Name: Non du plasma Collage de PDMS pour fabrication bon marché de dispositifs microfluidiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-11-01T00:41:54.000+00:00
Duration: 4 min 45 s
Description: Apprenez le collage réversible sans plasma de dispositifs microfluidiques neuronaux sur verre pour culture cellulaire. Cette méthode économique utilise des forces électrostatiques PDMS-verre et ne nécessite pas d'équipement coûteux.

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Préparation Dispositifs microfluidiques pour la culture cellulaire Neuron 1) Nettoyer Corning No.1 24 X 40 mm lames de verre mm <ul><li> Soniquer les lames de verre dans un bain d&#39;eau sonicateur pendant 30 minutes </li><li> Rincer les lames de verre avec de l&#39;EtOH 70% </li><li> Laver les lames trois fois avec dH 2 O </li><li> Diapositives à sec dans une hotte de culture tissulaire pendant plusieurs heures, de préférence la nuit </li></ul> Note: Nous avons des plateaux métalliques spéciales que nous charger avec les diapositives. Les lames sont séparées individuellement et placé dans des fentes dans cette grille métallique. Nous pouvons alors placer ces plateaux de chargement de métal dans un plat en verre que nous remplir d&#39;eau, place dans le sonicateur bain d&#39;eau, et soniquer pendant 30 minutes. Lavages suivants sont effectués dans ce plat. 2) Préparer les périphériques PDMS <ul><li> Découpez le moule PDMS de la plaquette de silicium, percer des trous dans le plâtre et le PDSM trimestre, elle </li><li> Nettoyer les appareils PDMS abord par soufflage de gaz inerte (argon ou azote) à travers eux. Ensuite, utilisez 3M Scotch 471 ruban adhésif à décoller tous les débris </li></ul> Note: Il est important de garder les appareils face. Initialement, lorsque nous avons coupé le PDMS loin de la plaquette de silicium, la face en contact avec la plaquette est du côté propre: il contient les canaux microfluidiques. Nous essayons d&#39;être aussi prudents que nous pouvons pour ne pas endommager l&#39;appareil, et de garder la face latérale de nettoyage jusqu&#39;à ce que nous sommes prêts pour le collage de plasma. <ul><li> Périphériques autoclave dans des contenants en plastique </li><li> Après autoclavage, propre n ° 1 des lames de verre Corning et de plasma traitent dispositifs utilisant un nettoyant Harrick plasma de marque, <a href="http://www.harrickplasma.com/" target="_blank">www.harrickplasma.com</a> </li><li> Placez les appareils propres à l&#39;envers sur la lame de verre. </li></ul> Le dispositif est maintenant le plasma collé à la lame de verre. 3) Les appareils avec revêtement en poly L-lysine (PLL) <ul><li> PLL est ajoutée à un puits de chaque côté de l&#39;appareil et s&#39;écouler à travers dans le puits la prochaine </li></ul> =&gt; 150 pi de PLL pour les grands godets et 30 μ L PLL pour les puits plus petits. Il n&#39;a pas à être exact aussi longtemps que les puits sont pleins. Remarque: Si vous regardez un appareil, vous verrez 4 puits: chaque deux sont liés. Vous voulez mettre la PLL dans un puits afin qu&#39;il s&#39;écoule à travers le dispositif dans le puits suivant. <ul><li> Autoriser la PLL de circuler à travers l&#39;appareil pendant environ 10 minutes, puis ajouter de PLL dans les puits pour les remplir </li><li> Placez les appareils contenant PLL dans une étuve à 37 ° C pour un minimum de 4 heures (une nuit de préférence) </li><li> Vide à l&#39;excès PLL après le traitement, mais attention à ne pas aspirer tout le liquide hors de l&#39;appareil </li></ul> Remarque: Vous ne voulez pas d&#39;introduire des bulles d&#39;air vers les canaux ou de la chambre. Juste à vide à l&#39;excès de PLL dans les puits. <ul><li> Ajouter autoclavé dH 2 O pour chaque puits de chaque côté de l&#39;appareil, et laisser couler pour le bien des autres par capillarité </li></ul> La figure 1 est un schéma d&#39;un dispositif microfluidique. Remarquez comment le bleu (Soma côté) est connecté et la Croix-Rouge (côté axonale) sont connectés. Quand nous disons mis le PLL, ou de l&#39;eau ou des médias, sur un puits de chaque côté de l&#39;appareil, ce que nous entendons, par exemple, est la suivante: Placer 150 ul d&#39;autoclave dH O 2 dans un bleu bien puis placez 150 pi de autoclavé dH 2 0 dans un rouge bien. L&#39;eau (ou PLL, ou des médias, ou cellules) circulera à travers le dispositif pour le bien d&#39;autres correspondants. <img src="/files/ftp_upload/old/410_2008_8_27_3/410_Figure-01.png" alt="Figure 1" width="362" height="216" /> Figure 1 Note: S&#39;il vous plaît noter que, à partir de maintenant, quand je dis «médias lieu, les cellules, l&#39;eau ou PLL dans le TOP puits&quot;, je me réfère au schéma ci-dessus où le Soma serait sur ​​la gauche et les axones va croître à l&#39; droite. <ul><li> Aspirer l&#39;eau (encore une fois attention à ne pas supprimer complètement tout le liquide de l&#39;appareil), puis ajouter un autre 150 ul d&#39;autoclave dH 2 O à l&#39;un de chaque bien relié et lui permettre de circuler à travers le puits correspondant. </li><li> Placez l&#39;appareil contenant dH 2 O dans une étuve à 37 ° C pendant 1 heure, puis répétez l&#39;étape de lavage à nouveau. Laver les appareils à trois reprises avec dH 2 O pour une heure chacune, ce qui est du total. </li></ul> Remarque: En raison de la possibilité que le borate de la PLL peut absorber dans le