Criblage à haut débit pour les petites molécules modulateurs de canaux potassiques entrants Rectifier

L'objectif général de cette procédure est de découvrir de nouveaux composés capables de moduler l'activité des canaux potassiques rectificateurs entrants. Cette étape est réalisée en semant d'abord des cellules HK 2 9 3, induites par la tétracycline et exprimant un canal KIR d'intérêt, dans une plaque de 384 puits. La deuxième étape consiste à charger les cellules avec un colorant rapporteur fluorescent au thallium appelé flu in two.

Ensuite, le colorant non incorporé est éliminé par lavage des cellules, puis remplacé par un tampon d'essai contenant un témoin véhicule ou des composés à tester. La dernière étape consiste à ajouter un tampon stimulateur dans les puits afin d'initier le flux de thallium. Enfin, un lecteur de plaques à fluorescence est utilisé pour identifier les composés modifiant le déplacement des ions thallium à travers le canal KIR.

L'avantage principal de cette méthode par rapport aux techniques existantes, telles que l'électrophysiologie par enregistrement en mode « patch clamp » manuel, est qu'elle permet à l'expérimentateur de réaliser des centaines d'expériences simultanément et des milliers d'expériences par jour. Cette méthode permet à l'expérimentateur de cribler des bibliothèques de milliers de petites molécules afin de découvrir des modulateurs des canaux potassiques rectificateurs entrants. Un jour avant l'expérience de flux de thallium, dissocier les cellules et quantifier la densité de la suspension cellulaire comme décrit dans le manuscrit associé. Ensuite, utiliser le milieu BH contenant 10 % de SBF dialysé pour ensemencer 20 000 cellules monoclonales, transfectées de façon stable avec un gène de canal KIR d'intérêt, dans chaque puits d'une plaque 384 puits revêtue d'aminocouche BD PureCoat, à l’aide d’un Thermo Multi Drop Combi ou d’une pipette multicanal. Le lendemain, examiner la plaque au microscope afin de s'assurer que les cellules sont adhérentes et uniformément réparties sur le fond des puits.

Ensuite, utiliser un laveur de plaques ELX 405 pour remplacer le milieu de culture cellulaire par le tampon HBSS destiné au dosage, en ajoutant 20 microlitres par puits. Préparer ensuite le flus dans la solution de chargement AM D 2:00 en centrifugeant brièvement le tube afin de dissoudre 50 microgrammes de flus en poudre 2 dans 100 microlitres de DMSO anhydre.

Ajoutez maintenant 50 microlitres d'une solution de F1 27 onique à 20 % poids par volume dans le DMSO au colorant. Mélangez en pipetant doucement. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de flus dans 2:00 AM onique F1 27 à 35 millilitres de milieu HBSS pour le test, tamponnez et mélangez délicatement.

Ensuite, ajoutez 20 µL de tampon de chargement du colorant dans chaque puits contenant déjà 20 µL de tampon d'essai HBSS. Incubez les cellules à température ambiante pendant environ une heure, pendant laquelle les cellules s'imbibent du colorant. Préparez une plaque de stimulation au thallium en dissolvant fraîchement 0,5 gramme de bicarbonate de sodium dans 50 millilitres de tampon de stimulation au thallium 5 x.

Ensuite, ajouter 50 microlitres de la solution dans chaque puits d'une plaque polypropylène de 384 puits. Après que les cellules ont été chargées avec du flus à 2:00 du matin, laver la plaque à l'aide d'un laveur de microplaque ELX 405. Ajouter ensuite 20 microlitres ou 40 microlitres de tampon de dosage HBSS dans chaque puits. La plaque est désormais prête pour les expériences.

Chargez les plaques de thallium et les plaques cellulaires dans un système de criblage fonctionnel de médicaments Hema Matsu ou un lecteur de plaque à imagerie cinétique équivalent doté de capacités de distribution intégrées de liquides, et utilisez des filtres appropriés pour les colorants à base de fluorescéine tels que flu oh four. Ensuite, configurez un protocole d'ajout unique pour ajouter 10 microlitres de cinq X Thallium series aux puits correspondants de la plaque cellulaire contenant 40 microlitres de tampon de dosage HBSS. Puis enregistrez la fluorescence de base à une fréquence d'échantillonnage de un hertz pendant au moins 10 secondes.

