Name: Production, de conditionnement, et la caractérisation des cellules invasives Espèces protéine DISC1 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 33 s
Description: Découvrez la production et la purification d'agrégats de protéine DISC1 capables d'envahir les cellules réceptrices. Cette méthode permet d'étudier l'invasion cellulaire par microscopie confocale.

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Ce travail a été financé par NEURON-ERANET DISCover (BMBF 01EW1003) à CK et JPH, DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) à CKVB est soutenu par une subvention de l&#39;Forschungskommission de la Faculté de médecine de l&#39;Université de Düsseldorf.

1. Préparation des cellules donateurs Aggresome: Transfection de monomère Red Fluorescent Protein (mRFP) ou Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP)-Longueur étiqueté humain complet (FL) DISC1 <ol><li> Graine de 1,5 x 10 6/10 cm neuroblastome humain plat NLF (NLF; Hôpital pour enfants de Philadelphie, Philadelphie, PA) des cellules dans dix boîtes de 10 cm et se développer durant la nuit. Cellules du FLN sont cultivées dans du RPMI-1640 supplémenté avec 10% de FBS, pénicilline / Strepomycin, L-glutamine. Le lendemain, les cellules doivent être à 70-80% de confluence. </li><li> Transfecter de manière transitoire chaque plat 10 cm avec 15 pg d&#39;ADN plasmidique et réactif de transfection Metafectene (Biontex, Martinsried, Allemagne). En bref, pour un plat de 10 cm, 15 ug d&#39;ADN plasmidique et 30 Metafectene ul ont été ajoutés à 750 ul d&#39;Opti-MEM, mélangés et incubés à température ambiante pendant 20 min. 5 plats ont été transfectées avec pcDNA3.1 mRFP / eGFP-étiquette de l&#39;homme (FL) DISC1 et 5 plats avec le seul eGFP-plasmide. </li></ol> 2. AggresomePurification à partir de cellules transfectées donateurs Le protocole décrit ici est une combinaison d&#39;une méthode pour purifier Lewy-organismes à partir du 13 tissu cérébral et un protocole pour isoler gros agrégats et aggresomes 14. Puisque les méthodes existantes sont basées sur l&#39;utilisation de détergents, l&#39;isolement des sans détergent protéines pour l&#39;application dans la cellule-invasif des tests est cruciale. <ol><li> 48 heures après la transfection, contrôler l&#39;expression de eGFP et mRFP/eGFP-DISC1 et confirmer la formation de aggresomes sous un microscope à fluorescence (Figure 1). </li><li> Laver les cellules avec du PBS pH 7,4, gratter avec 400 ul de PBS chacun, ajouter 1X cocktail inhibiteur de la protéase (Roche, Indianapolis, IN) et de perturber les cellules en utilisant un homogénéisateur Precellys24 (Bertin Technologies, France). En bref, ajouter 1 ml de suspension cellulaire à un tube de 2 ml lyse et ajouter 10 billes de céramique. Lyse des cellules avec 3 impulsions x 60 sec. La force mécanique du processus peutaugmenter la température à l&#39;intérieur de l&#39;échantillon supérieure à 37 ° C si les soins doivent être prises pour refroidir l&#39;échantillon sur la glace après la procédure de lyse. </li><li> Refroidir les cellules sur de la glace et ajouter 10 mM MgCl 2, 40 U / ml de DNase A et incuber pendant 60 min à 37 ° C </li><li> Préparer des solutions de 80%, 50%, de saccharose 20% (p / v) dans du PBS pH 7,4 (10 ml de chaque). </li><li> Préparer le gradient de saccharose dans un tube Falcon de 15 ml à partir de 2 ml de saccharose à 80%, puis 50% et 20%. Verser lentement la pente et faire attention à ne pas déranger les couches déjà versé. Le lysat digéré couche au-dessus de la pente et centrifuger pendant 15 min à 1000 xg à 4 ° C. </li><li> Recueillir soigneusement l&#39;interphase entre la couche de saccharose 50-80% avec une pipette et mélanger avec 5 volumes de PBS pH 7,4. Centrifuger pendant 15 minutes à 1000 xg à 4 ° C. Répétez laver deux fois de plus. Dans cette interphase, aggresomes sont fluorescentes et peuvent être visualisées au microscope sous lumière UV. </li><li> Jeter le surnageant etremettre en suspension le culot dans du PBS pH 250-500 ul 7.4. Ce culot contient le aggresomes purifiée (Figure 2). </li></ol> 3. Traitement des bénéficiaires cellules SH-SY5Y avec mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes <ol><li> Graine 5 x 10 4 bénéficiaires SH-SY5Y cellules de neuroblastome humain exprimant de manière constitutive la GFP-DISC1 (598-854) sur des lamelles de verre stériles dans chaque puits d&#39;une plaque à 24 puits. SH-SY5Y cellules sont cultivées dans un milieu supplémenté avec DMEM/F-12 pénicilline / streptomycine, non-acides aminés essentiels (AANE) et 10% de FBS. </li><li> 24 heures plus tard, ajouter 10 ul à chaque puits et incuber pendant 48-72 h. </li><li> Laver les cellules avec du PBS 3 x pH 7,4 et éteindre la fluorescence extracellulaire avec 0,04% bleu trypan pendant 5 min. </li><li> Fixer les cellules avec 4% de PFA dans du PBS pH 7,4 pendant 10 min sur la glace, laver une fois avec H 2 O stérile et monter les lamelles sur des lames de verre avec ProLong or avec DAPI milieu de montage (Invitrogen, USA). </li><li> Confirmer l&#39;absorption /invasion de manière exogène aggresomes appliquées par colocalisation avec des protéines exprimées par des cellules recrutées bénéficiaires à Z-stack images. </li></ol> Pourtant, l&#39;adoption / l&#39;invasion de la protéine exogène peut ne pas être détecté essentiellement en parallèle avec le recrutement de protéine de cellule hôte. Dans notre exemple mRFP-étiqueté DISC1 aggresomes recrue soluble GFP-étiqueté DISC1 (598-854) protéine exprimée par la cellule hôte (voir figure 3). Les photos ont été prises sur une confocal Zeiss LSM 510 ou un microscope Zeiss AxioVision Apotome2. 