Production, de conditionnement, et la caractérisation des cellules invasives Espèces protéine DISC1

L’objectif général des procédures suivantes est de générer un disque purifié. L’un est des agrégats capables d’envahir les cellules réceptrices. Deux méthodes différentes pour atteindre cet objectif seront démontrées avec la première méthode.

La protéine de fusion du disque protéique fluorescent formant un asome est surexprimée dans les cellules donneuses de neuroblastome humain NLF. Les cellules sont ensuite lavées avec du PBS collecté et couché sans utiliser de détergents. L’ADN est digéré et les zones agricoles sont purifiées à l’aide d’un système de gradient de saccharose.

Les Agrios purifiés par cette méthode ont une faible efficacité d’invasion cellulaire. L’approche alternative consiste à surexprimer les acides aminés 5 98 à 7 85 de la protéine recombinante du disque un chez e coli. Le fragment de protéine est ensuite marqué avec DITE 5 94, dialysé et purifié à l’aide d’une matrice NI NTA qui élimine tout disque multimérique de colorant non lié restant.

Un fragment généré par cette méthode a une efficacité d’invasion cellulaire élevée pour évaluer l’invasion de la cellule hôte. Soit le disque protéique fluorescent purifié, soit un risome, soit le disque recombinant marqué. Un fragment est incubé avec les cellules réceptrices d’intérêt.

Du bleu trian est ensuite ajouté pour éteindre la fluorescence extracellulaire et l’invasion est visualisée par microscopie confocale. Jusqu’à présent, l’agrégation des protéines n’a pas été une caractéristique reconnue des maladies mentales chroniques comme la schizophrénie. Là où la protéine perturbée dans la schizophrénie est une cellule candidate, l’invasivité des agrégats de protéines est une caractéristique caractéristique des maladies de confirmation des protéines.

Ici, nous montrons avec deux méthodes que les agrégats de protéines du disque un sont invasifs pour les cellules et donc que les troubles liés au disque un ou les neuropathies du disque un sont des troubles de confirmation des protéines. Les deux méthodes sont d’une part la purification d’un disque pleine longueur, l’un ASOS à partir de lignées cellulaires de neuroblastome et d’autre part, l’expression d’un disque multimérique C terminal. Un fragment dans e coli ainsi que la purification et l’étiquetage avec le colorant fluorescent.

Alors que la première méthode ne conduit qu’à une invasion cellulaire peu efficace de oh 0,3 % des cellules occupant les microsomes purifiés, le fragment de protéine recombinante pure infecte jusqu’à 20 % des cellules exposées. Les méthodes décrites ici devraient être transférables à d’autres protéines où la formation d’acrosomes ou l’assemblage multimérique ont été démontrés de manière convaincante. Dans chacun des 10 plats de 10 centimètres.

Ensemencez 1,5 fois 10 dans les six cellules humaines de neuroblastome et de LF dans un milieu RPMI 1640 supplémenté et cultivez pendant la nuit. Le lendemain, les cellules doivent être à 70 à 80 % confluentes, marquer cinq boîtes pour la transfection avec de l’ADN PC, 3.1 MRFP et EGFP marqués au premier disque humain pleine longueur, et cinq pour la transfection avec le plasmide EGFP seul. Pour chaque boîte de 10 centimètres, combinez 15 microgrammes d’ADN plasmidique 30 microlitres rencontrés et 750 microlitres.

Opti MEM dans un micro tube de centrifugation et effectue en pipetant de haut en bas, incuber à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, pour transfecter les cellules, ajoutez la solution de réactif de transfection de l’ADN, goutte à goutte aux cellules, incubez les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO 2 48 heures après la transfection, surveillez l’expression du disque pleine longueur MRFP un et confirmez la formation d’agrozones sous un microscope à fluorescence. Certaines cellules hébergent une inclusion massive de protéines fluorescentes, comme le montre ici.

Ce protocole combine une méthode pour purifier les corps de Lewy du tissu cérébral et le protocole pour isoler des agrégats plus grands ou des zones agricoles. Ensuite, aspirez le lavage moyen avec du PBS et ajoutez 400 microlitres de PBS contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéase. Ensuite, grattez les cellules et ajoutez un millilitre de suspension cellulaire et 10 billes de céramique dans un tube de lyse de deux millilitres.

