Name: Criblage à haut débit pour les petites molécules modulateurs de canaux potassiques entrants Rectifier (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Découvrez un criblage à haut débit pour identifier des modulateurs de canaux potassiques entrants rectifier (Kir) utilisant un test de fluorescence au thallium. Cette méthode permet de dépister des milliers de composés pour la découverte de nouvelles thérapies.

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<ol><li>Ehrlich, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+rectifier+potassium+currents+as+a+target+for+atrial+fibrillation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129(2008).</li>
<li>Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+modulators+of+inward+rectifier+K%2B+channels%3A+recent+advances+and+future+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-molecule modulators of inward rectifier K+ channels: recent advances and future possibilities.</a> Future Med. Chem. 2 (5), 757(2010).</li>
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<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 37 (38), 13291(1998).</li>
<li>Jin, W., Lu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+stable+form+of+tertiapin%3A+a+high-affinity+inhibitor+for+inward-rectifier+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a stable form of tertiapin: a high-affinity inhibitor for inward-rectifier K+ channels.</a> Biochemistry. 38 (43), 14286(1999).</li>
<li>Roy, A., McDonald, P. R., Sittampalam, S., Chaguturu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+access+high+throughput+drug+discovery+in+the+public+domain%3A+a+Mount+Everest+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Open access high throughput drug discovery in the public domain: a Mount Everest in the making.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 11 (7), 764(2010).</li>
<li>Weaver, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thallium-sensitive%2C+fluorescence-based+assay+for+detecting+and+characterizing+potassium+channel+modulators+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells.</a> J. Biomol. Screen. 9 (8), 671(2004).</li>
<li>Lewis, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+reveals+a+small-molecule+inhibitor+of+the+renal+outer+medullary+potassium+channel+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening reveals a small-molecule inhibitor of the renal outer medullary potassium channel and.</a> 76 (5), 1094(2009).</li>
<li>Bhave, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+selective+small-molecule+inhibitor+of+Kir1.1%2C+the+renal+outer+medullary+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a selective small-molecule inhibitor of Kir1.1, the renal outer medullary potassium channel.</a> Mol. Pharmacol. 79 (1), 42(2011).</li>
<li>Raphemot, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+structure-activity+relationships+of+an+inhibitor+of+inward+rectifier+potassium+%28Kir%29+channels+with+preference+for+Kir2.3%2C+Kir3.x%2C+and+Kir7.1%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and structure-activity relationships of an inhibitor of inward rectifier potassium (Kir) channels with preference for Kir2.3, Kir3.x, and Kir7.1.</a> Front Pharmacol. 2, 75(2012).</li>
<li>Niswender, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+of+Gi%2Fo-linked+G+protein-coupled+receptor+coupling+to+potassium+channels+provides+new+insights+into+the+pharmacology+of+the+group+III+metabotropic+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A novel assay of Gi/o-linked G protein-coupled receptor coupling to potassium channels provides new insights into the pharmacology of the group III metabotropic glutamate receptors.</a> Mol. Pharmacol. 73 (4), 1213(2008).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Traitement des données: Une fois les données recueillies, une étape commune dans l&#39;analyse consiste à normaliser réponse de fluorescence de chaque puits, F, à sa valeur initiale au début de l&#39;expérience, F 0. Ceci est communément appelé le &quot;rapport statique» et symbolisé &quot;F / F 0&quot;. Dans le cas où F 0 est dominé par le colorant indicateur du fonctionnement rapport statique pour corriger sensiblement nombreux facteurs tels que disuniformit...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/4209/high-throughput-screening-for-small-molecule-modulators-inward">High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels</a>. The Protocol section has been updated.
The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |
to:
Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