PDMS, certains dans le laboratoire de Jeon recommandons incubant les appareils pendant la nuit avec autoclave dH 2 O après une couple de iINITIALE rinçages rapides. Cela permettra d&#39;assurer que tous borate libre lixiviation hors du PDMS avant le chargement des cellules. Si cela n&#39;est pas fait, il peut y avoir un communiqué de borate dans les médias au fil du temps, ce qui pourrait conduire à une cytotoxicité. <ul><li> Ajouter Neural milieux de base (NBM) avec les facteurs nécessaires (glutamax, B27, Penstrep) dans les puits de haut </li></ul> Remarque: Les appareils peuvent être incubées pendant la nuit et plaqué avec des cellules le jour suivant, ou incubés un minimum de 3 heures avec des facteurs + NMB avant l&#39;étalement des cellules. Préparer les neurones pour le chargement dans les dispositifs Nous utilisons 18 jours cortex vieille de fœtus de rat que l&#39;on soit d&#39;acheter d&#39;une compagnie appelée Bits cerveau ou qui est préparé sur le campus pour nous. Nous préférons pour obtenir le tissu frais. <ol><li> Obtenir une cortex cérébral du foetus (2 morceaux de tissus) stockés dans Hibernate E </li><li> Prenez 3 pipettes de verre longues et les incendies dans des tailles de chaque successivement plus petits en utilisant une lampe à alcool </li><li> retirer les tissus d&#39;Hibernate E avec une pipette en verre et le placer dans 2 ml de facteurs + NMB dans un tube de 15 ml stériles. </li><li> Trituration: aide d&#39;une pipette en verre bulbe et le cortex est passé de haut en bas d&#39;environ 5 à 10 fois. Ensuite, la pipette inférieur suivant est utilisé pour la pipette de haut en bas le tissu. Enfin, la plus petite pipette est utilisé pour la pipette de haut en bas le tissu. Nous aimons à vous assurer qu&#39;il n&#39;ya pas de morceaux visibles. Remarque: Récemment, le laboratoire a commencé à comparer les cellules Jeon à partir de tissus conservés dans Hibernate E aux cellules qui ont été préparés à partir de tissus initialement traités par la trypsine 0,125% dans 50% de Ca + + libre et Mg + + tampon de dissection libre. Le consensus est que les tissus préparés en utilisant la trypsine rendement des cellules plus viable que les tissus initialement placé dans Hibernate E. Si vous n&#39;allez pas utiliser le tissu tout de suite, alors vous avez besoin pour stocker les tissus dans Hibernate E. Si vous envisagez d&#39;utiliser le tissu de suite et je voudrais la viabilité accrue, puis de traiter les tissus par la trypsine avant trituration mécanique comme suit: 1) diluer 1 ml 0,25% de trypsine (Gibco, Invitrogen) avec 1 ml de Ca + + libre Mg + + gratuitement mémoire tampon de dissection (finale trypsine = 0,125%) dans un tube de 15 ml (conserver au froid de la glace); tissus placer 2) dans un tampon et incuber immédiatement à 37 ° C pendant 8 minutes; 3) ajouter 10 ml DMEM/10% de FBS pour arrêter le réaction de la trypsine et de continuer le protocole ci-dessous. </li><li> Centrifuger les cellules à 1100 rpm pendant 1 minute </li><li> Les médias aspiré hors attentivement le culot cellulaire </li><li> Ajouter 1 ml de facteurs + NMB au culot et remises en suspension par aspiration et refoulement </li><li> Passez les cellules remises en suspension par écoulement gravitaire à travers un filtre pour enlever les grumeaux (BD Falcon cellules tamis en nylon 40 um) </li><li> Comte et cellules de la plaque: <ul><li> Dans un tube de centrifugeuse, ajouter 60 ul + NMB facteurs, 20 pl de suspension cellulaire, et 20 pi de bleu trypan puis mélanger </li><li> Ajouter environ 10 pi de cette solution à un hémocytomètre et compter les cellules vivantes (pas bleu) </li><li> Ajuster la concentration de 2.5 à 4.5 x10 6 cellules / ml Remarque: Nous obtenons généralement une concentration d&#39;environ 2.5 à 4.5 x 106 cellules / ml. selon le volume des cellules sont remises en suspension dans (normalement 1 ml NBM + B27/Glutamax/PenStrep percortex). Si le tissu a été préparé par la trypsine, le rendement sera probablement augmenté. </li></ul></li></ol> Placage Les dispositifs <ol><li> Charge cellules (neurones primaires) dans un puits de l&#39;appareil </li><li> Planche 5 ul par petit appareil et 20 pi par appareil grands Note: Vous pouvez charger 10 pi de cellules sur le dessus de l&#39;appareil et 10 ul sur le fond de l&#39;appareil (la moitié du volume total), ou directement tous les 20 ul de cellules dans le bien supérieure Somal (5 pi dans le Somal dessus ainsi pour les petits appareils). </li><li> Incuber pendant 10 minutes dans un incubateur à 37 ° C pour les cellules peuvent commencer à attacher </li><li> Ajouter ul environ 150/30 de facteurs + NMB dans chaque puits selon la taille du dispositif de Remarque: Les volumes peuvent varier en fonction de l&#39;épaisseur du PDMS. Tout ce qui importe est que les puits sont pleins. </li></ol> Supplémentaire sur l&#39;utilisation des appareils sans plasma Collage Sans traiter le plasma, Christina Tu, un technicien, qui ne réussi chaque semaine sans plasma, dit il suffit de charger les cellules immédiatement. N&#39;oubliez pas de retirer le support des deux puits sur le côté Soma (côté axone sera pas grave si vous laissez les médias en). C&#39;est l&#39;écoulement du fluide qui permet aux cellules d&#39;entrer dans le chenal principal. Si vous avez des médias dans le puits, vous n&#39;obtiendrez pas l&#39;écoulement du fluide.

