L'homme neuroendocriniennes lignées cellulaires tumorales comme un modèle tridimensionnel pour l'étude de la thérapie des tumeurs neuro-endocrines humaines

L'objectif général de l'expérience suivante est de développer une méthode simple et facile pour produire des stéroïdes uniformes de tumeurs neuroendocrines tridimensionnelles, ainsi qu'une méthode simple pour traiter l'inclusion en HistoGel afin d'étudier l'histologie de ces stéroïdes. Cela est réalisé en recouvrant uniformément des plaques 24 puits d'aéros, sur lesquels on ensemence des cellules humaines de tumeur neuroendocrine en suspension monocellulaire. La plaque est ensuite incubée toute la nuit dans l'incubateur sur un agitateur orbital à une vitesse inférieure à 40 tr/min, puis transférée sur une étagère stable de l'incubateur.

Les sphéroïdes se formeront au troisième ou quatrième jour, et leur croissance ainsi que leur intégrité sont surveillées par microscopie en contraste de phase afin d'étudier leur histologie. Les stéroïdes tridimensionnels sont inclus dans du HistoGel tiédi avant un traitement classique à la paraffine, ce qui permet d'obtenir des résultats montrant la croissance de tumeurs neuroendocrines sous forme de stéroïdes tridimensionnels, basés sur des images prises en microscopie en contraste de phase. L'histologie des stéroïdes tridimensionnels est analysée par coloration hématoxyline-éosine (H&E) et par coloration immunohistochimique de coupes en blocs de paraffine des stéroïdes tridimensionnels.

L'avantage principal de cette technique par rapport à la méthode existante réside dans sa simplicité, sa facilité d'utilisation, sa fiabilité et son faible coût. Cette méthode peut faciliter la recherche dans le domaine de la découverte de médicaments en permettant d'identifier rapidement des traitements thérapeutiques pour les patients atteints de tumeurs neuroendocrines. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront initialement au moins des difficultés à cultiver des stéroïdes tridimensionnels de forme et de taille uniformes.

La clé réside dans le fait de s'assurer que vos plaques de 24 puits soient uniformément enrobées d'agarose et que vos suspensions monocellulaires soient bien dispersées et précises. Pour analyser l'histologie des stéroïdes en 3D, nous devons effectuer un traitement parenchymateux et une coloration immunochimique. L'inclusion histologique des stéroïdes en 3D constitue l'étape clé qui sera démontrée ultérieurement aujourd'hui. Pour préparer 1 % d'agarose destiné à l'ensemencement des plaques de 24 puits, ajoutez un gramme d'agarose à 100 millilitres d'eau déionisée dans un flacon de 250 à 500 millilitres, puis stérilisez l'agarose par autoclavage après stérilisation.

Transférez le flacon dans un bain-marie à 70 degrés Celsius pendant environ une heure. Pour que les aéros refroidissent à 70 degrés Celsius, ils doivent rester stériles en tout temps. Dans une hotte de sécurité biologique, utilisez une pipette répétitive pour distribuer 200 microlitres d’aéros dans chaque puits de 2 24.

Plaques plates à fond plat pour ce protocole. Tout type de plaque à 24 puits à fond plat conviendra, à condition que les plaques puissent être observées au microscope en contraste de phase. Agiter doucement l’aérosol dans le puits afin qu’il le recouvre uniformément. Un volume de 200 microlitres d’aérosol est optimal pour former une surface concave permettant aux sphéroïdes d’adopter des formes sphériques régulières.

Après environ 10 minutes, les plaques de 24 puits revêtues d’aérosol sont prêtes à être utilisées. Les cellules bon une utilisées dans cette expérience sont des cellules humaines de tumeur neuroendocrine du pancréas, ou cellules NET, cultivées dans un milieu D-M-E-M-F 12 contenant 10 % de FBS, dans une boîte de culture tissulaire stérile, dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Lorsque les cellules bon une en monocouche atteignent une confluence de 70 à 80 %, des suspensions de cellules simples sont préparées dans une cabine de sécurité biologique.

Retirer le milieu et laver les cellules deux fois avec du PBS pour détacher les cellules de la plaque en ajoutant un millilitre de trip le et en incubant à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Vérifier au microscope que toutes les cellules sont détachées de la plaque, puis ajouter neuf millilitres de milieu de croissance à la trypsine.

