Name: Modification piggyBac système transposon des cellules T humaines primaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Découvrez la modification génétique stable des cellules T humaines primaires par le système de transposon piggyBac non viral. Cette méthode permet une expression transgénique durable pour la recherche et la thérapie cellulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SS est soutenu en partie par le HHMI Med en Grad Subvention de formation par l&#39;intermédiaire du Programme TBMM. MHW est soutenu en partie par une bourse de développement de carrière du ministère des Anciens combattants et le soutien généreux de M. et Mme Harold M. Selzman. Ce travail a également été soutenu en partie par le NIH lymphome SPORE P50CA126752 subvention et le NIH R01 DK093660.

Jour 0 1. Isolation des PBMC à partir de sang humain <ol><li> Recueillir 20 ml de sang humain frais en utilisant ponction veineuse dans des tubes Vacutainer Na-héparine. </li><li> Mélanger le sang et avancée RPMI 1640 en 1:1 (v / v). </li><li> Ajouter 20 ml Lymphoprep moyen d&#39;un tube à centrifuger de 50 ml (25 ° C). Lentement couche de 25-30 ml de sang RPMI 1640 mélange sur le dessus du Lymphoprep. </li><li> Centrifuger à 400 xg pendant 40 min sans freins. </li><li> Recueillir les deux couches distinctes et floue à l&#39;aide d&#39;une pipette jetable dans 10 ml de PBS 1x (25 ° C) et porter le volume à 50 ml avec du PBS 1x. </li><li> Centrifuger à 450 xg pendant 10 min. </li><li> Aspirer le surnageant et ajouter 20 ml de RPMI 1640 avancée. </li><li> Centrifuger à 400 xg pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant. Ajouter 10 ml de milieu complet de lymphocytes T additionné de 5 ng / ml rhIL-15 préchauffé à 37 ° C. </li><li> Compter le nombre de cellules et la plaque en 24 manteau de culture de tissus ainsied plaque à 2 x 10 6 cellules / puits dans les médias complets de lymphocytes T supplémenté avec 5 ng / ml rhIL-15 Ajouter de l&#39;eau stérile pour puits environnants. Incuber une nuit dans un incubateur humidifié à 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> Jour 1 2. Les plaques de revêtement avec un anticorps anti-CD28 et anti-CD3 pour stimuler les lymphocytes T <ol><li> Diluer anticorps anti-CD28 et anti-CD3 dans de l&#39;eau stérile à une concentration de 1 pg / ml. </li><li> Ajouter 500 ul de solution d&#39;anticorps à chaque 5 puits marqués d&#39;une culture de tissu non enduit plaque à 24 puits. </li><li> Ajouter de l&#39;eau stérile pour se reposer des puits. Enveloppez la plaque dans une pellicule rétractable et placer au réfrigérateur 4 ° C. </li></ol> 3. Nucléofection de cellules T non stimulés <ol><li> Préchauffer médias lymphocytes T à 37 ° C et un supplément de 5 ng / ml de rhIL-15. Préparer une solution complète Nucleofector en ajoutant 500 ul de supplément Nucleofector 1 à 2,25 ml de solution Nucleofector. </li><li> Aliquot 5 ug chacun des transposon (Zeo-pT-CMV-eGFP) et la transposase (pCMV-piggyBac) dans un tube de 1,5 ml. Remarque: il peut être nécessaire d&#39;optimiser la transposase et la quantité d&#39;ADN du transposon