4. Génération de DISC1 recombinant (598-785) Dans une publication précédente, nous avons analysé la capacité de divers fragments de protéine DISC1 à l&#39;auto-interaction basée sur la présence d&#39;auto-association domaines. Parmi toutes les protéines humaines fragments testés DISC1 (598-785) affiché la plus forte propension à la multimérisation 4 (figure 4). Par conséquent, l&#39;homme DISC1 (598-785) a été cloné dans pET15b (Nonvagen, Madison, Wisconsin) contenant un tag 6-histidine N-terminale, exprimé dans E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, États-Unis), et purifiée dans des conditions dénaturantes à 8 mol / l d&#39;urée, comme décrit 4. En bref, le protocole est décrit ci-dessous. <ol><li> BL21-(IDE3) Rosetta E. coli ont été cultivées dans 2 x 500 ml 2YT contenant 5 mM-arginine-HCl, 5 mM MgSO4, 100 pg / ml carbénicilline, 35 pg / ml de chloramphénicol jusqu&#39;à une DO 600: 0.6-0.8 et DISC1 (598-785) l&#39;expression a été induite avec 1 mM d&#39;IPTG. </li><li> DISC1 (598-785) a été exprimé pendant 4 heures à 37 ° C, l&#39;expression a pris fin en récoltant les bactéries par centrifugation. </li><li> Le culot bactérien est remis en suspension dans 50 ml de tampon TE (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) et 2 mM de PMSF, 1% de TX-100, 250 pg / ml de lysozyme, 20 mM de MgCl2 et 400 U/50 ml DNase I. Pour assurer une lyse complète, la réaction a été incubée pendant 30 min à température ambiante avec agitation douce. </li><li> Ajouter 10 mM β-mercaptooethanol (ME) et 500 mM de NaCl et incuber pendant 30 min supplémentaires. </li><li> Isoler des corps d&#39;inclusion bactériens à 20.000 g pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Resuspendre le culot dans 50 ml de tampon d&#39;extraction contenant 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM d&#39;imidazole, 500 mM de NaCl, 8 M d&#39;urée et 10 mM β-ME et enlever les débris par centrifugation à 20,000 g pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Laver le Ni-NTA agarose matrice avec un tampon d&#39;extraction. Incuber la suspension d&#39;, extrait de protéine précontrôlés avec matrice Ni-NTA pendant 2 heures à température ambiante. </li><li> Laver la matrice Ni-NTA avec un tampon d&#39;extraction contenant 12 mM d&#39;imidazole. </li><li> Éluer la protéine lentement avec 15 ml de tampon d&#39;élution contenant 50 mM de Tris, 500 mM NaCl, 300 mM d&#39;imidazole, urée 8 M, PMSF 1 mM, 5 mM d&#39;EDTA et 10 mM de β-ME. </li><li> Dialyser la protéine par étapes pour PBS pH 7,4 contenant 10 mM de β-ME. </li></ol> De 1 L de culture bactérienne de départ, il est possible d&#39;isoler jusqu&#39;à 50 mg de recombinaison DISC1 (598-785) protein. α-synucléine repliement Pour les expériences avec α-synucléine, 500 ug de la protéine recombinante (Sigma-Aldrich, USA) a été dissous dans du PBS à une concentration de 1 mg / ml. Pour obtenir des oligomères, repliement a été effectuée durant la nuit à 37 ° C comme décrit dans une publication précédente 10. 5. L&#39;étiquetage des DISC1 recombinant (598-785) avec DyLight594 <ol><li> Avant le processus de repérage ultérieur, DISC1 (598-785) protéine a être libéré de la β-ME. Par conséquent, la protéine est dialysée 3 fois au PBS pH 7,4 à une dilution de 1:2000. </li><li> Étiquette 1 mg DISC1 (598-785) avec DyLight 594 maléimide (Thermo Scientific, USA) selon les instructions du fabricant. En bref, dissoudre 1 mg / ml de protéine dans du PBS pH 7,4 et ajouter 5 PTCE mM de récupérer des groupes thiols libres. Ajouter 20 ul du colorant DMF dissous à la réaction et incuber pendant 2 heures à température ambiante. </li><li> Dialyser la protéine 3 x à PBS pH7,4 dans un rapport de 1:2000 à 2 heures chacune. </li></ol> Pour augmenter encore la pureté de la protéine marquée d&#39;une étiquette 6-Son affinité basée sur la purification sur une colonne de Ni-NTA est effectuée. <ol start="4"><li> Lavez 1 ml matrice Ni-NTA (Qiagen, Allemagne) avec 10 ml de PBS pH 7,4. </li><li> Appliquer l&#39;étiquette, protéine dialysée à la colonne et le laisser tourner au-dessus de la colonne lentement. </li><li> Laver la protéine avec 3 x 20 ml de PBS pH 7,4 </li><li> Éluer la protéine avec du PBS pH 7,4, 500 mM d&#39;imidazole, goutte à goutte, tout en surveillant la bande de couleur sur la colonne Ni-NTA à réduire le volume de l&#39;éluat. </li><li> Dialyser l&#39;éluat de 3 x à 10 mM NaPi pH 7,4 à une dilution de 1:2000 pendant 2 heures chacune. </li><li> Utiliser une seringue stérile 0,45 um filtre pour filtrer l&#39;éluat, aliquote de 5 x 100 pi des échantillons et congeler pression dans l&#39;azote liquide. Le montant total des protéines doit être de 0,5 à 1 mg / ml dans chaque aliquote de 100 ul. </li></ol> option concentrtion étape <ol start="10"><li> Pour les injections stéréotaxiques rat, la protéine a été concentrée 10 fois dans un speed-vac (Concentrateur Eppendorf 5301). L&#39;état tampon final était de 100 NaPi mM. </li></ol> α-synucléine étiquetage Le marquage et de purification (colonne Ni-NTA) de la α-synucléine recombinante a été réalisée en parallèle à DISC1 (598-785). Le total du matériau de départ était 500 pg au lieu de 1 mg pour DISC1 (598-785). 