Criblage à haut débit pour les petites molécules modulateurs de canaux potassiques entrants Rectifier

L’objectif global de cette procédure est de découvrir de nouveaux composés qui modulent l’activité des canaux potassiques redresseurs vers l’intérieur. Ceci est accompli en plaquant d’abord des cellules HK 2 9 3 inductibles de tétracycline, exprimant un canal KIR d’intérêt dans une plaque à 384 puits. La deuxième étape consiste à charger les cellules avec un colorant rapporteur fluorescent au thallium appelé grippe en deux.

Ensuite, le colorant non incorporé est lavé des cellules et remplacé par un tampon de dosage contenant un témoin de véhicule ou des composés d’essai. La dernière étape est l’ajout d’un tampon de stimulus aux puits pour initier le flux de thallium. En fin de compte, un lecteur de plaque de fluorescence est utilisé pour identifier les composés qui modifient le mouvement des ions thallium à travers le canal KIR. Pauvre.

Le principal avantage de cette méthode par rapport aux techniques existantes telles que l’électrophysiologie manuelle est qu’elle permet à l’investigateur d’effectuer des centaines d’expériences simultanément et des milliers d’expériences par jour. Cette méthode permet à l’investigateur de passer au crible des bibliothèques de milliers de petites molécules pour découvrir des modulateurs des canaux potassiques rectificatifs vers l’intérieur : un jour avant l’expérience de flux de thallium, dissocier les cellules et quantifier la densité de la suspension cellulaire, comme décrit dans le manuscrit ci-joint. Ensuite, utilisez le milieu BH contenant 10 % de plaque FBS dialysée 20 000 cellules monoclonales transfectées de manière stable avec un gène de canal KIR d’intérêt dans chaque puits d’une plaque à 384 puits à revêtement pur BD à revêtement pur Amin à l’aide d’un combi thermo multi gouttes ou d’un pipeteur multicanaux le lendemain, inspectez la plaque au microscope pour vous assurer que les cellules sont adhérentes et uniformément réparties au fond des puits.

Utilisez ensuite un laveur de microplaques ELX 4 0 5 pour remplacer le milieu de culture cellulaire par le test HBSS. Tampon à 20 microlitres par puits. Après cela, préparez les grippes dans une solution de chargement de 2h00 D en centrifugant brièvement le tube pour dissoudre 50 microgrammes de grippes en deux poudres dans 100 microlitres de DMSO anhydre.

Ajoutez maintenant 50 microlitres d’une solution de DMSO onique F1 27 de 20 % en poids par volume au colorant. Mélangez-les en pipetant doucement. Ajoutez ensuite 150 microlitres de grippes dans 2h00 du matin onic F1 27 à 35 millilitres de dosage HBSS, tamponnez et mélangez doucement.

Ensuite, ajoutez 20 microlitres de tampon de chargement de colorant dans chaque puits qui contient déjà 20 microlitres de test HBSS. Tampon. Incuber les cellules à température ambiante pendant environ une heure pendant qu’elles se chargent de colorant. Préparez une plaque de stimulus au thallium en dissolvant fraîchement 0,5 gramme de bicarbonate de sodium dans 50 millilitres de cinq tampons de stimulus au thallium.

Ajoutez ensuite 50 microlitres de la solution dans chaque puits d’une plaque de polypropylène 384 puits Après que les cellules aient été chargées de grippes à 2h00 du matin. Lavez la plaque avec une rondelle de microplaques ELX 4 0 5. Ensuite, ajoutez 20 microlitres ou 40 microlitres de test HBSS. Tamponnez à chaque puits et la plaque est maintenant prête pour les expériences.

Chargez le thallium et les plaques cellulaires dans un système de dépistage de drogues fonctionnel Hema Matsu ou un lecteur de plaques d’imagerie cinétique équivalent avec des capacités de distribution de liquide intégrées et utilisez des filtres appropriés pour les colorants à base de fluorescéine tels que la grippe oh quatre. Après cela, mettez en place un protocole d’ajout unique pour ajouter 10 microlitres de cinq séries de thallium X aux puits correspondants de la plaque cellulaire contenant 40 microlitres de tampon de test HBSS. Enregistrez ensuite la fluorescence de base à une fréquence d’échantillonnage d’un hertz pendant au moins 10 secondes.