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Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> pcDNA5/TO </td><td> Invitrogen </td><td> V1033-20 </td><td> Vecteur d&#39;expression inductible par la tétracycline </td></tr><tr><td> T-rex-cellules HEK293 </td><td> Invitrogen </td><td> R71007 </td><td> Lignée cellulaire inductible par la tétracycline </td></tr><tr><td> Lipofectamine LTX / Plus réactif </td><td> Invitrogen </td><td> 15338100 </td><td> Réactif de transfection </td></tr><tr><td> FBS </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S11550 </td><td> Milieux de culture cellulaire </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Milieux de culture cellulaire </td></tr><tr><td> Hygromycine B </td><td> Invitrogen </td><td> 10687-010 </td><td> Milieux de culture cellulaire </td></tr><tr><td> Blasticidine S </td><td> Invitrogen </td&gt; <td> R210-01 </td><td> Milieux de culture cellulaire </td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Milieux de culture cellulaire </td></tr><tr><td> HBSS-divalent gratuit </td><td> Mediatech </td><td> 21022CV </td><td> Lavage des cellules </td></tr><tr><td> Trypsine 0,25% </td><td> Mediatech </td><td> 25053CI </td><td> Dissociation cellulaire </td></tr><tr><td> Tétracycline-HCl </td><td> Sigma </td><td> T9823 </td><td> Réactif à induction </td></tr><tr><td> FBS dialyse </td><td> ATLANTA Biologicals </td><td> S12650 </td><td> Géloses </td></tr><tr><td> FluoZin-2 </td><td> Invitrogen </td><td> F24189 </td><td> Colorant fluorescent </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P-3000MP </td><td> Colorant de chargement </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14175 </td><td> Tampon de dosage </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td> Tampon de dosage </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td> Tl + relance tampon </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Tl + relance tampon </td></tr><tr><td> CaSO 4 • 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3771 </td><td> Tl + relance tampon </td></tr><tr><td> Le D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> Tl + relance tampon </td></tr><tr><td> Sulfate de thallium </td><td> Aldrich </td><td> 204625 </td><td> Tl + relance tampon </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> Tl + relance tampon </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D4540 </td><td> Solvant </td></tr><tr><td> Huit canaux pipette électronique </td><td> Biohit </td><td> E300 </td><td> Placage cellule en 384 -plaques à puits </td></tr><tr><td> BD PureCoat amine recouvertes de plaques 384 puits </td><td> BD Biosciences </td><td> 356719 </td><td> Microplaques de dosage </td></tr><tr><td> Echo qualifié 384-Eh bien polypropylène microplaque (384pp) </td><td> Labcyte </td><td> P-05525 </td><td> Microplaques sources composés </td></tr><tr><td> Microplaques en polypropylène de 384 puits </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 781280 </td><td></td></tr><tr><td> Multidrop Combi distributeur de réactif </td><td> Thermo Scientific </td><td> 5840300 </td><td></td></tr><tr><td> Laveur de microplaques ELx405 </td><td> BioTek </td><td> ELx405HT </td><td> Lavage de cellules automatisé </td></tr><tr><td> Echo manipulateur de liquide </td><td> Labcyte </td><td> Labcyte Echo 550 </td><td></td></tr><tr><td> Bravo automatisée plate-forme de manipulation des liquides </td><td> Agilent Technologies </td><td> Modèle standard </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu FDSS 6000 </td><td> Hamamatsu </td><td></td><td> Kinetic lecteur de plaque d&#39;imagerie </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Liste des Matériels et réactifs.

criblage à haut débit pour les petites molécules modulateurs de canaux potassiques entrants rectifier