6. Traitement des bénéficiaires cellules SH-SY5Y avec marqué DISC1 recombinant (598-785) Protéine <ol><li> Semences 5x10 4 bénéficiaires SH-SY5Y cellules de neuroblastome humain exprimant de manière constitutive la GFP-DISC1 (598-854) sur des lamelles de verre stériles dans chaque puits d&#39;une plaque à 24 puits. </li><li> Ajouter protéine marquée au milieu de culture cellulaire à une concentration de 5-10 pg / ml et incuber pendant 48-72 h. </li><li> Laver les cellules avec du PBS 3 x pH 7,4 et étancher extractionfluorescence ellular avec 0,04% bleu trypan pendant 5 min. </li><li> Fixer les cellules avec 4% de PFA dans du PBS pH 7,4 pendant 10 min sur la glace, laver une fois avec H 2 O stérile et monter les lamelles sur des lames de verre avec ProLong or avec DAPI milieu de montage (Invitrogen, USA). </li><li> Confirmer l&#39;adoption / l&#39;invasion de manière exogène appliquée protéine recombinante par colocalisation avec des protéines exprimées par des cellules recrutées bénéficiaires à Z-stack images générées par microscopie confocale à balayage laser. Pourtant, le recrutement de protéine endogène peut pas être détectée essentiellement en parallèle avec l&#39;invasion de protéine de cellule hôte, Z-stack images peut encore confirmer le caractère invasif de la protéine. </li></ol> Dans notre exemple, rec. DISC1 (598-785) * au moins en partie soluble recrues GFP-étiqueté DISC1 (598-854) protéine exprimée par la cellule hôte (voir figure 5A). Pour recombinant invasion α-synucléine, mais aucun recrutement est montré (figure 5B). Les photos ont été prisessur un Zeiss LSM 510 confocal Zeiss ou un microscope AxioVision Apotome2. L&#39;injection du concentré (environ 4 pi de 2,5 pg / pl), étiqueté DISC1 (598-785) * dans les résultats Mpfc dans la diffusion de la protéine autour du site d&#39;injection qui peut être détecté même après la perfusion de l&#39;animal avec 4% dans du PBS pH 7,4 PFA avec un filterset rhodamine. Dans notre exemple DISC1 (598-785) est repris par un nombre distinct de neurones et peut être contrôlé avec Z-stack d&#39;imagerie (figure 6). En général, l&#39;injection de protéines autres que celles utilisées ici ne conduisent pas nécessairement à la cellule-invasion. L&#39;événement invasion dépend essentiellement de la nature de la protéine néanmoins une purification propre est une condition préalable à une analyse plus approfondie. 7. Les résultats représentatifs Aggresomes consistant recombinant FL DISC1-eGFP purifiée à partir de cellules du FLN a envahi destinataire SH-SY5Y CElls à faible rendement (environ 0,3% 5) comme on le voit par la colocalisation en microscopie confocale (figure 3). Comme indiqué précédemment, DISC1 (598-785) exprimée et purifiée à partir de E. coli formée multimères 4 sont également des cellules invasives dans un rendement d&#39;environ 20% 5 (figure 5A) similaire à celui de α-synucléine qui a été utilisé en parallèle comme contrôle positif (figure 5B). Étiquetés DISC1 recombinant (598-785) exprimée et purifiée à partir de E. coli a également été cellulaire invasive pour les neurones in vivo lorsque la protéine multimérique a été stéréotaxique injecté dans le cortex médial préfrontal de rat (figure 6; Pum, Bader, Huston, Korth, non publié). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Cellules de neuroblastome FNL exprimant de manière transitoire FP-DISC1 (rouge). Red aggresomes fluorescents peuvent être detela Direction exécutive dans les cellules. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Purifiée mRFP-marqué DISC1 aggresomes après la purification dans un gradient de saccharose. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Fluorescent image de aggresomes envahies. mRFP-étiquette flDISC1 aggresomes ont été purifiées et incubées avec des cellules de neuroblastome SH-SY5Y surexprimant GFP soluble étiquetée DISC1 (598-854). Un apport de aggresomes étiquetés est contrôlée par Z-stack imagerie sur un microscope à balayage laser (Zeiss LSM 510). <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. SEC profil de rec. DISC1 (598-785) contenant le S704 et C704 les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP). Les deux variantes montrent une perturbation d&#39;oligomérisation commandé et la formation de mult haut poids moléculaireIMERS (flèche rouge). Cette image est modifié à partir de la publication de Leliveld et al., Biochemistry 2009. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Fluorescent Z-stack image de DyLight marqué invasive DISC1 recombinant (598-785). Les cellules de neuroblastome SH-SY5Y exprimant la GFP-DISC1 soluble (598-854) ont été incubées avec étiquette, la protéine recombinante à une concentration de 5 pg / ml. (A) des agrégats Rouge montre l&#39;invasion de rec. DISC1 (598-785) des protéines et des points jaunes indiquent un recrutement de GFP-DISC1 soluble (598-854) en agrégats. (B) recombinante α-synucléine (rouge) envahit les cellules sans recrutement avec une fréquence d&#39;environ 20%. <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="Figure 6" /> Figure 6. Image immunofluorescence del&#39;injection marqué, DISC1 recombinant (598-785) de protéine. Z-stack imagerie confirme la présence de rec. DISC1 (598-785) des protéines dans les neurones corticaux de rat tachés avec un anticorps contre les noyaux des neurones (NeuN, vert).