pour la livraison génique optimale et de minimiser toxicité cellulaire. Les plasmides peuvent être obtenus auprès des auteurs sur demande. </li><li> PBMC récolte de la plaque 24 tissus et la culture dans un tube de 50 ml. Compter le nombre de cellules. Enregistrer 2 x 10 6 cellules pour une utilisation en tant que commande au cours de la cytométrie en flux. </li><li> Ajouter 7-10 x 10 6 cellules dans un tube de 15 ml et centrifuger à 400 xg, 5 min, aspirer le surnageant et le doigt du coup de la pastille. </li><li> Ajouter 100 ul de cellules T nucléofection solution complète à la cellule desserré granulés. </li><li> Ajouter le mélange de solution de cellules dans le tube contenant les plasmides. </li><li> Ajouter le mélange de solution de cellule de plasmide au fond de la cuvette nucléofection. Veillez à ne pas introduire de bulles. </li><li> Nucleofect les cellules en utilisant programme U-014 (cellules T non stimulés, l&#39;homme, <a href="http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/" target="_blank">http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/</a> ). </li><li> Immédiatement ajouter 500 ul de médias préchauffé avec rhIL-15 à la cuvette. Transférer les cellules à un puits d&#39;une plaque à 24 puits avec 1,5 ml de milieu préchauffé à rhIL15. </li><li> Incuber une nuit dans un incubateur humidifié à 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> Jour 2 4. La stimulation non spécifique des cellules T <ol><li> Récolte des cellules et de déterminer le nombre de cellules. Annuler 0,5 x 10 6 cellules par cytométrie en flux pour déterminer la fréquence de cellules GFP-positives. Utilisez les PBMC non transfectées comme témoins. </li><li> Aspirer la solution CD3/28 anticorps de la plaque de culture de tissu non enduit et rincer chaque puits avec les médias de lymphocytes T. </li><li> Remettre en suspension les cellules nucleofected à 0,5 x 10 6 cellules par ml dans les médias complets CTLadditionné de 5 ng / ml de rhIL-15. Ajouter 2,0 ml de chacune des cellules nucleofected à 4 puits de la plaque de culture de tissus non. Ajouter 0,5 x 10 6 cellules non nucleofected au 5 bien. </li><li> Incuber pendant 3 jours dans un incubateur humidifié à 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> Jour 5 <ol><li> Récolter les cellules T stimulées à partir de la plaque non revêtue de la culture tissulaire. </li><li> Compter et Réensemencement les cellules dans un 24 plaque de culture tissulaire pour bien les enrober à 0,7 x 10 6 cellules / ml dans un milieu de lymphocytes T avec 5 ng / ml d&#39;IL-15. </li></ol> Jour 7 7. L&#39;analyse de l&#39;expression des gènes <ol><li> Cellules de récolte et se colorent avec anti-humain CD8 (peut également utiliser l&#39;anti-CD3 et anti-CD4) et d&#39;analyser avec la cytométrie en flux pour l&#39;expression de la GFP%. </li></ol> Jour 8 (Facultatif) 8. L&#39;expansion des cellules T <ol><li> Le jour 8 après transfection, les cellules T peuvent être réensemencées en TDes cellules support avec l&#39;IL-15 à une densité de 0,7 x 10 6 cellules par puits d&#39;une nouvelle expansion 16. </li></ol>