Lys les cellules à l’aide de trois impulsions 62e sur un homogénéisateur pré-cellulaire Lyse 24. La force mécanique du processus peut augmenter la température à l’intérieur de l’échantillon à plus de 37 degrés Celsius. Il faut donc veiller à refroidir l’échantillon sur de la glace Après la procédure de lyse, après avoir refroidi les cellules sur de la glace, ajoutez 10 millimolaires de chlorure de magnésium 40 unités par millilitre d’ADN et incubez pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius en secouant.

Préparez 10 millilitres chacun de 80 %, 50 % et 20 % de poids de saccharose par volume en PBS. Ensuite, dans un tube conique de 15 millilitres, préparez le gradient de saccharose en commençant par deux millilitres de 80 % de saccharose suivis de deux millilitres de 50 % et de deux millilitres de 20 % de saccharose. Versez le dégradé lentement et veillez à ne pas déranger les couches déjà coulées.

Appliquez ensuite le lysat digéré sur le gradient et centrifugez pendant 15 minutes à 1000 fois G à quatre degrés Celsius. Avec la pause, prélevez soigneusement l’interface entre la couche de saccharose de 50 à 80 % à l’aide d’une pipette et mélangez avec cinq volumes d’une centrifugeuse à tube conique de 15 millilitres pendant 15 minutes à 1000 fois G à quatre degrés Celsius. Retirez soigneusement le surnageant et gardez la zone agricole contenant les granulés.

Répétez le lavage deux fois de plus dans cette interface. Les zones agricoles sont fluorescentes et peuvent être visualisées au microscope sous la lumière UV après le dernier lavage, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 250 à 500 microlitres de PBS. Cette pastille contient les zones agricoles purifiées.

Ajoutez 10 microlitres de disque MRFP, une suspension d’asome dans chaque puits d’une plaque de 24 puits contenant cinq cellules de neuroblastome humain SHSY. Exprimant constitutivement le disque GFP soluble à une extrémité C sur des lamelles en verre stériles et incuber pendant 48 à 72 heures après l’incubation. Lavez les cellules trois fois avec du PBS et éteignez la fluorescence extracellulaire avec 0,04 % de bleu trian pendant cinq minutes.

Laver ensuite avec du PBS pour enlever le bleu trian. Ensuite, placez le plat sur de la glace et ajoutez 4 % de PFA et de PBS pendant 10 minutes pour fixer les cellules. Ensuite, lavez une fois à l’eau stérile et montez les lamelles sur des lames de verre avec de l’or prolongé avec un support de montage DPI.

Confirmer l’absorption dans l’invasion de l’exogène. Zones d’aggro appliquées par colocalisation avec des protéines recrutées exprimées par les cellules réceptrices dans les images de Zack. Ce Zack a une profondeur d’environ six micromètres.

24 photos prises par pas de 200 nanomètres. La fluorescence du disque MRFP une zone agri représentée en rouge recrute le disque terminal cytosolique GFPC. Un fragment montré en colocalisation verte se présente en jaune et indique que les zones agri sont entrées dans le cytosol récepteur et ont recruté une protéine du disque un auparavant soluble.

Dans cette partie du protocole, le disque humain sera étiqueté avec DITE 5 94. Ce D permet la surveillance directe de la protéine recombinante sans avoir besoin d’immuno-coloration supplémentaire. Commencez par libérer les protéines préparées comme décrit dans le document d’accompagnement à partir du mercaptoéthanol en les dialysant trois fois dans deux litres de PBS à une dilution de un à 2000.

Ensuite, pour marquer un disque d’un milligramme avec DITE 5 94 IDE, dissoudre un milligramme par millilitre de protéine dans du PBS et ajouter cinq millimolaires de TCEP pour récupérer les groupes TH libres, ajouter 20 microlitres de colorant dissous DMF à la réaction et incuber pendant deux heures à température ambiante à l’aide d’une cassette de dialyse SLI avec une coupure de poids moléculaire de 10, 000. Les Daltons dialysent la protéine trois fois dans le PBS dans un rapport de un à 2000 pendant deux heures à chaque fois. Ensuite, pour augmenter encore la pureté de la protéine marquée.

Une purification d’affinité basée sur une balise de sifflement sur une colonne NI NTA est effectuée. Lavez une matrice NI NTA d’un millilitre avec 10 millilitres. PBS applique ensuite la protéine de dialyse étiquetée sur la colonne et laisse-la couler sur la colonne.