<ol><li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2128-2136 (2006).</li>
<li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Ici, nous a montré comment utiliser le neurone dispositif microfluidique sans avoir besoin d&#39;un nettoyeur à plasma. Nous nous référons à cette liaison que la non-plasma.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Réactif</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 184 avec agent de réticulation. Veuillez consulter Dow Corning pour trouver un fournisseur près de chez vous</td></tr><tr><td>Cornig No. 1 Cover Glass</td><td>Lame de couverture</td><td>Corning</td><td>Corning No. X2935 244</td><td>Disponible via Fisher Scientific, numéro de catalogue Fish 12-531D</td></tr><tr><td>B27</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Le supplément B27 est un additif propriétaire disponible chez Invitrogen dans leur gamme de réactifs Gibco pour la culture cellulaire.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>Le Glutamax est disponible chez Invitrogen dans leur gamme de réactifs Gibco pour la culture cellulaire.</td></tr><tr><td>60 mm Petri Dish</td><td>Outil</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13A</td><td>Des boîtes de Pétri stériles en polystyrène de 60 mm sont utilisées pour accueillir le dispositif fixé sur verre.</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1274</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50 ml Tube</td><td>Outil</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352098</td><td>Disponible via le numéro de catalogue Fisher Scientific 14-959-49A</td></tr><tr><td>BD Falcon 15 ml tube</td><td>Outil</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352097</td><td>Disponible via le numéro de catalogue Fisher Scientific 14-959-70C</td></tr></tbody></table>