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Certains membres de la famille redresseur canal potassique vers l&#39;intérieur (Kir) sont postulés cibles thérapeutiques pour une variété de troubles, y compris l&#39;hypertension, la fibrillation auriculaire, et de 1,2 douleur. Pour la plupart, toutefois, les progrès vers la compréhension de leur potentiel thérapeutique, voire fonctions physiologiques a été ralentie par le manque de bons outils pharmacologiques. En effet, la pharmacologie moléculaire de la famille redresseur entrant est restée loin derrière celle de la superfamille S4 de potassium voltage-dépendants (Kv), les canaux pour lesquels un certain nombre d&#39;affinité nanomolaire et très modulateurs sélectifs des toxines peptidiques ont été découverts 3. La toxine du venin d&#39;abeille tertiapin et ses dérivés sont de puissants inhibiteurs de Kir1.1 et Kir3 canaux 4,5, mais peptides sont d&#39;une utilité limitée thérapeutique ainsi que expérimentalement en raison de leurs propriétés antigéniques et la biodisponibilité médiocre, la stabilité métabolique et la pénétrance des tissus. Le développement de puissantset sélectifs de petites molécules sondes avec des propriétés pharmacologiques améliorées sera un élément clé pour bien comprendre la physiologie et le potentiel thérapeutique des canaux Kir. La moléculaire bibliothèques Sondes de production Network Center (MLPCN) supportée par le National Institutes of Health (NIH) Fonds commun a créé des opportunités pour les scientifiques académiques pour initier des campagnes de sonde de découverte de cibles moléculaires et les voies de signalisation dans le besoin d&#39;une meilleure pharmacologie 6. L&#39;offre aux chercheurs l&#39;accès MLPCN aux centres de dépistage l&#39;échelle industrielle et la chimie médicinale et de l&#39;informatique en charge de développer de petites molécules sondes pour élucider la fonction des gènes et des réseaux de gènes. L&#39;étape critique pour gagner l&#39;entrée à l&#39;MLPCN est le développement d&#39;un test robuste cible ou une voie spécifique qui est susceptible de criblage à haut débit (HTS). Ici, nous décrivons comment développer une base de fluorescence thallium (Tl +) flux assaY sur Kir canal de fonction pour le criblage à haut débit composé 7,8,9,10. L&#39;essai est basé sur la perméabilité de la chaîne K + pores de la Tl + K + congénère. Un disponibles dans le commerce fluorescent Tl + colorant reporter est utilisé pour détecter le flux transmembranaire de Tl + à travers le pore. Il ya au moins trois colorants disponibles dans le commerce qui sont appropriés pour Tl + tests de flux: BTC, FluoZin-2, 7,8 et Fluxor. Ce protocole décrit le développement de tests à l&#39;aide FluoZin-2. Bien qu&#39;à l&#39;origine développés et commercialisés comme un indicateur de zinc, FluoZin-2 présente une augmentation forte et dose-dépendante de l&#39;émission de fluorescence lors de Tl + contraignant. Nous avons commencé à travailler avec FluoZin-2 avant Fluxor était disponible 7,8 et ont continué à le faire 9,10. Cependant, les étapes de développement de tests sont essentiellement identiques pour les trois colorants, et les utilisateurs devraient déterminer quels colorant est le plus approprié pour leur propre needs. Nous discutons également des critères de performance de l&#39;analyse qui doit être atteint à prendre en considération pour l&#39;entrée à l&#39;MLPCN. Depuis Tl + imprègne facilement la plupart des canaux K +, le dosage doit être adapté à la plupart des objectifs de canaux K +.

L&#39;utilisation d&#39;un système d&#39;expression inductible par la tétracycline permet un contrôle pratique interne pour distinguer Tl + flux à travers les voies endogènes et le canal Kir d&#39;intérêt. Figure 1 montre quelques exemples de cartes de placage de cellules utilisées dans différents types d&#39;expériences. Les positions des puits contenant les cellules non induites ou induite par la tétracycline sont indiquées par des couleurs différentes. Figure 2A représente...

Méthodes d&#39;élaboration et de validation d&#39;un dosage quantitatif de fluorescence pour mesurer l&#39;activité de potassium redresseur actif (Kir) des canaux pour le criblage de composés à haut débit est présenté.

Criblage à haut débit pour les petites molécules modulateurs de canaux potassiques entrants Rectifier

Certains membres de la famille des canaux potassiques rectifieurs entrants (Kir) sont postulés comme cibles thérapeutiques pour divers troubles, dont l'hypertension, ...