La fluorescence de puits à puits doit être uniforme et stable sur toute la plaque une fois que les conditions optimales de placage cellulaire, de lavage et de charge sont établies. Pendant ce temps, utilisez la pipette à 384 canaux intégrée pour ajouter simultanément le tampon de stimulus de thallium à chaque puits et poursuivez l’enregistrement pendant au moins deux minutes afin que le taux et le pic de l’augmentation de la fluorescence induite par le thallium soient capturés pour une analyse hors ligne. Dans la prochaine série d’expériences, évaluez l’uniformité et la reproductibilité du test en plaquant un inhibiteur de contrôle dans chaque autre puits de chaque colonne et rangée d’une plaque de 384 puits et en ajoutant du DMSO aux autres puits en tant que témoin de véhicule.

Utilisez un pipeteur multicanaux. Fabriquer une plaque de DMSO composé en pipetant un inhibiteur du canal KIR cible à la concentration déterminée précédemment à 80 microlitres par puits et à 0,1 % de véhicule de DMSO dans une plaque de polypropylène de 384 puits. Cela se fait en ajoutant un inhibiteur connu commençant dans le puits A un et alternant avec le puits B deux et ainsi de suite jusqu’au puits B 24.

Répétez cette procédure avec le DMSO en commençant par le puits, B un et ainsi de suite jusqu’au puits A 24. Chargez maintenant la cellule, les plaques de stimulus composé et thallium dans le lecteur de plaques. Ensuite, mettez en place un protocole à deux ajouts pour ajouter 20 microlitres de la série de composés à deux concentrations X aux puits correspondants de la plaque cellulaire contenant 20 microlitres de tampon de dosage HBSS.

Ajoutez les composés dans la plaque cellulaire et incubez-les jusqu’à 20 minutes à température ambiante. Enregistrez les grippes de référence en deux fluorescences pendant au moins 10 secondes. Ajoutez ensuite 10 microlitres de cinq tampons de thallium dans chaque puits de la plaque cellulaire.

Répétez l’expérience trois jours consécutifs pour établir la reproductibilité des résultats. Utilisez le flux de thallium dans le DMSO et les cellules traitées par médicament pour calculer une valeur pour Z prime. Une mesure statistique de la variabilité d’un puits à l’autre entre les deux populations de puits calcule Z prime à l’aide de cette formule basée sur les moyennes et les écarts-types de P et N où P est la valeur de flux non inhibé et N est la valeur de flux entièrement inhibé.

Un test avec des valeurs ZPrime supérieures ou égales à 0,5 sur trois jours distincts est considéré comme approprié pour le criblage à haut débit. Ces figures sont quelques exemples de cartes de placage cellulaire utilisées dans différents types d’expériences. Les positions des puits contenant des cellules non induites ou induites par la tétracycline sont indiquées en différentes couleurs.

Cette figure montre la carte de la plaque source utilisée pour déterminer la concentration optimale de thallium pour le développement d’essais et le criblage de composés. Le dégradé de couleurs représente la triple série de dilution allant de 100 % à 0,002 % de thallium, et voici une carte représentative de l’intensité de fluorescence avec des couleurs froides à chaudes, indiquant des valeurs de flux de thallium faibles à élevées. La carte de placage de cellule montrée ici avec un ajustement de la fonction logistique à quatre paramètres au CRC du thallium est utilisée pour déterminer une valeur CEE 80 de 15 % de thallium.

Cette figure montre la carte de la plaque source utilisée pour déterminer la tolérance DMSO d’un essai. Les colonnes un et 24 ne contiennent que le tampon de dosage, tandis que le dégradé de couleurs indique la double série de dilution allant de 10 % à 0,01 % de DMSO et voici une carte représentative de l’intensité de fluorescence avec des valeurs de faible flux de thallium indiquées par un bleu plus foncé. Les valeurs moyennes de flux de thallium enregistrées à partir des puits contenant les concentrations indiquées de DMSO sont résumées ici.

Cette figure montre la carte de la plaque source utilisée pour établir les courbes de réponse de concentration pour les inhibiteurs connus d’un canal KIR. Chaque composé est indiqué avec une couleur différente et est généralement plaqué sous la forme d’une série de dilution triple. Une carte représentative de l’intensité de fluorescence est présentée ici, et cette figure montre l’inhibition dose-dépendante de l’inhibiteur de flux de thallium par l’inhibiteur après son développement et son optimisation.

Le dosage du flux de thallium peut également être utilisé pour effectuer une variété de tests pharmacologiques de routine. Le dosage du flux de thallium a déjà été adapté pour être utilisé avec des canaux potassiques voltageisés et ligaturés, des canaux cationiques non sélectifs et même des transporteurs de potassium. N’oubliez pas que travailler avec du tellium peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que l’utilisation de gants et l’élimination appropriée des déchets, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.