non du plasma collage de pdms pour fabrication bon marché de dispositifs microfluidiques

Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices

Dans cette vidéo, nous montrent comment utiliser l&#39;appareil neurone microfluidique sans collage plasma. Dans certains cas il peut être souhaitable d&#39;appareils réversible obligataire au verre Corning n ° couvercle 1. Cela pourrait être dû, peut-être, un nettoyeur de plasma ne sont pas disponibles. Dans d&#39;autres cas, il peut être souhaitable de supprimer le périphérique du verre après la mise en culture des neurones à certains types de microscopie ou d&#39;immunomarquage, si elle n&#39;est pas nécessaire d&#39;enlever l&#39;appareil pour l&#39;immunocoloration depuis les neurones peuvent être colorées dans l&#39;appareil. Certains chercheurs, cependant, préfèrent encore pour supprimer le périphérique. Dans ce cas, le collage réversible de l&#39;appareil pour le couvercle en verre rend cela possible. Il ya certains inconvénients à la non-plasma collage des dispositifs dans ce pas aussi serré d&#39;un joint est formé. Dans certains cas, les axones peuvent croître sous les rainures plutôt que par eux. Aussi, parce que le verre et le PDMS sont hydrophobes, liquides ne sont pas facilement entrer dans le dispositif qui rend parfois nécessaire de forcer les médias et les autres réactifs dans l&#39;appareil. Liquides entreront dans le dispositif via l&#39;action capillaire, mais cela prend beaucoup plus de temps par rapport aux dispositifs qui ont été collés de plasma. Le nettoyeur plasma crée temporaires charges hydrophiles sur le verre et le dispositif qui facilitent l&#39;écoulement des liquides à travers le dispositif après le collage en quelques secondes. Pour les non-plasma appareils liés, le flux de liquide à travers les appareils prend plusieurs minutes. Il est également important de noter que les dispositifs pour être utilisé avec du plasma non collage doivent être stérilisés d&#39;abord, alors que les appareils plasma traité n&#39;ont pas besoin d&#39;être stérilisés avant leur utilisation, car le nettoyeur plasma va les stériliser.

Dans cette vidéo, nous montrent comment utiliser le neurone dispositif microfluidique sans collage plasma.

Non du plasma Collage de PDMS pour fabrication bon marché de dispositifs microfluidiques

Dans cette vidéo, nous démontrons comment utiliser le dispositif microfluidique pour neurones sans collage par plasma. Dans certains cas, il peut être souhaitable de réaliser un collage réversible...