L'objectif général de cette procédure est de découvrir de nouveaux composés capables de moduler l'activité des canaux potassiques rectificateurs entrants. Cette étape est réalisée en semant d'abord des cellules HK 2 9 3, induites par la tétracycline et exprimant un canal KIR d'intérêt, dans une plaque de 384 puits. La deuxième étape consiste à charger les cellules avec un colorant rapporteur fluorescent au thallium appelé flu in two.Ensuite, le colorant non incorporé est éliminé par lavage des cellules, puis remplacé par un tampon d'essai contenant un témoin véhicule ou des composés à tester. La dernière étape consiste à ajouter un tampon stimulateur dans les puits afin d'initier le flux de thallium. Enfin, un lecteur de plaques à fluorescence est utilisé pour identifier les composés modifiant le déplacement des ions thallium à travers le canal KIR.L'avantage principal de cette méthode par rapport aux techniques existantes, telles que l'électrophysiologie par enregistrement en mode « patch clamp » manuel, est qu'elle permet à l'expérimentateur de réaliser des centaines d'expériences simultanément et des milliers d'expériences par jour. Cette méthode permet à l'expérimentateur de cribler des bibliothèques de milliers de petites molécules afin de découvrir des modulateurs des canaux potassiques rectificateurs entrants. Un jour avant l'expérience de flux de thallium, dissocier les cellules et quantifier la densité de la suspension cellulaire comme décrit dans le manuscrit associé. Ensuite, utiliser le milieu BH contenant 10 % de SBF dialysé pour ensemencer 20 000 cellules monoclonales, transfectées de façon stable avec un gène de canal KIR d'intérêt, dans chaque puits d'une plaque 384 puits revêtue d'aminocouche BD PureCoat, à l’aide d’un Thermo Multi Drop Combi ou d’une pipette multicanal. Le lendemain, examiner la plaque au microscope afin de s'assurer que les cellules sont adhérentes et uniformément réparties sur le fond des puits.Ensuite, utiliser un laveur de plaques ELX 405 pour remplacer le milieu de culture cellulaire par le tampon HBSS destiné au dosage, en ajoutant 20 microlitres par puits. Préparer ensuite le flus dans la solution de chargement AM D 2:00 en centrifugeant brièvement le tube afin de dissoudre 50 microgrammes de flus en poudre 2 dans 100 microlitres de DMSO anhydre.Ajoutez maintenant 50 microlitres d'une solution de F1 27 onique à 20 % poids par volume dans le DMSO au colorant. Mélangez en pipetant doucement. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de flus dans 2:00 AM onique F1 27 à 35 millilitres de milieu HBSS pour le test, tamponnez et mélangez délicatement.Ensuite, ajoutez 20 µL de tampon de chargement du colorant dans chaque puits contenant déjà 20 µL de tampon d'essai HBSS. Incubez les cellules à température ambiante pendant environ une heure, pendant laquelle les cellules s'imbibent du colorant. Préparez une plaque de stimulation au thallium en dissolvant fraîchement 0,5 gramme de bicarbonate de sodium dans 50 millilitres de tampon de stimulation au thallium 5 x.Ensuite, ajouter 50 microlitres de la solution dans chaque puits d'une plaque polypropylène de 384 puits. Après que les cellules ont été chargées avec du flus à 2:00 du matin, laver la plaque à l'aide d'un laveur de microplaque ELX 405. Ajouter ensuite 20 microlitres ou 40 microlitres de tampon de dosage HBSS dans chaque puits. La plaque est désormais prête pour les expériences.Chargez les plaques de thallium et les plaques cellulaires dans un système de criblage fonctionnel de médicaments Hema Matsu ou un lecteur de plaque à imagerie cinétique équivalent doté de capacités de distribution intégrées de liquides, et utilisez des filtres appropriés pour les colorants à base de fluorescéine tels que flu oh four. Ensuite, configurez un protocole d'ajout unique pour ajouter 10 microlitres de cinq X Thallium series aux puits correspondants de la plaque cellulaire contenant 40 microlitres de tampon de dosage HBSS. Puis enregistrez la fluorescence de base à une fréquence d'échantillonnage de un hertz pendant au moins 10 secondes.La fluorescence de puits à puits doit être uniforme et stable sur toute la plaque une fois les conditions optimales de semis cellulaire, de lavage et de chargement établies. En attendant, utilisez le pipeteur intégré à 384 canaux pour ajouter simultanément le tampon stimulateur au thallium dans chaque puits et poursuivez l’enregistrement pendant au moins deux minutes afin de capturer la vitesse et le pic de l’augmentation de fluorescence induite par le thallium pour une analyse ultérieure. Dans la série suivante d’expériences, évaluez l’uniformité