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans cette étude, nous décrivons la purification de mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes à partir d&#39;une lignée cellulaire de neuroblastome transfectée, la préparation et l&#39;étiquetage d&#39;un DISC1 espèces de protéines recombinantes et leur application dans la cellule à l&#39;invasion de cellules réceptrices des expériences in vitro et in vivo. La purification des indigènes mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes a été développé à partir de protocoles d&#39;isoler le corps de Lewy-comme les structures et les grands agrégats 13, 14, mais modifié pour éviter l&#39;utilisation de détergents et de minimiser le risque de faux positif cellulaire invasion qui pourrait se produire due à la pénétration de la membrane détergent facilitée. Une amélioration future possible pourrait être la pour augmenter encore la pureté des aggresomes par sonication de séparer complètement les membranes restantes et du cytosquelette des aggresomes. Par la pureté générale à la hausse, le nombre d&#39;événements d&#39;invasion totale à celui enregistré pour les grandes aggresomes may être augmenté de 5. Que la définition limitée de notre suggère 3-phase de saccharose est suffisante pour aggresomes d&#39;espèces autres protéines doit être testé, en ce sens, le protocole décrit ici doit être considérée comme un point de départ pour l&#39;optimisation individuelle. Les aggresomes purifiés s&#39;est avéré très robuste dans nos mains, les étapes de lavage supplémentaires (sans détergent) pour éliminer les traces de saccharose n&#39;a pas réduit significativement le rendement global. Dans une publication précédente, nous avons décrit cette assemblée oligomère de DISC1 dépend domaines de multimérisation distinctes dans l&#39;extrémité C-terminale 4 (figure 4). Nous avons choisi ce fragment pour l&#39;expression recombinante soluble dans E. coli et ultérieures et Ni-NTA purification. Pour surveiller son multimérisation et de comparer son caractère invasif de cellules avec un cellulaire invasive décrite comme la protéine α-synucléine, nous avons appelé DISC1 (598-785) avec le colorant fluorescent DyLight594, et ont comparé soncellules envahissant avec celle de tout aussi marqué α-synucléine. La cellule-invasif de la recombinaison DISC1 fragment a été considérablement augmenté par rapport à celui des indigènes, pleine longueur DISC1 aggresomes, probablement en raison de sa petite taille et la pureté beaucoup plus élevé. Encore une fois, la pureté semble jouer un rôle décisif dans la cellule-invasif. Dans notre exemple, les aggresomes invasives recruté protéine homologue soluble de la lignée cellulaire cible qui a été exprimée sous forme recombinante soluble dans un, c&#39;est à dire des cellules sous forme dispersée. L&#39;expression d&#39;une protéine fluorescente (GFP ou RFP, par exemple) dans la ligne de cellule receveuse est un avantage, car il permet la co-localisation de aggresomes invasives et de protéines recombinantes à l&#39;intérieur de la limite de cellule receveuse par Z-pile imagerie. Aggresomes DISC1 cellules invasives et des fragments multimères exprimée et purifiée à partir de E. coli pourrait être un élément déterminant de la protéine de conformation d&#39;une des maladies liées à DISC1, DISC1opathies 15. Inconvénients et remèdes: Faible rendement aggresome après purification sur gradient de saccharose: Le gradient de saccharose introduit dans ce protocole fonctionne bien avec eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes. Aggresomes comprenant d&#39;autres protéines peuvent être de dimensions variables par conséquent, les concentrations en saccharose doit être optimisée par d&#39;autres utilisateurs. Purification insuffisante de protéines recombinantes: Des contaminants bactériens dans le procédé de purification de la protéine recombinante est également marqué dans les étapes ultérieures du protocole. Pour éviter les contaminations, exécutez la protéine sur une SDS-PAGE et confirmer que la protéine recombinante est d&#39;au moins 95% de pureté par coloration de Coomassie-Bleu. Pour assurer la meilleure qualité et le rendement, le protocole doit être optimisée pour chaque protéine individuelle. Faible étiquetage efcacité de protéines recombinantes: Des contaminations qui contiennent les groupes SH libres diminue marquage efficace de la protéine. Par conséquent, une dialyse extensive et Ni-NTA de purification à base est obligatoire.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td> Milieu est fonction de la lignée cellulaire hôte. La ligne du destinataire optimale cellule doit être déterminée par l&#39;utilisateur. </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-033 </td><td> Milieu est fonction de la ligne de cellule receveuse. La ligne du destinataire optimale cellule doit être déterminée par l&#39;utilisateur. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td> D&#39;autres réactifs de transfection pourrait fonctionner aussi bien mais n&#39;ont pas été testés avec notre protocole. </td></tr><tr><td> Ni-NTA agarose </td><td> Qiagen </td><td> 30210 &lt;/ Td&gt; <td> Les expériences ont été faites avec Ni_NTA agarose de Qiagen, d&#39;autres fournisseurs devrait fonctionner aussi bien. </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td><td> Il n&#39;est pas nécessaire de DNase RNase dans le processus de purification aggresomes. </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-062 </td><td> Milieu sans sérum fonctionne aussi bien </td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td> Supplément pour SH-SY5Y et moyennes NLF </td></tr><tr><td> Non essentielle-amino-acides (NEAA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> Supplément pour SH-SY5Y moyen </td></tr><tr><td> Bleu trypan 0,4% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td> Réactif toxique </td></tr><tr><td> DyLight 594 Maleimide </td><td> Thermo Fisher Scientific- </td><td> 46608 </td><td> Réduction de colorant réactif cystéine pour former des liaisons thioéther stables. Egalement disponible dans d&#39;autres couleurs. </td></tr><tr><td> ProLong or avec DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36935 </td><td> Ce milieu de montage liquide antifade a donné des résultats supérieurs à nos mains. </td></tr><tr><td> Cocktail inhibiteur de la protéase </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Dissoudre 1 table dans 500 pl H 2 O pour solution 100X. </td></tr><tr><td> Synthétique a-synucléine </td><td> Sigma </td><td> S7820 </td><td> Replier comme décrit dans le texte. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Table de réactifs spécifiques. </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td> Bertin Technologies </td><td> 03119.200.RD000 </td><td> Nous n&#39;avons pas testé les autres homo mécaniquenizers autres que cela. Autre méthode d&#39;homogénéisation sans détergent pourrait fonctionner aussi bien, mais n&#39;ont pas été testés pour ce protocole. </td></tr><tr><td> 5301 Concentrateur (speedvac) </td><td> Eppendorf </td><td> 5301 000.210 </td><td> Uniquement nécessaire si la protéine doit être concentré. </td></tr><tr><td> LSM 510 et AxioVision Apotome2 </td><td> Zeiss </td><td> Consultez le catalogue des fabricants </td><td> Les deux microscopes abriter la possibilité d&#39;effectuer Z-stack imagerie. Il s&#39;agit d&#39;une condition préalable pour l&#39;évaluation solide et sérieuse des événements d&#39;invasion. </td></tr><tr><td> Matière plastique de culture cellulaire </td><td> Nunc </td><td> Boîtes de 10 cm # 172958, plaques à 24 puits # 142475 </td><td> L&#39;utilisation d&#39;une matière plastique différente pourrait influencer l&#39;interaction de protéines recombinantes ou aggresomes et les surfaces en plastique. Nous n&#39;avons pas testé d&#39;autres matériaux que ceux décrits ici. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Table des matières spécifiques et des équipements. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Nom du tampon </td><td> teneur </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Milieu de croissance bactérienne </td><td> 16 g / l de Bacto Tryptone, 10 g / l d&#39;extrait de levure Bacto, 5 g / l de NaCl, 5 mM-arginine-HCl, 5 mM MgSO4, 100 pg / ml carbénicilline, 35 pg / ml de chloramphénicol </td><td> Cultiver des bactéries à DO 600: 0.6-0.8 induire l&#39;expression avec 1 mM d&#39;IPTG. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Tampon de resuspension bactérienne </td><td> 50 mM Tris-HCl pH 8,0, EDTA 5 mM, 2 mM de PMSF, 1% de TX-100, 250 pg / ml de lysozyme, 20 mM de MgCl2 et 400 U/50 ml de DNase I </td><td> Resupend culot bactérien de 1 L overnight culture dans 50 ml de tampon de remise en suspension. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Tampon d&#39;extraction des protéines </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM d&#39;imidazole, 500 mM de NaCl, 8 M d&#39;urée et 10 mM b-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4. </td><td> Ni-NTA colonne de tampon de lavage </td><td> 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM d&#39;imidazole, 500 mM de NaCl, 8 M d&#39;urée et 10 mM b-ME, 12 mM imidazole </td><td> Tampon d&#39;extraction de modification avec 12 mM d&#39;imidazole ajouté. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Ni-NTA tampon d&#39;élution colonne </td><td> Tris 50 mM, NaCl 500 mM, 300 mM imidazole, urée 8 M, PMSF 1 mM, EDTA 5 mM et 10 mM de b-ME </td><td> Le tampon d&#39;élution contient 10 mM b-ME, qui est dialysée par la suite. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> PBS </td><td> 8 g / l de NaCl, 0,2 g / l de KCl, 1,44 g / l de Na 2 HPO 4, 0,24 g / l de KH 2 PO 4, ajuster le pH à 7,4 </td><td></td></tr><tr><td>7. </td><td> Étiquetage tampon </td><td> PBS contenant 5 mM PTCE </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Table des recettes. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