Lentement, la solution perdra une partie de sa couleur bleue en raison de la liaison de la protéine à la matrice NTA, un colorant libre non marqué restera dans le flux. Une fois la solution protéique entrée. La colonne, laver la colonne trois fois avec 20 millilitres de PBS pour éluer la protéine, ajouter deux millilitres de PBS contenant 500 millimolaires d’ole à la colonne.

Réglez la vanne à vitesse lente et éluez goutte à goutte tout en surveillant la bande colorée sur la colonne N NI NTA. Pour être référencé, cette fraction colorée de l’éluat contient une protéine recombinante marquée, transfère l’EIT dans une cassette de dialyse SLI et dialyse l’EIT trois fois à 10 millimolaires NAPI à une dilution de un à 2000 pendant deux heures chacune dans deux litres après la dialyse. Poussez l’EIT à travers un filtre à seringue stérile de 0,45 micromètre, puis aliquote dans cinq fois des échantillons de 100 microlitres et congelez-le instantanément dans de l’azote liquide.

La quantité totale de protéines doit être de 0,5 à un microgramme par millilitre dans chaque aliquote de 100 microlitres. Pour évaluer le caractère invasif de la protéine, ajoutez un milieu contenant cinq à 10 microgrammes par millilitre de disque recombinant marqué une protéine à chaque puits d’une plaque à 24 puits contenant des cellules de neuroblastome humain SH SY, cinq cellules de neuroblastome humain Y. Exprimant constituativement le disque d’étiquette GFP soluble à une extrémité C sur des lamelles en verre stériles, l’incubation dure 48 à 72 heures.

L’extinction de la fluorescence extracellulaire, la fixation et le montage des cellules comme cela a été fait pour les cellules traitées en zone agricole, confirment l’invasion de la protéine recombinante appliquée de manière exogène par Zack Imaging. Lorsque la protéine marquée est absorbée, elle est détectée dans le périmètre des cellules réceptrices dans les images générées par la microscopie confocale. Ce Zack englobe environ cinq micromètres de profondeur à 24 pas de 220 nanomètres.

Ici, le disque recombinant un fragment 5 98 à 7 85 représenté en rouge est absorbé par les cellules réceptrices exprimant le disque soluble C terminal marqué GFP un montré en vert pour déterminer le caractère invasif du disque. Une protéine agrège des zones agricoles composées de MRFP marqués d’un disque pleine longueur, un a été purifié à partir de cellules NLF et appliqué sur cinq cellules Y réceptrices SH SY, comme décrit sur cette photo, comme illustré ici. A-M-R-F-P disque un acrosome a envahi un neuroblastome humain SH SY cinq cellules Y exprimant une GFP soluble marquée C disque terminal un.

De plus, le premier disque marqué au MRFP a été capable de recruter le disque 1 soluble marqué à la GFP en agrégats insolubles pour déterminer le caractère invasif du disque recombinant marqué à la lumière DIA a été appliqué aux cellules de neuroblastome SH SY cinq Y exprimant le premier disque GFP soluble comme indiqué ici. Les malteurs de la protéine du disque recombinant montré en rouge ont envahi la cellule réceptrice, les points jaunes indiquent un recrutement de la GFP soluble, le disque terminal C marqué un en agrégats, le disque recombinant un exprimé et purifié à partir d’e coli était également invasif dans les neurones in vivo lorsque la protéine multimérique a été injectée stéréotaxiquement dans le cortex préfrontal médian d’un rat. L’imagerie Zack confirme la présence d’une protéine recombinante du disque un dans le neurone cortical du rat coloré avec un anticorps contre les noyaux neuronaux.

Nous venons de vous montrer deux méthodes pour générer des agrégats du premier disque pour étudier l’invasion cellulaire. En utilisant l’une ou l’autre de ces méthodes, nous pouvons étudier les effets cellulaires de l’absorption des agrégats du disque un sans les variables potentiellement confondantes de l’expression génique recombinante par transfection d’ADN étranger. Ces techniques peuvent être appliquées pour étudier les effets biologiques de la pathologie de la protéine du disque un in vitro dans les cellules, et in vivo par inoculation intracérébrale ou autre administration dans des modèles animaux.

Nous sommes convaincus que ces techniques peuvent également être transférées à d’autres agrégats de protéines, avec éventuellement de légères modifications du protocole adopté pour chaque protéine particulière. Lorsque vous effectuez cette procédure, assurez-vous de consacrer du temps à l’analyse diligente des images de microscopie confocale.