Name: Criblage à haut débit pour les petites molécules modulateurs de canaux potassiques entrants Rectifier (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Découvrez un criblage à haut débit pour identifier des modulateurs de canaux potassiques entrants rectifier (Kir) utilisant un test de fluorescence au thallium. Cette méthode permet de dépister des milliers de composés pour la découverte de nouvelles thérapies.

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<ol><li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129(2008).</li>
<li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K%2B+channels%3A+recent+advances+and+future+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757(2010).</li>
<li>Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tarantula+toxins+interacting+with+voltage+sensors+in+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Tarantula toxins interacting with voltage sensors in potassium channels.</a> Toxicon. 49 (2), 213(2007).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291(1998).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin%3A+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286(1999).</li>
<li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain%3A+a+Mount+Everest+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764(2010).</li>
<li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thallium-sensitive%2C+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671(2004).</li>
<li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094(2009).</li>
<li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1%2C+the+renal+outer+medullary+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42(2011).</li>
<li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+%28Kir%29+channels+with+preference+for+Kir2.3%2C+Kir3.x%2C+and+Kir7.1%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75(2012).</li>
<li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213(2008).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Traitement des données: Une fois les données recueillies, une étape commune dans l&#39;analyse consiste à normaliser réponse de fluorescence de chaque puits, F, à sa valeur initiale au début de l&#39;expérience, F 0. Ceci est communément appelé le &quot;rapport statique» et symbolisé &quot;F / F 0&quot;. Dans le cas où F 0 est dominé par le colorant indicateur du fonctionnement rapport statique pour corriger sensiblement nombreux facteurs tels que disuniformit...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.

Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> Vecteur d&#39;expression inductible par la tétracycline </td></tr><tr><td> T-rex-cellules HEK293 </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> Lignée cellulaire inductible par la tétracycline </td></tr><tr><td> Lipofectamine LTX / Plus réactif </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Réactif de transfection </td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S11550 </td><td> Milieux de culture cellulaire </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Milieux de culture cellulaire </td></tr><tr><td> Hygromycine B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> Milieux de culture cellulaire </td></tr><tr><td> Blasticidine S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> Milieux de culture cellulaire </td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Milieux de culture cellulaire </td></tr><tr><td> HBSS-divalent gratuit </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> Lavage des cellules </td></tr><tr><td> Trypsine 0,25% </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> Dissociation cellulaire </td></tr><tr><td> Tétracycline-HCl </td><td> Sigma </td><td> T9823 </td><td> Réactif à induction </td></tr><tr><td> FBS dialyse </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S12650 </td><td> Géloses </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> Colorant fluorescent </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> Colorant de chargement </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> Tampon de dosage </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td> Tampon de dosage </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td> Tl + relance tampon </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Tl + relance tampon </td></tr><tr><td> CaSO 4 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3771 </td><td> Tl + relance tampon </td></tr><tr><td> Le D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> Tl + relance tampon </td></tr><tr><td> Sulfate de thallium </td><td> Aldrich </td><td> 204625 </td><td> Tl + relance tampon </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Tl + relance tampon </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D4540 </td><td> Solvant </td></tr><tr><td> Huit canaux pipette électronique </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> Placage cellule en 384 -plaques à puits </td></tr><tr><td> BD PureCoat amine recouvertes de plaques 384 puits </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> Microplaques de dosage </td></tr><tr><td> Echo qualifié 384-Eh bien polypropylène microplaque (384pp) </td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td> Microplaques sources composés </td></tr><tr><td> Microplaques en polypropylène de 384 puits </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Multidrop Combi distributeur de réactif </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> Laveur de microplaques ELx405 </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> Lavage de cellules automatisé </td></tr><tr><td> Echo manipulateur de liquide </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte Echo 550 </td><td></td></tr><tr><td> Bravo automatisée plate-forme de manipulation des liquides </td><td> Agilent Technologies </td><td> Modèle standard </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu FDSS 6000 </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> Kinetic lecteur de plaque d&#39;imagerie </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Liste des Matériels et réactifs.

criblage à haut débit pour les petites molécules modulateurs de canaux potassiques entrants rectifier