production, de conditionnement, et la caractérisation des cellules invasives espèces protéine disc1

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

L&#39;agrégation des protéines est considérée comme une caractéristique générale des affections chroniques dégénératives du cerveau comme, par exemple, dans les maladies neurodégénératives maladie d&#39;Alzheimer (Aß, tau), la maladie de Parkinson (α-synucléine), la maladie de Huntington (polyglutamine, la huntingtine), et d&#39;autres. L&#39;agrégation des protéines est supposée se produire en raison de protéostasie perturbé, c&#39;est à dire le déséquilibre entre l&#39;apparition et la dégradation des protéines mal repliées. Fait à noter, ces mêmes protéines agrégées trouvé dans les formes sporadiques de ces maladies qui sont mutant dans des variantes rares formes familiales. La schizophrénie est une maladie cérébrale chronique progressive qui dans de nombreux cas va de pair avec un déficit cognitif permanent et irréversible. Dans une approche gène candidat, nous avons examiné si Disrupted en schizophrénie 1 (DISC1), un gène cloné dans une famille écossaise avec une liaison à une maladie mentale chronique 1, 2, n&#39;a pu être trouvée sous forme d&#39;agrégats insolubles dans le brain des cas sporadiques de schizophrénie 3. Utilisation du CC SMRI, nous avons identifié chez environ 20% des cas avec CMD mais pas des contrôles normaux ou des patients atteints de maladies neurodégénératives immunoréactivité DISC1 sarkosyl insoluble dans l&#39;après fractionnement biochimique. Des études ultérieures ont révélé in vitro que la propension agrégation des DISC1 a été influencé par la maladie associée au polymorphisme S704C 4, et que DISC1 aggresomes générées in vitro étaient cellulaire invasive 5, similaire à ce qui avait été montré pour Aß 6, tau 7-9, α -synucléine 10, polyglutamine 11 ou SOD1 agrégats 12. Ces résultats nous ont incités à proposer au moins un sous-ensemble des cas de CMD, ceux qui DISC1 agrégée peut-être des troubles de protéines de conformation. Ici, nous décrivons comment nous générons DISC1 aggresomes dans les cellules de mammifères, les purifier sur un gradient de saccharose et de les utiliser pour la cellule-invasif studies. De même, nous décrivons comment nous générons une exclusivité multimérique C-terminale DISC1 fragment, l&#39;étiquette et le purifier pour les études invasif des cellules. Utilisation des multimères recombinés de DISC1 nous atteignons invasion cellulaire similaire à celle d&#39;une dénomination semblable synthétique α-synucléine fragment. Nous montrons également que ce fragment est repris in vivo lorsque stéréotaxique injecté dans le cerveau des animaux receveurs.

L&#39;invasion de la génération, de la purification et de la cellule de cytoplasmiques intracellulaires, aggresomes protéine pleine longueur DISC1 de cultures de cellules et d&#39;une étiquette, multimérique recombinante DISC1 fragment de protéine dans<em&gt; E. coli</em&gt; Sont décrits. Invasivité de cellules est indiquée pour les cellules réceptrices en culture cellulaire et pour les neurones<em&gt; In vivo</em&gt; Après l&#39;inoculation stéréotaxique du cerveau.

Production, de conditionnement, et la caractérisation des cellules invasives Espèces protéine DISC1

L'agrégation protéique est considérée comme une caractéristique générale des affections cérébrales dégénératives chroniques, comme c'est le cas, par exemple, dans les maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer (Aβ, tau), la maladie de Parkinson (α-synucléine), la maladie de Huntington (polyglutamine, huntingtine) et d'autres. On pense que l'agrégation protéique se produit en raison d'une perturbation de la protéostase, c'est-à-dire d'un déséquilibre entre l'apparition et la dégradation des protéines mal repliées. Il est à noter que les mêmes protéines se retrouvent agrégées dans les formes sporadiques de ces maladies que dans les formes familiales rares où elles sont mutées. La schizophrénie est une affection cérébrale progressive et chronique qui s'accompagne, dans de nombreux cas, d'un déficit cognitif permanent et irréversible. À l'aide d'une approche par gène candidat, nous avons cherché à savoir si DISC1 (Disrupted-in-schizophrenia 1), un gène cloné dans une famille écossaise présentant un lien avec une maladie mentale chronique1, 2, pouvait être retrouvé sous forme d'agrégats insolubles dans le cerveau de cas sporadiques de schizophrénie3. En utilisant le SMRI CC, nous avons identifié, après fractionnement biochimique, une immunoréactivité de DISC1 insoluble au sarkosyl dans environ 20 % des cas de maladie mentale chronique (CMD), mais pas chez les témoins normaux ni chez les patients atteints de maladies neurodégénératives. Des études ultérieures in vitro ont révélé que la propension de DISC1 à s'agréger était influencée par le polymorphisme S704C associé à la maladie4, et que les aggresomes de DISC1 générés in vitro étaient invasifs pour les cellules5, similairement à ce qui avait été démontré pour les agrégats d'Aβ6, de tau7-9, d'α-synucléine10, de polyglutamine11 ou de SOD112. Ces résultats nous ont conduits à proposer qu'au moins un sous-ensemble de cas de CMD, ceux présentant un DISC1 agrégé, pourraient être des troubles de conformation protéique. Nous décrivons ici comment nous générons des aggresomes de DISC1 dans des cellules mammaliennes, comment nous les purifions sur un gradient de saccharose et comment nous les utilisons pour des études d'invasivité cellulaire. De même, nous décrivons comment nous générons un fragment C-terminal de DISC1 exclusivement multimérique, et comment nous le marquons et le purifions pour des études d'invasivité cellulaire. En utilisant les multimères recombinants de DISC1, nous obtenons une invasivité cellulaire similaire à celle d'un fragment synthétique d'α-synucléine marqué de la même manière. Nous montrons également que ce fragment est absorbé in vivo lorsqu'il est injecté par stéréotaxie dans le cerveau d'animaux receveurs.