Les laboratoires qui pratiquent couramment la photolithographie et la lithographie douce disposent généralement de ce qu'on appelle un nettoyeur à plasma. Un nettoyeur à plasma possède une bobine électrique qui crée un gaz partiellement ionisé composé d'électrons, d'ions, d'atomes et de molécules neutres. Le plasma génère des espèces réactives à la surface du verre et du dispositif, qui, lorsqu'ils sont mis en contact, formeront une liaison permanente.Le plasma rend également la surface du dispositif hydrophile, ce qui facilite l'ajout de liquides. Dans certains cas, toutefois, une liaison permanente et irréversible n'est pas souhaitable. De plus, de nombreux laboratoires n'ont pas accès à un nettoyeur à plasma.Pour répondre à cette préoccupation, nous allons aujourd'hui démontrer le collage réversible non plasmatique du dispositif neuronal au verre de couverture : les forces électrostatiques entre le PDMS et le verre forment un joint étanche à l'eau et adapté à la culture cellulaire. Je voudrais vous présenter Kiana Lee. Elle effectuera les démonstrations aujourd'hui.Les lamelles Corning numéro 1 de 24 millimètres sur 40 millimètres sont nettoyées à l'aide d'un bain ultrasonique d'eau. Les lamelles sont placées dans un support en acier inoxydable, qui est ensuite mis dans un récipient en verre rempli d'eau déionisée. Le récipient en verre est ensuite placé dans le bain ultrasonique.Les lames en verre sont ensuite soumises à une sonication pendant 30 minutes. Après la sonication, l'eau déionisée est évacuée du récipient en verre. Du 70 % éthanol est ajouté dans le récipient en verre contenant les lames, puis celui-ci est placé à l'intérieur d'une hotte de sécurité biologique standard afin de maintenir les lames stériles.Après rinçage à l'éthanol à 70 %, le porte-objets en acier inoxydable est retiré du récipient en verre et les lames de verre sont laissées sécher complètement pendant plusieurs heures ou toute une nuit. Ensuite, sous hotte de sécurité biologique, les lames de verre sont recouvertes de PLL en les immergeant dans un récipient rempli de solution de PLL. Les lames de verre restent immergées dans la solution de PLL pendant au moins trois heures ou toute une nuit.Après le revêtement au PLL, le liquide de PLL est retiré de la boîte, puis les lames de verre sont rincées soigneusement avec de l'eau déionisée. Après plusieurs rinçages des lames de verre recouvertes de PLL à l'eau, on remplit la boîte d'eau et on laisse les lames de verre tremper dans l'eau pendant plusieurs heures. Après une immersion de plusieurs heures dans de l'eau déionisée, l'eau est aspirée de la boîte.Les lames en verre seront rincées rapidement, puis retirées du plat et placées dans un porte-lames en acier inoxydable afin de sécher toute la nuit. Dans une hotte de sécurité, les dispositifs à neurones sont introduits dans la hotte et rincés soigneusement avec de l'éthanol à 70 % pour les stériliser. L'excès d'éthanol est ensuite aspiré depuis le dispositif. Les dispositifs sont ensuite laissés à sécher toute la nuit dans la hotte de sécurité le jour suivant.Cet appareil stérile pour neurones est simplement placé sur du verre propre, stérile et traité au PLL. Le PDMS forme avec le verre un bouchon réversible étanche aux liquides. L'appareil est fixé au verre par une pression douce ; les cellules ou les milieux sont ensuite ajoutés immédiatement à l'appareil.Attendre trop longtemps avant d'ajouter le milieu ou les cellules dans le dispositif après son assemblage peut rendre plus difficile l'entrée du liquide dans le dispositif. Il est important de noter que le liquide pénètre moins facilement et moins rapidement dans les dispositifs non traités au plasma que dans les dispositifs traités au plasma. Les dispositifs traités au plasma sont initialement hydrophiles ; juste après le traitement au plasma, les liquides s'écoulent facilement dans le dispositif hydrophile, tandis que l'écoulement à travers les dispositifs non liés par plasma est beaucoup plus lent.Dans certains cas, il peut être nécessaire d'utiliser une pipette pour forcer le liquide à pénétrer dans le dispositif. Dans cette vidéo, nous vous avons montré comment lier de manière non covalente le dispositif neuronal au verre de couverture. Il s'agit d'une méthode efficace et peu coûteuse pour fixer de façon réversible le PDMS sur des surfaces en verre.Nous espérons que cette vidéo vous a paru informative et utile. Voilà tout pour cette fois depuis le laboratoire John. Merci d'avoir regardé.

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