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Certains membres de la famille redresseur canal potassique vers l&#39;intérieur (Kir) sont postulés cibles thérapeutiques pour une variété de troubles, y compris l&#39;hypertension, la fibrillation auriculaire, et de 1,2 douleur. Pour la plupart, toutefois, les progrès vers la compréhension de leur potentiel thérapeutique, voire fonctions physiologiques a été ralentie par le manque de bons outils pharmacologiques. En effet, la pharmacologie moléculaire de la famille redresseur entrant est restée loin derrière celle de la superfamille S4 de potassium voltage-dépendants (Kv), les canaux pour lesquels un certain nombre d&#39;affinité nanomolaire et très modulateurs sélectifs des toxines peptidiques ont été découverts 3. La toxine du venin d&#39;abeille tertiapin et ses dérivés sont de puissants inhibiteurs de Kir1.1 et Kir3 canaux 4,5, mais peptides sont d&#39;une utilité limitée thérapeutique ainsi que expérimentalement en raison de leurs propriétés antigéniques et la biodisponibilité médiocre, la stabilité métabolique et la pénétrance des tissus. Le développement de puissantset sélectifs de petites molécules sondes avec des propriétés pharmacologiques améliorées sera un élément clé pour bien comprendre la physiologie et le potentiel thérapeutique des canaux Kir. La moléculaire bibliothèques Sondes de production Network Center (MLPCN) supportée par le National Institutes of Health (NIH) Fonds commun a créé des opportunités pour les scientifiques académiques pour initier des campagnes de sonde de découverte de cibles moléculaires et les voies de signalisation dans le besoin d&#39;une meilleure pharmacologie 6. L&#39;offre aux chercheurs l&#39;accès MLPCN aux centres de dépistage l&#39;échelle industrielle et la chimie médicinale et de l&#39;informatique en charge de développer de petites molécules sondes pour élucider la fonction des gènes et des réseaux de gènes. L&#39;étape critique pour gagner l&#39;entrée à l&#39;MLPCN est le développement d&#39;un test robuste cible ou une voie spécifique qui est susceptible de criblage à haut débit (HTS). Ici, nous décrivons comment développer une base de fluorescence thallium (Tl +) flux assaY sur Kir canal de fonction pour le criblage à haut débit composé 7,8,9,10. L&#39;essai est basé sur la perméabilité de la chaîne K + pores de la Tl + K + congénère. Un disponibles dans le commerce fluorescent Tl + colorant reporter est utilisé pour détecter le flux transmembranaire de Tl + à travers le pore. Il ya au moins trois colorants disponibles dans le commerce qui sont appropriés pour Tl + tests de flux: BTC, FluoZin-2, 7,8 et Fluxor. Ce protocole décrit le développement de tests à l&#39;aide FluoZin-2. Bien qu&#39;à l&#39;origine développés et commercialisés comme un indicateur de zinc, FluoZin-2 présente une augmentation forte et dose-dépendante de l&#39;émission de fluorescence lors de Tl + contraignant. Nous avons commencé à travailler avec FluoZin-2 avant Fluxor était disponible 7,8 et ont continué à le faire 9,10. Cependant, les étapes de développement de tests sont essentiellement identiques pour les trois colorants, et les utilisateurs devraient déterminer quels colorant est le plus approprié pour leur propre needs. Nous discutons également des critères de performance de l&#39;analyse qui doit être atteint à prendre en considération pour l&#39;entrée à l&#39;MLPCN. Depuis Tl + imprègne facilement la plupart des canaux K +, le dosage doit être adapté à la plupart des objectifs de canaux K +.

L&#39;utilisation d&#39;un système d&#39;expression inductible par la tétracycline permet un contrôle pratique interne pour distinguer Tl + flux à travers les voies endogènes et le canal Kir d&#39;intérêt. Figure 1 montre quelques exemples de cartes de placage de cellules utilisées dans différents types d&#39;expériences. Les positions des puits contenant les cellules non induites ou induite par la tétracycline sont indiquées par des couleurs différentes. Figure 2A représente...

Méthodes d&#39;élaboration et de validation d&#39;un dosage quantitatif de fluorescence pour mesurer l&#39;activité de potassium redresseur actif (Kir) des canaux pour le criblage de composés à haut débit est présenté.

Criblage à haut débit pour les petites molécules modulateurs de canaux potassiques entrants Rectifier

Certains membres de la famille des canaux potassiques rectifieurs entrants (Kir) sont postulés comme cibles thérapeutiques pour divers troubles, dont l'hypertension, ...