L'objectif général des procédures suivantes est de produire des disques purifiés. Un agrégat capable d'envahir les cellules réceptrices. Deux méthodes différentes permettant d'atteindre cet objectif seront démontrées avec la première méthode.La protéine fluorescente formant un assemblage, fusionnée à la protéine disque une, est surexprimée dans des cellules donneuses humaines de neuroblastome NLF. Les cellules sont ensuite lavées avec du PBS, collectées et lysées sans utilisation de détergents. L'ADN est digéré et les agrégats sont purifiés à l'aide d'un système de gradient de saccharose.Les Agrios purifiés par cette méthode présentent une faible efficacité d'invasion cellulaire. L'approche alternative consiste à surexprimer les acides aminés 598 à 785 de la protéine recombinante disc une dans E. coli. Le fragment protéique est ensuite marqué avec le DITE 594, dialysé et purifié à l'aide d'une matrice NI NTA, ce qui élimine tout colorant non lié et tout disc multimerique résiduel.Les fragments un générés par cette méthode présentent une forte efficacité d'invasion cellulaire permettant d'évaluer l'invasion des cellules hôtes. Soit le disque purifié de protéine fluorescente, les un risomes ou le disque recombinant marqué. Le fragment un est incubé avec les cellules réceptrices d'intérêt.Le bleu de Trian est ensuite ajouté pour éteindre la fluorescence extracellulaire, et l'envahissement est visualisé par microscopie confocale. Jusqu'à présent, l'agrégation protéique n'a pas été reconnue comme une caractéristique des maladies mentales chroniques telles que la schizophrénie. Lorsque la protéine disruptée dans la schizophrénie 1 est un facteur candidat d'envahissement cellulaire, les agrégats protéiques constituent une caractéristique distinctive des maladies à mauvais repliement protéique.Ici, nous montrons par deux méthodes que les agrégats de la protéine disc une sont envahissants pour les cellules, et que par conséquent les troubles liés au disc une ou les neuropathies associées au disc une sont des troubles conformationnels des protéines. Ces deux méthodes consistent d'abord à la purification du disc complet, un ASOS provenant de lignées cellulaires de neuroblastome, puis à l'expression d'un fragment multimérique du disc une au niveau de l'extrémité C-terminale dans E. coli, ainsi qu'à la purification et au marquage avec un colorant fluorescent.Bien que la première méthode ne conduise qu'à une faible efficacité d'envahissement cellulaire d'environ 0,3 % des cellules ayant intégré les microsomes purifiés, le fragment protéique recombinant pur infecte jusqu'à 20 % des cellules exposées. Les méthodes décrites ici devraient être transposables à d'autres protéines pour lesquelles la formation de l'acrosome ou l'assemblage multimérique a été clairement démontrée. Dans chacune des 10 boîtes de 10 centimètres.Ensemencer 1,5 × 10⁶ cellules de neuroblastome humain et cellules LF dans un milieu RPMI 1640 complémenté et faire croître pendant la nuit. Le jour suivant, les cellules doivent être confluentes à 70 à 80 % ; étiqueter cinq boîtes pour la transfection avec PC DNA 3.1 MRFP et EGFP marqué, ainsi que le gène humain complet disc un, et cinq autres pour la transfection avec le plasmide EGFP seul. Pour chaque boîte de 10 centimètres, combiner 15 microgrammes d'ADN plasmidique, 30 microlitres de réactif de transfection et 750 microlitres.Opti MEM dans un tube de microcentrifugeuse et mélanger en pipettant par aspiration et expulsion répétées, puis incuber à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, pour transfecter les cellules, ajouter la solution de réactif de transfection d'ADN goutte à goutte sur les cellules, puis incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 %CO₂. 48 heures après la transfection, surveiller l'expression de MRFP intégral disc un et confirmer la formation de zones agro sous un microscope à fluorescence. Certaines cellules contiennent de grandes inclusions de protéines fluorescentes, comme illustré ici.Ce protocole combine une méthode de purification des corps de Lewy à partir de tissu cérébral et le protocole d'isolement des agrégats plus gros ou des zones agro, car les méthodes déjà existantes reposent sur l'utilisation de détergents, alors que l'isolement de protéines sans détergent est essentiel pour leur utilisation dans des tests d'invasivité cellulaire. Ensuite, aspirez le milieu, rincez avec du PBS et ajoutez 400 microlitres de PBS contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéases. Puis grattez les cellules et ajoutez un millilitre de suspension cellulaire ainsi que 10 billes en céramique dans un tube de lyse de deux millilitres.Lyserez les cellules à l'aide de trois impulsions de 62 secondes sur un homogénéisateur préalablement réglé sur la lyse cellulaire 24. La force mécanique du processus peut augmenter la température à l'intérieur de l'échantillon à plus de 37 degrés Celsius. Il convient donc de prendre soin de refroidir l'échantillon sur de la glace. Après la procédure de lyse, une fois les cellules refroidies sur de la glace, ajoutez du chlorure de magnésium à 10 millimolaire et 40 unités par millilitre d'ADNase, puis incubez pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius sous agitation.Préparez 10 millilitres chacun de solutions de saccharose à 80 %, 50 % et 20 % poids par volume dans du PBS. Ensuite, dans un tube conique de 15 millilitres, préparez le gradient de saccharose en commençant par deux millilitres de saccharose à 80 %, suivis de deux millilitres de saccharose à 50 % et de deux millilitres de saccharose à 20 %. Versez le gradient lentement et faites attention à ne pas perturber les couches déjà ajoutées.Superposez ensuite le lysat digéré sur le gradient et centrifugez pendant 15 minutes à 1000 × g à quatre degrés Celsius. Après la rupture, collectez soigneusement l'interface entre les couches de saccharose à 50 et 80 % à l’aide d’une pipette et mélangez avec cinq volumes dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifugez pendant 15 minutes à 1000 × g à quatre degrés Celsius. Retirez soigneusement le surnageant et conservez le culot contenant la zone d’aggrégation.Répétez le lavage deux fois supplémentaires à cette interface. Les zones Agri sont fluorescentes et peuvent être visualisées au microscope sous lumière UV après le dernier lavage ; éliminez le surnageant et resuspendez le culot dans 250 à 500 microlitres de PBS. Ce culot contient les zones agro purifiées.Ajouter 10 µL de disque MRFP, une suspension d'asomes, dans chaque puits d'une plaque à 24 puits contenant des cellules de neuroblastome humain SHSY-5Y, exprimant de façon constitutive un GFP soluble relié par son extrémité C-terminale à un disque sur des lamelles de verre stériles, et incuber pendant 48 à 72 heures. Après l'incubation, laver les cellules trois fois avec du PBS et éteindre la fluorescence extracellulaire avec du bleu de trypan à 