La fluorescence de puits à puits doit être uniforme et stable sur toute la plaque une fois les conditions optimales de semis cellulaire, de lavage et de chargement établies. En attendant, utilisez le pipeteur intégré à 384 canaux pour ajouter simultanément le tampon stimulateur au thallium dans chaque puits et poursuivez l’enregistrement pendant au moins deux minutes afin de capturer la vitesse et le pic de l’augmentation de fluorescence induite par le thallium pour une analyse ultérieure. Dans la série suivante d’expériences, évaluez l’uniformité et la reproductibilité du test en semant un inhibiteur témoin dans un puits sur deux de chaque colonne et chaque ligne d’une plaque de 384 puits, et en ajoutant du DMSO dans les autres puits comme témoin de véhicule.

Utilisez un pipeteur multicanal. Préparez une plaque de DMSO contenant le composé en pipetant un inhibiteur du canal KIR cible à la concentration déterminée précédemment, soit 80 microlitres par puits, dans un véhicule contenant 0,1 % de DMSO, dans une plaque polypropylène de 384 puits. Cette étape est réalisée en ajoutant un inhibiteur connu, en commençant par le puits A1, puis en alternant vers le puits B2, et ainsi de suite jusqu'au puits B24.

Répétez cette procédure avec le DMSO en commençant par le puits B1, puis ainsi de suite jusqu’au puits A24. Chargez maintenant les plaques contenant les cellules, le composé et le stimulus au thallium dans le lecteur de plaques. Ensuite, configurez un protocole d’ajout en deux étapes pour ajouter 20 microlitres de la série de composés à concentration 2 X dans les puits correspondants de la plaque de cellules contenant 20 microlitres de tampon de dosage HBSS.

Ajouter les composés à la plaque de cellules et les incuber jusqu'à 20 minutes à température ambiante. Enregistrer les flux de base en deux longueurs d'onde de fluorescence pendant au moins 10 secondes. Puis ajouter 10 microlitres de tampon au thallium 5 x à chaque puits de la plaque de cellules.

Répétez l'expérience pendant trois jours consécutifs afin d'établir la reproductibilité des résultats. Utilisez le flux de thallium dans les cellules traitées au DMSO et aux médicaments pour calculer une valeur du Z prime. Une mesure statistique de la variabilité entre puits parmi les deux populations de puits permet de calculer le Z prime à l'aide de cette formule basée sur les moyennes et les écarts-types de P et N, où P correspond à la valeur de flux non inhibé et N à la valeur de flux complètement inhibé.

Un test dont les valeurs ZPrime sont supérieures ou égales à 0,5 mesurées lors de trois journées distinctes est considéré comme adapté au criblage à haut débit. Ces figures illustrent quelques exemples de cartes de distribution cellulaire utilisées dans différents types d'expériences. Les positions des puits contenant des cellules non induites ou induites par la tétracycline sont indiquées en différentes couleurs.

Cette figure montre la carte de la plaque source utilisée pour déterminer la concentration optimale de thallium pour le développement du test et le criblage de composés. Le dégradé de couleur représente la série de dilutions par facteur trois, allant de 100 % à 0,002 % de thallium, et voici une carte représentative de l'intensité de fluorescence avec des couleurs allant du froid au chaud, indiquant des valeurs de flux de thallium faibles à élevées. La carte de mise en place des cellules présentée ici, ajustée à une fonction logistique à quatre paramètres pour la CRC au thallium, est utilisée pour déterminer une valeur EEC 80 de 15 % de thallium.

Cette figure montre la carte de la plaque source utilisée pour déterminer la tolérance au DMSO d'un test. Les colonnes 1 et 24 contiennent uniquement du tampon de test, tandis que le dégradé de couleur indique la série de dilutions par deux allant de 10 % à 0,01 % de DMSO, ainsi qu'une carte représentative de l'intensité de fluorescence, les faibles valeurs de flux de thallium étant indiquées par un bleu plus foncé. Les valeurs moyennes de flux de thallium enregistrées à partir des puits contenant les concentrations indiquées de DMSO sont résumées ici.

Cette figure présente la carte de la plaque source utilisée pour établir les courbes de réponse en fonction de la concentration des inhibiteurs connus d'un canal KIR. Chaque composé est indiqué par une couleur différente et est généralement disposé selon une série de dilutions par facteur trois. Une carte représentative de l'intensité de fluorescence est affichée ici, et cette figure illustre l'inhibition dépendante de la dose du flux de thallium par un inhibiteur, après son développement et son optimisation.

Le test de flux du thallium peut également être utilisé pour réaliser une variété de tests de pharmacologie courants. Ce test a déjà été adapté pour être utilisé avec des canaux potassiques voltage-dépendants et ligand-dépendants, des canaux cationiques non sélectifs, et même des transporteurs de potassium. N'oubliez pas que le travail avec le thallium peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants et une élimination appropriée des déchets, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.