et la reproductibilité du test en semant un inhibiteur témoin dans un puits sur deux de chaque colonne et chaque ligne d’une plaque de 384 puits, et en ajoutant du DMSO dans les autres puits comme témoin de véhicule.Utilisez un pipeteur multicanal. Préparez une plaque de DMSO contenant le composé en pipetant un inhibiteur du canal KIR cible à la concentration déterminée précédemment, soit 80 microlitres par puits, dans un véhicule contenant 0,1 % de DMSO, dans une plaque polypropylène de 384 puits. Cette étape est réalisée en ajoutant un inhibiteur connu, en commençant par le puits A1, puis en alternant vers le puits B2, et ainsi de suite jusqu'au puits B24.Répétez cette procédure avec le DMSO en commençant par le puits B1, puis ainsi de suite jusqu’au puits A24. Chargez maintenant les plaques contenant les cellules, le composé et le stimulus au thallium dans le lecteur de plaques. Ensuite, configurez un protocole d’ajout en deux étapes pour ajouter 20 microlitres de la série de composés à concentration 2 X dans les puits correspondants de la plaque de cellules contenant 20 microlitres de tampon de dosage HBSS.Ajouter les composés à la plaque de cellules et les incuber jusqu'à 20 minutes à température ambiante. Enregistrer les flux de base en deux longueurs d'onde de fluorescence pendant au moins 10 secondes. Puis ajouter 10 microlitres de tampon au thallium 5 x à chaque puits de la plaque de cellules.Répétez l'expérience pendant trois jours consécutifs afin d'établir la reproductibilité des résultats. Utilisez le flux de thallium dans les cellules traitées au DMSO et aux médicaments pour calculer une valeur du Z prime. Une mesure statistique de la variabilité entre puits parmi les deux populations de puits permet de calculer le Z prime à l'aide de cette formule basée sur les moyennes et les écarts-types de P et N, où P correspond à la valeur de flux non inhibé et N à la valeur de flux complètement inhibé.Un test dont les valeurs ZPrime sont supérieures ou égales à 0,5 mesurées lors de trois journées distinctes est considéré comme adapté au criblage à haut débit. Ces figures illustrent quelques exemples de cartes de distribution cellulaire utilisées dans différents types d'expériences. Les positions des puits contenant des cellules non induites ou induites par la tétracycline sont indiquées en différentes couleurs.Cette figure montre la carte de la plaque source utilisée pour déterminer la concentration optimale de thallium pour le développement du test et le criblage de composés. Le dégradé de couleur représente la série de dilutions par facteur trois, allant de 100 % à 0,002 % de thallium, et voici une carte représentative de l'intensité de fluorescence avec des couleurs allant du froid au chaud, indiquant des valeurs de flux de thallium faibles à élevées. La carte de mise en place des cellules présentée ici, ajustée à une fonction logistique à quatre paramètres pour la CRC au thallium, est utilisée pour déterminer une valeur EEC 80 de 15 % de thallium.Cette figure montre la carte de la plaque source utilisée pour déterminer la tolérance au DMSO d'un test. Les colonnes 1 et 24 contiennent uniquement du tampon de test, tandis que le dégradé de couleur indique la série de dilutions par deux allant de 10 % à 0,01 % de DMSO, ainsi qu'une carte représentative de l'intensité de fluorescence, les faibles valeurs de flux de thallium étant indiquées par un bleu plus foncé. Les valeurs moyennes de flux de thallium enregistrées à partir des puits contenant les concentrations indiquées de DMSO sont résumées ici.Cette figure présente la carte de la plaque source utilisée pour établir les courbes de réponse en fonction de la concentration des inhibiteurs connus d'un canal KIR. Chaque composé est indiqué par une couleur différente et est généralement disposé selon une série de dilutions par facteur trois. Une carte représentative de l'intensité de fluorescence est affichée ici, et cette figure illustre l'inhibition dépendante de la dose du flux de thallium par un inhibiteur, après son développement et son optimisation.Le test de flux du thallium peut également être utilisé pour réaliser une variété de tests de pharmacologie courants. Ce test a déjà été adapté pour être utilisé avec des canaux potassiques voltage-dépendants et ligand-dépendants, des canaux cationiques non sélectifs, et même des transporteurs de potassium. N'oubliez pas que le travail avec le thallium peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants et une élimination appropriée des déchets, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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