<ol><li>Cary, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mutagenesis+of+baculoviruses%3A+analysis+of+Trichoplusia+ni+transposon+IFP2+insertions+within+the+FP-locus+of+nuclear+polyhedrosis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses.</a> Virology. 172 (1), 156(1989).</li>
<li>Fraser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+for+movement+of+Lepidopteran+transposon+IFP2+in+insect+cells+using+a+baculovirus+genome+as+a+target+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA.</a> Virology. 211 (2), 397(1995).</li>
<li>Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transposition+of+the+piggyBac+%28PB%29+transposon+in+mammalian+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473(2005).</li>
<li>Saridey, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac+transposon-based+inducible+gene+expression+in+vivo+after+somatic+cell+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer.</a> Mol. Ther. 17 (12), 2115(2009).</li>
<li>Nakanishi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposon-mediated+long-term+gene+expression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice.</a> Mol. Ther. 18 (4), 707(2010).</li>
<li>Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac+Transposon-mediated+Gene+Transfer+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells.</a> Mol. Ther. 15 (1), 139(2007).</li>
<li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+PiggyBac+transposon+system+for+the+sustained+genetic+modification+of+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes.</a> J. Immunother. 32 (8), 826(2009).</li>
<li>Raja Manuri, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposon%2Ftransposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+treatment+of+B-lineage+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21 (4), 427(2010).</li>
<li>Doherty, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+piggyBac+gene+transfer+in+human+cells+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo.</a> Hum. Gene Ther. , In Press (2011).</li>
<li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531(2011).</li>
<li>Bonini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of T cells.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S15-S20 (2011).</li>
<li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon+and+transposase+system+for+human+application%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18 (4), 1531(2010).</li>
<li>Galvan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+PiggyBac+transposon+integrations+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells.</a> J. Immunother. 32 (8), 837(2009).</li>
<li>Nakazawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac-Mediated+Cancer+Immunotherapy+Using+EBV-Specific+Cytotoxic+T-Cells+Expressing+HER2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2133(2011).</li>
<li>Huye, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+mTor+Inhibitors+With+Rapamycin-resistant+T+Cells%3A+A+Two-pronged+Approach+to+Tumor+Elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination.</a> Mol. Ther. 19 (12), 2239(2011).</li>
<li>Vera, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+%28G-Rex%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex).</a> J. Immunother. 33 (3), 305(2010).</li>
<li>Kahlig, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+transposon-mediated+stable+gene+transfer+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343(2010).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le procédé décrit ici permet de modifier transgène stable de lymphocytes T humains primaires. Nous avons déjà testé l&#39;utilisation du système piggyBac transposon pour modifier des cellules T pour exprimer un gène rapporteur (pour plus de 4 semaines), un gène suicide non immunogène, un récepteur d&#39;antigène chimérique pour l&#39;immunothérapie adoptive (pour plus de 100 jours), et à concevoir une résistance aux médicaments immunosuppresseurs 7,13-15. Non-virale modification des cellules T pour u...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Lympholyte </td><td> Cedarlane </td><td> CL5015 </td><td></td></tr><tr><td> Avancée RPMI 1640 </td><td> LifeTechnologies </td><td> 12633020 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone sérum de veau fœtal </td><td> Fisher Scientific </td><td> SH3008803 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax-je Supplément </td><td> LifeTechnologies </td><td> 35050-061 </td><td></td></tr><tr><td> IL-15 humaine protéine recombinante </td><td> eBioscience </td><td> 14-8159 </td><td></td></tr><tr><td> Kit Endofree Plasmid Maxi </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001S </td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Cellules T humaines Nucleofector Kit </td><td> Lonza </td><td> APV-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CD8-APC </td><td> Southern Biotech </td><td> 9536-11 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human CD3 </td><td> eBioscience </td><td> 16-0037-81 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Human CD28 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555725 </td><td></td></tr><tr><td> Plate 24 Tissue Culture Eh bien traitée </td><td> BD Falcon </td><td> 353047 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Culture tissulaire Eh bien non traitée Plate </td><td> BD Falcon </td><td> 351147 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Complète des cellules T médias composition 1x avancée RPMI 1640 5% inactivé par la chaleur du sérum fœtal bovin 2 mM GlutamaxIM-I </td></tr></tbody></table>

