Traitement des tissus de tumeur cérébrale primaire pour les essais sur les cellules souches et les flux de tri

L’objectif global de cette procédure est d’étudier in vitro les cellules initiatrices de tumeurs cérébrales. Ceci est accompli en dissociant d’abord mécaniquement et enzymatiquement les tumeurs humaines primaires, puis en les cultivant dans des conditions de culture de sérum de cellules souches. La formation de la sphère suivante est surveillée pendant trois à cinq jours.

Les sphères tumorales sont ensuite à nouveau digérées par voie enzymatique et leurs marqueurs de surface sont évalués par cytométrie en flux. La dernière étape consiste à trier les cellules souhaitées en plaques de 96 puits ou en lames de grille PL pour une caractérisation plus approfondie. En fin de compte, la capacité d’auto-renouvellement et l’expression différentielle des gènes de la population triée peuvent être évaluées par analyse de dilution limitée et R-T-P-C-R sur cellule unique.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l’analyse des tumeurs en vrac, est qu’elle isole de manière prospective les cellules initiatrices de la tumeur cérébrale ou les populations de cellules souches cancéreuses. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons appliqué les conditions de culture utilisées à l’origine pour les cellules souches neurales normales à une variété de tumeurs cérébrales humaines, et avons constaté que cette méthode de culture spécifiquement sélectionnée pour les populations de type cellules souches démontrant la procédure sera par des étudiants diplômés associés de recherche postdoctorale CHITRA AL, Bran Van Manen et Sarah Nolte, et notre technicienne en cytométrie en flux Nicole McFarland, tous de notre laboratoire. Commencez par ajouter 200 microlitres de liase de décongélation à 15 millilitres de liquide céphalo-rachidien artificiel ou LCR A, puis placez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Amenez également la solution de chlorure d’ammonium à température ambiante à ce moment-là.

Ensuite, à cinq millilitres de LCR dans un récipient d’échantillon de tissu tumoral cérébral, faites tourner le récipient pour rincer, puis écoulez-le du liquide pour éliminer les globules rouges. Transférez maintenant le tissu dans une boîte de Pétri stérile de 100 millimètres et utilisez des ciseaux fins et des pinces pour désagréger le tissu jusqu’à obtenir une consistance de boue. Ensuite, prélevez l’échantillon à l’aide d’une pipette ordinaire de 10 millilitres et d’une pince et transférez les fragments de tissu dans le tube contenant le LCR A préchauffé.

Avec liaison, placez le tube sur un agitateur d’incubation à 30 tr/min et 37 degrés Celsius. Et puis, après 15 minutes, filtrez le lysat tissulaire à travers une crépine de cellules de sept micromètres D dans un tube conique de 50 millilitres. Faites tourner le filtrat pendant cinq minutes à 280 GS à température ambiante.

Ensuite, retirez soigneusement le piège et évaluez la taille et la couleur de la pastille résultante. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans un millilitre de PBS, puis ajoutez une quantité appropriée de solution de chlorure d’ammonium en fonction de la taille de la pastille et de la contamination par les globules rouges. Ensuite, après une incubation de cinq minutes à température ambiante, faites tourner les cellules après un deuxième lavage dans du PBS, remettez la pastille en suspension dans cinq millilitres de milieu complet de cellules souches neurologiques, puis transférez la suspension cellulaire dans une plaque de culture tissulaire de 60 millimètres à liaison ultra-faible pendant les premiers jours.

Complétez les cultures avec un à deux millilitres de substrat au besoin, en ne changeant le substrat que lorsque la couleur devient légèrement jaune. Commencez par transférer la culture sphéale tumorale dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez deux à trois millilitres de PBS stérile pour rincer soigneusement la plaque, puis ajoutez le lavage dans le tube de pulvérisation de la tumeur.

Après avoir fait tourner les cellules, retirez le snat et remettez la pastille en suspension dans un à deux millilitres de PBS stérile, puis ajoutez 10 microlitres de liaison. L’un des défis de cette technique est de maintenir la viabilité des cellules souches tumorales solides pendant le traitement. Toute manipulation des cellules pendant la culture et la sation nécessite un toucher doux.