Pipetez les cellules oculaires plusieurs fois vers le haut et vers le bas afin d'assurer une suspension uniforme de cellules isolées. Utilisez un tamis cellulaire de 70 microns pour filtrer les cellules. Après avoir effectué un décompte cellulaire, récupérez les cellules filtrées et préparez une suspension de 5 000 cellules par millilitre dans du D-M-E-M-F 12 contenant 10 % de FBS comme milieu de croissance.

Le nombre de cellules à semer doit être déterminé empiriquement en fonction de la taille des sphères au jour six. Idéalement, on cherche à obtenir une taille de sphéroïde comprise entre 300 et 400 nanomètres de diamètre. Pour cette raison, nous semons mille cellules par 200 microlitres par puits.

Pour commencer cette procédure, déposez 200 microlitres de la suspension de cellules uniques dans chaque puits revêtu d’aéro de plaques 24 puits préparées au préalable, puis scellez les plaques 24 puits avec du ruban adhésif stérile afin d’éviter l’évaporation. Placez les plaques 24 puits revêtues d’aéro contenant les cellules bon une sur un agitateur orbital avec une agitation très lente, dans un incubateur humide à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone dans l’air, incubez toute la nuit. Le lendemain matin, déplacez les plaques sur une plateforme stable et maintenez la culture dans l’incubateur. Tous les trois jours.

Ajouter 200 microlitres de milieu de croissance dans chaque puits des plaques. Pour éviter de perturber les phe, toucher la paroi du puits avec la pointe de pipette et laisser le milieu s'écouler le long de la paroi dans le puits. Observer la formation des OID dans les plaques à 24 puits au microscope. Le traitement pharmacologique des stéroïdes en 3D est initié au sixième jour de culture.

Lorsque les sphéroïdes ont un diamètre d'environ 300 à 400 microns, ce stade est désigné comme le jour zéro pour le traitement médicamenteux au jour six. Chaque puits des plaques contient environ 400 microlitres de milieu afin de garantir que les traitements médicamenteux atteignent une concentration finale de un x dans chaque puits. Pour chaque dose de traitement, préparez une solution trois fois plus concentrée que la concentration souhaitée, en diluant la quantité appropriée de solution mère du médicament dans cinq millilitres de milieu de croissance dans un tube conique de 15 millilitres, ce qui est suffisant pour huit réplicats. Les PHE de chaque rangée des plaques à 24 puits sont caractérisés comme étant le véhicule, la dose 1, 2, 3, 4 et 5. Il existe quatre réplicats pour chaque dose de traitement sur chaque plaque à 24 puits.

En général, les PHE en 3D sont traités dans au moins deux plaques de 24 puits, ce qui donne au moins huit réplicats pour chaque dose de traitement. Avant d'ajouter le traitement à chaque puits, faire centrifuger les plaques de 24 puits afin de s'assurer que toute la condensation présente sur le ruban du couvercle descende dans les puits, en raison du caractère flottant du stéroïde en 3D. Le milieu de chaque puits n'est pas éliminé après la centrifugation.

Pour éviter de perturber la sphère, ajoutez soigneusement 200 microlitres de chaque dose de traitement dans les puits appropriés le long de la paroi de chacun. Scellez hermétiquement les plaques 24 puits avec du ruban adhésif et incubez les cultures dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone dans l'air. Surveillez les cultures stéroïdes en 3D à chaque point temporel choisi après le traitement médicamenteux à l’aide d’un microscope à contraste de phase.

Un objectif 5 x est idéal, car les PHE dépassent rapidement le champ d’imagerie avec un objectif 10 x. Acquérir des images du stéroïde dans chaque puits à chaque point temporel avant l’ajout de HistoGel. Après l’incorporation, les stéroïdes tridimensionnels nets sont prélevés à partir des plaques 24 puits et fixés dans du Formol 10 %.

Placer un tube d'HistoGel froid dans un bécher rempli d'eau. Chauffer le bécher au micro-ondes pendant une minute ou jusqu'à ce que le gel soit complètement liquéfié. Garder le tube dans le même bécher rempli d'eau pendant toute la durée de la procédure.

À l’aide d’une pipette plastique jetable, transférez tout le stéroïde dans un moule à biopsie cryo. Laissez le stéroïde reposer pendant une minute afin qu’il sédimente au fond du moule à biopsie cryo.

Essayez de retirer le liquide du moule à biopsie cryogénique à l'aide de lingettes Kim. Poussez très délicatement le stéroïde vers le centre au fond du moule à biopsie cryogénique à l'aide d'un cure-dent. Ensuite, tout en utilisant la pipette Pasteur, maintenez très doucement le stéroïde au centre du moule à biopsie cryogénique.