0,04 % pendant cinq minutes.Ensuite, lavez à l'aide de PBS pour éliminer le bleu de trian. Puis, placez la boîte sur de la glace et ajoutez du PFA 4 % dans du PBS pendant 10 minutes pour fixer les cellules. Lavez ensuite une fois avec de l'eau stérile et montez les lamelles sur des lames de verre à l'aide du milieu de montage Prolong Gold avec DPI.Confirmer l'absorption lors de l'invasion de manière exogène. Appliquer les zones d'agression par colocalisation avec les protéines recrutées exprimées par les cellules réceptrices sur les images Zack. Ce Zack englobe environ six micromètres en profondeur.24 images capturés par pas de 200 nanomètres. La fluorescence du disque MRFP d'une zone agri, montrée en rouge, recrute le terminus cytosolique GFPC du disque. Une colocalisation d'un fragment, montrée en vert, apparaît en jaune et indique que les zones agri sont entrées dans le cytosol du receveur et ont recruté la protéine du disque un, auparavant soluble.Dans cette partie du protocole, le disque humain un sera marqué avec le DITE 5 94. Ce D permet la surveillance directe de la protéine recombinante sans nécessiter une coloration immunohistochimique supplémentaire. Commencez par éliminer le mercaptoéthanol du beam du prélèvement protéique préparé comme décrit dans le document accompagnant, en le dialysant trois fois dans deux litres de PBS à une dilution de un à 2000.À côté de l'étiquetage d'un disque de un milligramme avec DITE 5 94 IDE, dissoudre un milligramme par millilitre de protéine dans du PBS et ajouter du TCEP à cinq millimolaire pour récupérer les groupes SH libres ; ajouter 20 microlitres du colorant dissous dans du DMF à la réaction et incuber deux heures à température ambiante. À l'aide d'une cassette de dialyse SLI ayant une coupure de poids moléculaire de 10 000 daltons, dialyser la protéine trois fois dans du PBS selon un rapport de un à 2000, chaque dialyse durant deux heures. Ensuite, pour augmenter davantage la pureté de la protéine marquée.Une purification par affinité basée sur une étiquette hiss est réalisée sur une colonne NI NTA. Lavez un millilitre de matrice NI NTA avec 10 millilitres de PBS, puis appliquez la protéine dialysée marquée sur la colonne et laissez-la s’écouler à travers la colonne.Progressivement, la solution perdra une partie de sa couleur bleue en raison de la liaison de la protéine à la matrice NTA ; le colorant libre non marqué restera dans l'écoulement. Une fois la solution protéique introduite, lavez la colonne trois fois avec 20 millilitres de PBS pour éluer la protéine, puis ajoutez deux millilitres de PBS contenant 500 millimolaire d'ole à la colonne.Régler la valve à faible vitesse et éluer goutte à goutte tout en surveillant la bande colorée sur la colonne N NI NTA. Pour être précis, cette fraction colorée de l’éluat contient une protéine recombinante marquée ; transférer l’EIT dans une cassette de dialyse SLI et dialyser l’EIT trois fois contre du NAPI 10 millimolaire à une dilution de un à 2000, deux heures à chaque fois, dans deux litres. Après dialyse, faire passer l’EIT à travers un filtre stérile de 0,45 micromètre monté sur une seringue, puis aliquoter en cinq échantillons de 100 microlitres et congeler rapidement dans l’azote liquide.La quantité totale de protéine doit être comprise entre 0,5 et un microgramme par millilitre dans chaque aliquot de 100 microlitres. Pour évaluer l'invativité de la protéine, ajouter du milieu contenant cinq à 10 microgrammes par millilitre de la protéine recombinante marquée disc one à chaque puits d'une plaque de 24 puits contenant des cellules de neuroblastome humain SH SY 5 Y réceptrices. Expresant constitutivement la balise GFP soluble au niveau du terminus C de disc one sur des lamelles de verre stériles, incuber pendant 48 à 72 heures.Éteignez la fluorescence extracellulaire, fixez et montez les cellules comme pour les cellules traitées par la zone agri, puis confirmez l'internalisation de la protéine recombinante exogène appliquée par imagerie Zack. Lorsque la protéine marquée est internalisée, elle est détectée à l'intérieur du périmètre des cellules réceptrices sur les images obtenues par microscopie confocale. Ce Zack couvre une profondeur d'environ cinq micromètres en 24 pas de 220 nanomètres.Ici, le fragment recombinant de disc un, de 598 à 785, représenté en rouge, est internalisé par des cellules réceptrices exprimant la forme soluble de disc un, marquée par GFP à l'extrémité C-terminale, représentée en vert, afin de déterminer l'invasivité de la protéine disc un. Des agrégats de protéine disc un entière, marqués par MRFP, provenant de zones acrosomiques ont été purifiés à partir de cellules NLF et appliqués sur des cellules réceptrices SH-SY5Y, comme décrit dans cette photographie. L'acrosome de disc un marqué par A-M-R-F-P a pénétré une cellule de neuroblastome humain SH-SY5Y exprimant la forme soluble de disc un marquée par GFP à l'extrémité C-terminale.De plus, le disque un marqué par le MRFP a été capable de recruter le disque un soluble marqué par la GFP en agrégats insolubles afin de déterminer l'invasivité du disque un recombinant marqué par le DIA. Ce dernier a été appliqué à des cellules de neuroblastome SH-SY5Y exprimant le disque un soluble marqué par la GFP, comme indiqué ici. La protéine recombinante disque un, visualisée en rouge, a pénétré dans la cellule receveuse ; les points jaunes indiquent le recrutement du fragment C-terminal du disque un marqué par la GFP soluble en agrégats. Le disque un recombinant marqué et exprimé, puis purifié à partir d’E. coli, s’est également révélé invasif pour les neurones in vivo lorsque la protéine multimérique a été injectée stéréotaxiquement dans le cortex préfrontal médian d’un rat. L’imagerie Zack confirme la présence de la protéine recombinante disque un dans les neurones corticaux du rat, mis en évidence par un anticorps dirigé contre les noyaux neuronaux.Nous venons de vous présenter deux méthodes permettant de générer des agrégats de la protéine disc une pour l'étude de l'invasion cellulaire. À l'aide de l'une ou l'autre de ces méthodes, nous pouvons examiner les effets cellulaires liés à l'absorption d'agrégats de disc une, sans les variables potentiellement perturbantes que constitue l'expression de gènes recombinants par transfection d'ADN étranger. Ces techniques peuvent être utilisées pour étudier in vitro les effets biologiques de la pathologie protéique de disc une dans les cellules, ainsi qu'in vivo par inoculation intracérébrale ou toute autre administration dans des modèles animaux.Nous sommes convaincus que ces techniques pourraient également être transférées à d'autres agrégats protéiques, éventuellement avec de légères modifications du protocole adapté à chaque protéine particulière. Lors de la réalisation de cette procédure, veillez à consacrer suffisamment de temps à l'analyse rigoureuse des images de microscopie confocale.

