une goutte de streptavidine HRP sur chaque lame et incubez pendant 15 minutes.Effectuez un autre lavage triple au TBST avant de poursuivre. Voici maintenant l'étape la plus délicate du protocole. Ajoutez une goutte de substrat DAB CHROMOGÈNE contenant du peroxyde d'hydrogène sur une lame et observez le développement de la coloration. Le substrat DAB.Le temps de développement du CHROMOGÈNE est généralement de deux minutes, mais nous surveillons habituellement le développement au microscope afin d'assurer une coloration optimale. Afin d'obtenir un fond minimal à chaque cycle de coloration, nous incluons une lame provenant d'un lot précédent et une lame de végétation amygdalienne comme témoins positifs. Une fois terminé, rincez immédiatement la lame à l'eau, et non au TBST.Incuber la lame avec une goutte d'hématine pendant 90 secondes. Rincer immédiatement la lame avec de l'eau distillée désionisée, suivie d'eau du robinet savonneuse, puis à nouveau avec de l'eau DD. Cette étape termine la procédure de coloration.Une fois que toutes les lames ont été colorées, utilisez une série d'éthanol pour déshydrater les lames avant de les monter. Premièrement, immergez les lames dans de l'éthanol à 80 % pendant trois minutes. Deuxièmement, immergez les lames dans de l'éthanol à 95 % pendant trois minutes.Pour les troisième et quatrième bains, plonger les lames dans de l'éthanol à 100 % pendant cinq minutes. Cinquième et sixième, plonger les lames dans le xylène pendant cinq minutes. Enfin, ajouter une goutte par échantillon sur chaque lame et poser délicatement une lamelle.Les lames sont désormais prêtes pour l'analyse microscopique par immunohistochimie. La coloration de B sept H un a révélé une expression hétérogène de B sept H un dans l'adénocarcinome du pancréas. Les cellules apparaissent en marron suite au développement colorimétrique avec la DAB. Certaines cellules d'adénocarcinome pancréatique présentent une expression principalement membranaire de B sept H un, tandis que d'autres montrent soit une expression essentiellement cytoplasmique de B sept H un, soit une faible expression de B sept H un. L'épithélium normal des canaux pancréatiques exprime peu de B sept H un. L'utilisation d'une anticorps de contrôle isotopique IgG1 kappa de souris à la place de l'anticorps anti-B sept H un a produit très peu de coloration de fond. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept heures réparties sur deux jours, incluant une incubation nocturne de 22 heures, si elle est correctement exécutée après cette étape de développement.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'oncologie pour explorer la signalisation de B seven H one PD L one dans d'autres tumeurs malignes.

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