Ajouter une fine couche de HistoGel réchauffé dans le moule cryogénique pour biopsie. N'ajoutez pas trop de HistoGel. Il doit simplement suffire à stabiliser les stéroïdes au centre.

Laisser le stéroïde dans l'HistoGel pendant une à deux minutes à température ambiante ou jusqu'à ce que l'HistoGel soit solidifié. Remplir le reste du moule cryogénique pour biopsie avec de l'HistoGel tiédi et laisser solidifier à température ambiante pendant environ 10 minutes. Juste avant d'extraire ce bloc d'HistoGel contenant les OIDs du moule cryogénique pour biopsie.

Laisser le moule cryogénique sur de la glace pendant une minute, puis extraire délicatement le bloc intact de HistoGel stéroïdal. Envelopper le bloc dans un morceau de papier d’emballage bio et le placer dans une cassette pour tissus et biopsies. Conserver la cassette contenant le tissu dans un récipient rempli d’éthanol à 70 %.

Par la suite, des procédures habituelles de traitement des tissus pour l'inclusion en paraffine sont réalisées lorsque les cellules sont cultivées sur des plaques de type « aeros » à 24 puits. Différentes lignées cellulaires de NET présentent des morphologies variées, comme illustré ici. La lignée cellulaire humaine de NET du pancréas, BON-1, et la lignée cellulaire humaine de NET du poumon, H727, forment des stéroïdes en 3D.

En revanche, qgp un. Les cellules pancréatiques humaines forment de grosses masses poreuses en grappes, qui ne sont pas considérées comme des stéroïdes. Après l'ensemencement des cellules un sur une plaque de 24 puits revêtue d'agros, la formation multiculturelle de stéroïdes se produit généralement le troisième ou le quatrième jour, et les stéroïdes deviennent plus arrondis au sixième jour.

En raison de la limitation en nutriments et en oxygène, les cellules situées au cœur dense du stéroïde commencent à mourir vers le jour 10 et, au jour 17, les stéroïdes commencent à se désagréger. En raison de leur grande taille ou, dans certains cas, de l'expulsion du cordon nécrosé, les stéroïdes peuvent généralement atteindre un diamètre de 1000 microns.

Dans cette expérience, des stéroïdes 3D du jour six ont été choisis comme point de départ pour le traitement avec l'inhibiteur de l'histone désacétylase trikes statine A ou TSA. Il a été rapporté précédemment que les inhibiteurs de l'histone désacétylase exercent des effets antiprolifératifs et proto sur les cellules nerveuses. Ces images montrent la morphologie des stéroïdes 3D au début du traitement ainsi qu'après 24, 48, 72 et 96 heures.

V indique le traitement avec le véhicule, qui est dans ce cas du DMSO. D un à D cinq représentent le traitement avec des doses croissantes de TSA en fonction de la taille de chaque individu. L'OID a été estimé automatiquement par un programme informatique personnalisé développé sous MATLAB.

Au moins huit sphères ont été mesurées par dose de traitement à la TSA à chaque point temporel, et les résultats sont représentés sur ce graphique par rapport au témoin. Toutes les doses de TSA ont montré un certain degré d'inhibition de la croissance des ODI tridimensionnels. À des concentrations de TSA de 125 nanomolaire et 250 nanomolaire, la croissance des stéroïdes tridimensionnels a été fortement supprimée afin de comprendre l'histologie des stéroïdes tridimensionnels résiduels.

Les colorations H et E et les colorations immunohistochimiques ont été réalisées sur des stéroïdes en 3D cultivés pendant 17 jours. KI 67 est un marqueur des cellules en prolifération, tandis que la caspase-3 clivée est un marqueur des cellules apoptotiques. Les résultats indiquent que les cellules de la couche externe des stéroïdes en 3D prolifèrent activement, mais que les cellules situées au niveau du noyau sont majoritairement nécrotiques ou apoptotiques.

Après cette procédure, des tests supplémentaires tels que le test Cell Titer-Glo peuvent être réalisés afin de déterminer la viabilité cellulaire de ces stéroïdes 3D. Une fois développée, cette technique peut être adaptée à des plaques de 96 puits pour effectuer des criblages à haut débit, ce qui facilitera la découverte de médicaments thérapeutiques en recherche contre le cancer.