L'objectif général de cette procédure est de découvrir de nouveaux composés capables de moduler l'activité des canaux potassiques rectificateurs entrants. Cette étape est réalisée en semant d'abord des cellules HK 2 9 3, induites par la tétracycline et exprimant un canal KIR d'intérêt, dans une plaque de 384 puits. La deuxième étape consiste à charger les cellules avec un colorant rapporteur fluorescent au thallium appelé flu in two.Ensuite, le colorant non incorporé est éliminé par lavage des cellules, puis remplacé par un tampon d'essai contenant un témoin véhicule ou des composés à tester. La dernière étape consiste à ajouter un tampon stimulateur dans les puits afin d'initier le flux de thallium. Enfin, un lecteur de plaques à fluorescence est utilisé pour identifier les composés modifiant le déplacement des ions thallium à travers le canal KIR.L'avantage principal de cette méthode par rapport aux techniques existantes, telles que l'électrophysiologie par enregistrement en mode « patch clamp » manuel, est qu'elle permet à l'expérimentateur de réaliser des centaines d'expériences simultanément et des milliers d'expériences par jour. Cette méthode permet à l'expérimentateur de cr

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Un test de dépistage fluorescent pour identifier des modulateurs de canaux Girk

Techniques de biocapteurs optiques peuvent détecter des changements dans la masse à proximité de la membrane plasmique dans les cellules vivantes et permettre un suivi de la réponse cellulaire dans les deux cellules et les populations de cellules individuelles. Ce protocole décrit la détection de la modulation des canaux potassiques par G récepteurs couplés aux protéines dans des cellules intactes en utilisant cette approche.

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Ici, nous décrivons un test de gène rapporteur basé sur des cellules comme un outil précieux pour cribler les bibliothèques chimiques à la recherche de composés modulant les mécanismes de contrôle post-transcriptionnel exercés par 3' UTR.

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Procédé pour l&#39;identification d&#39;inhibiteurs de petites molécules de l&#39;interaction protéine-protéine entre HCN1 et TRIP8b

Étudier les canaux ioniques à travers un système exprimant de manière hétérologue est devenue une technique de base dans la recherche biomédicale. Dans ce manuscrit, nous présentons une méthode efficace de temps pour obtenir l'expression du canal ionique étroitement contrôlé en effectuant une transfection transitoire sous le contrôle d'un promoteur inductible.

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Une méthode simple pour identifier les kinases qui réglementent la pluripotence des cellules souches embryonnaires par un dépistage des inhibiteurs à haut débit

Un test ATPase couplé à la nicotinamide adenine (NADH) a été adapté au dépistage semi-élevé de la myosine par petite molécule. Cet essai cinétique est exécuté dans un format microplate de 384 puits avec des volumes de réaction totaux de seulement 20 L par puits. La plate-forme devrait s'appliquer à pratiquement n'importe quelle enzyme productrice d'ADP.

Adaptation semi-haute débit de l'analyse ATPase couplée au NADH pour le dépistage des petits inhibiteurs des molécules

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Essai basé sur la fluorescence du potentiel membranaire pour l’étude fonctionnelle à haut débit de deux canaux ioniques endogènes dans deux lignées cellulaires épithéliales

Le présent protocole met en évidence l’application de la technique de transfert Western pour étudier les fonctions et les activités du cotransporteur neuronal K-Cl KCC2. Le protocole décrit l’étude de la phosphorylation de KCC2 sur les sites régulateurs de kinases Thr906/1007 par transfert Western. En outre, des méthodes supplémentaires pour confirmer l’activité de KCC2 sont brièvement mises en évidence dans ce texte.

Etude des fonctions et activités du co-transporteur neuronal K-CL KCC2 par transfert Western

Ce protocole décrit une méthode de criblage à haut débit basée sur la cytométrie en flux pour identifier les médicaments à petites molécules qui inhibent l’activation de l’intégrine β2 sur les neutrophiles humains.

Technique à haut débit basée sur la cytométrie en flux pour le criblage de médicaments inhibiteurs de l’intégrine

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Criblage des canaux ioniques dans les cellules cancéreuses

Découvrez un criblage à haut débit pour identifier des modulateurs de canaux potassiques entrants rectifier (Kir) utilisant un test de fluorescence au thallium. Cette méthode permet de dépister des milliers de composés pour la découverte de nouvelles thérapies.

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