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Quantification du cancer du sein cellulaire envahissement aide d&#39;un (3D) du modèle en trois dimensions

Présenté ici est une méthode simple pour l'isolement et le flux analyse cytométrique de cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant qui donne des données quantitatives en fonction du temps sur le nombre et le statut activation des cellules immunitaires qui entrent dans le microenvironnement de tumeur cérébrale tôt.

L&#39;isolement et la cytométrie en flux analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant

La transition épithéliale à mésenchymateuse (EMT) permet aux cancers de devenir invasifs. Pour étudier l’EMT, un modèle in vitro basé sur des cellules souches neurales (NSC) dépourvu de sérum et d’enzymes est décrit. Ce système standardisé permet une évaluation quantitative et qualitative de la migration cellulaire, de l’expression des gènes et des protéines. Le modèle est adapté à la découverte de médicaments.

Un modèle Enzyme et sans sérum Neural Culture de cellules souches pour EMT enquête Adaptés pour la découverte de médicaments

Nous avons adapté un insert de membrane microporeuse perméable pour imiter le microenvironnement tumoral (TME). Le modèle consiste en une culture cellulaire mixte, permet la génération simplifiée de populations cellulaires individuelles hautement enrichies sans utiliser le marquage fluorescent ou le tri cellulaire, et permet d’étudier la communication intercellulaire au sein du TME dans des conditions normales ou de stress.

A Mimic du microenvironnement de la tumeur: Une méthode simple pour générer des populations de cellules enrichies et enquête intercellulaire Communication

Ce protocole montre comment générer des tumeurs clonales marquée par fluorescence, génétiquement définis dans l'œil de Drosophila / disques imaginaux antennaires (EAD). Il décrit comment disséquer l'EAD et le cerveau à partir du troisième stade larvaire et comment les traiter pour visualiser et quantifier les changements d'expression des gènes et l'invasivité des tumeurs.

le<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Tumor Disc Modèle: Visualisation et quantification de l&#39;expression génique et de tumeurs invasives utilisant Mosaïques génétique

lésions hépatiques sont accompagnés par l'expansion des cellules progénitrices qui représente une population hétérogène de cellules. classification Novel de ce compartiment cellulaire permet la distinction de plusieurs sous-ensembles. La méthode décrite ici illustre l'analyse par cytométrie de flux et d'isolement de haute pureté de divers sous-ensembles qui peuvent être utilisés pour d'autres analyses.

Isolement et enrichissement du foie progénitrices sous-ensembles identifiés par une combinaison de marqueurs de surface Novel

Les processus d’invasion du cancer de la vessie représentent des occasions de biomarqueurs et de développement thérapeutique. Ici, nous présentons un modèle d’invasion de cancer de la vessie qui intègre la culture 3D des sphéroïdes de tumeur, Time-lapse imagerie et microscopie confocale. Cette technique est utile pour définir les caractéristiques du processus invasif et pour le dépistage des agents thérapeutiques.

Système de Culture cellulaire 3D pour étudier l’Invasion et l’évaluation thérapeutique dans le Cancer de la vessie

Dictyostelium discoideum est un organisme modèle populaire à étudier les processus cellulaires complexes tels que la migration cellulaire, endocytose et le développement. L’utilité de l’organisme dépend de la possibilité de manipulation génétique. Nous présentons ici les méthodes pour transfecter Dictyostelium discoideum cellules qui surmontent les limites actuelles de culture de cellules dans un milieu liquide.

Génie génétique de Dictyostelium discoideum basés sur la sélection et la croissance sur les bactéries

Ce protocole présente un modèle expérimental original de culture proinflammatory et dégénérative d’organe bovin pour simuler la dégénération intervertébrale de disque de tôt-étape.

Un modèle pro-inflammatoire et dégénératif de culture d’organe pour simuler la maladie de disque intervertébral de tôt-étape.

Nous décrivons une approche pour détecter et capturer des sous-populations cellulaires invasives en temps réel. La conception expérimentale utilise l’analyse cellulaire en temps réel en surveillant les changements dans l’impédance électrique des cellules. Le cancer invasif, les cellules immunitaires, endothéliales ou stromales dans les tissus complexes peuvent être capturés et l’impact des co-cultures peut être évalué.

Détection et capture en temps réel de sous-populations cellulaires invasives provenant de co-cultures

Découvrez la production et la purification d'agrégats de protéine DISC1 capables d'envahir les cellules réceptrices. Cette méthode permet d'étudier l'invasion cellulaire par microscopie confocale.

Production, de conditionnement, et la caractérisation des cellules invasives Espèces protéine DISC1

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