Ensuite, incubez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Après trois minutes, retirez et évaluez visuellement la suspension. Si plusieurs amas sont observés, utilisez une pointe de pipette de 1000 microlitres pour itérer doucement l’amas de cellules.

Lavez maintenant les cellules dans cinq millilitres de PBS stérile, puis, après avoir retiré le surnageant S, remettez la pastille en suspension dans 500 à 1000 microlitres de PBS stérile plus deux millimolaires d’EDTA. Enfin, après avoir évalué le nombre de cellules et la viabilité à l’aide du bleu Trian, ajustez le nombre de cellules à 1 million de cellules par millilitre en PBS plus EDTA. Commencez par transférer 100 microlitres de suspension de cellule par test dans des tubes à débit individuels de 12 x 75 millimètres.

Après avoir ajouté les anticorps appropriés, incubez les échantillons sur de la glace pendant 30 minutes, puis éliminez tout anticorps non lié dans deux millilitres de PBS plus EDTA par tube. Maintenant, décantez la solution de lavage, épongez les tubes, puis remettez en suspension les granulés de cellules dans 300 microlitres supplémentaires de PBS plus EDTA. Ajoutez ensuite 10 microlitres des sept colorants de viabilité A a D dans chaque tube.

Après avoir incubé les tubes pendant au moins 15 minutes sur de la glace, les cellules sont prêtes pour l’analyse cytométrique en flux. Après avoir utilisé l’échantillon de contrôle négatif pour ajuster les paramètres de diffusion directe et latérale, dessinez une région autour des cellules d’intérêt similaire à celle illustrée dans ce graphique représentatif du haut. Ajustez la tension sur les détecteurs de fluorescence utilisés pour placer les cellules négatives dans les deux premières décennies si nécessaire.

Ensuite, utilisez le colorant de viabilité sept A a d pour créer une deuxième région d’exclusion des cellules mortes similaire à la région montrée dans ce graphique supérieur représentatif. Appliquez ensuite les portes de diffusion et de cellule vivante à tous les tracés de fluorescence et utilisez les commandes colorées uniques pour soustraire tout chevauchement spectral. Enfin, exécutez les échantillons.

Commencer l’essai de dilution limite en triant les cellules dissociées à une dilution variable à une seule cellule par puits dans des puits individuels d’une plaque de 96 puits contenant 200 microlitres de NSC media Les neurosphères se forment généralement sur une période de sept jours et le taux de formation ultérieure de sphères au cours des sept derniers jours en culture peut être calculé pour une cellule unique R-T-P-C-R. Après avoir trié les cellules individuelles des populations d’intérêt sur les sites de réaction d’une lame à grille ample, ajoutez un microlitre de mélange principal au centre de chaque site de réaction, puis enduisez immédiatement chaque site de cinq microlitres de solution de plafond. Ensuite, à l’aide d’un cycleur à glissière à grande vitesse, incubez la glissière pendant trois cycles de température.

Après la transcription inverse, ajoutez trois microlitres d’eau sans rase de DN a à chaque site de réaction. Transférez ensuite l’intégralité du mélange de chaque site de réaction dans des tubes PCR individuels. Enfin, pour une quantification en temps réel, analysez les échantillons sur un cycleur BioRad.

Cette première figure montre une imagerie par résonance magnétique d’un patient représentatif atteint de glioblastome. Les cellules tumorales dissociées peuvent être marquées à l’aide des marqueurs de cellules souches de surface neurale, CD 1 33 et CD 15, et analysées par cytométrie en flux, comme le montre ce graphique à points représentatif. Ici, le graphique d’amplification pour la réaction R-T-P-C-R représentative d’une cellule unique est illustré.

Les valeurs CT obtenues à partir d’un tel graphique peuvent être utilisées pour calculer les niveaux d’expression relatifs des gènes d’intérêt. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de dissocier et de cultiver enzymatiquement le tissu tumoral cérébral primaire pour enrichir les populations de cellules souches. Vous saurez également comment étudier la capacité d’auto-renouvellement et l’expression génique différentielle de populations de cellules souches triées en effectuant une analyse de dilution limite ou une cellule unique R-T-P-C-R.