modification piggybac système transposon des cellules t humaines primaires

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Le système piggyBac transposon est active par sa nature, l&#39;origine dérivé de la 1,2 arpenteuse du chou papillon. Ce système non viral est un plasmide à base, le plus souvent en utilisant deux plasmides avec une expression de l&#39;enzyme transposase piggyBac et un transposon plasmide hébergeant le gène (s) d&#39;intérêt entre répétées inversées d&#39;éléments qui sont nécessaires à l&#39;activité de transfert de gène. PiggyBac transfert de gènes par médiation un &quot;couper et coller&quot; mécanisme par lequel la transposase intègre le segment de transposon dans le génome de la cellule cible (s) d&#39;intérêt. PiggyBac a démontré l&#39;efficacité de délivrance de gènes activité dans une large gamme de 1,2 insecte, de mammifère 3-5, et humaine cells6 y compris les cellules T humaines primaires 7,8. Récemment, une transposase hyperactive piggyBac a été générée en améliorant l&#39;efficacité de transfert de gènes 9,10. Lymphocytes T humains sont des intere cliniqueer pour l&#39;immunothérapie adoptive du cancer 11. Fait à noter, le premier essai clinique impliquant une modification transposon des lymphocytes T humains en utilisant le système Sleeping beauty transposon a été approuvée le 12. Nous avons déjà évalué l&#39;utilité de piggyBac comme une méthode non virale pour la modification génétique de cellules T humaines. Nous avons trouvé piggyBac pour être efficace dans la modification génétique de cellules T humaines avec un gène rapporteur et un gène non immunogène inductible suicide 7. L&#39;analyse des sites d&#39;intégration génomique a révélé un manque de préférence pour une intégration dans ou à proximité connues proto-oncogènes 13. Nous avons utilisé piggyBac de gènes modifient les lymphocytes T cytotoxiques pour réaliser un récepteur d&#39;antigène chimérique dirigé contre l&#39;antigène tumoral HER2, et a trouvé que le gène modifiés lymphocytes T médié assassinat ciblé de HER2-positives cellules tumorales in vitro et in vivo dans un modèle de souris orthotopique 14. Nous avons également utilisé piggyBacpour générer des cellules T humaines résistantes à la rapamycine, qui devraient être utiles dans les thérapies du cancer, où la rapamycine est utilisée 15. Nous décrivons ici une méthode pour utiliser piggyBac de modifier génétiquement les cellules T humaines primaires. Ceci inclut l&#39;isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à partir de sang humain suivie par la culture, la modification génétique, et l&#39;activation des cellules T. Aux fins du présent rapport, les cellules T ont été modifiées avec un gène rapporteur (eGFP) pour l&#39;analyse et la quantification de l&#39;expression génique par cytométrie en flux. PiggyBac peuvent être utilisées pour modifier des cellules T avec une variété de gènes d&#39;intérêt. Bien que nous ayons utilisé piggyBac de diriger les lymphocytes T aux antigènes tumoraux 14, nous avons également utilisé piggyBac d&#39;ajouter un interrupteur de sécurité inductible afin d&#39;éliminer les cellules gènes modifiés si nécessaire 7. La capacité de chargement importante de piggyBac a également permis le transfert de gènes deune molécule de rapamycine grande résistance mTOR (15 ko) 15. Par conséquent, nous présentons une méthodologie non-virale pour le gène-modification stable de cellules T humaines primaires pour une large variété de fins.

Un schéma montrant les étapes de la modification génétique de lymphocytes T humains avec un gène rapporteur (eGFP) est illustré à la figure 1. Ces plasmides sont disponibles sur demande auprès des auteurs. Un schemtic démontrant les étapes génétiquement modifiés lymphocytes T humains avec un gène rapporteur (eGFP) est showin dans la figure 2. Il est nécessaire d&#39;activer les cellules T dans le but de les amener à se diviser, se développer et se propager dans la culture. Modifiées des...

Nous décrivons une méthode pour modifier génétiquement des cellules T humaines primaires avec un transgène en utilisant la non-virale<em&gt; PiggyBac</em&gt; Transposon système. Lymphocytes T modifiés à l&#39;aide de la<em&gt; PiggyBac</em&gt; Transposon exposition expression du transgène système stable.

Modification piggyBac système transposon des cellules T humaines primaires

Le système de transposon piggyBac est naturellement actif, dérivé à l'origine du papillon cabbage looper1,2. Ce système non viral est basé sur des plasmides, la plupart...

L'objectif général de cette procédure est de modifier de manière stable des lymphocytes T humains primaires en utilisant un système de transposon non viral. Tout d'abord, recueillir du sang humain, puis isoler les cellules mononucléées du sang périphérique, et procéder à l'électroporation des PBMC avec le système de transposon piggyBac et un transgène d'intérêt tel que l'EGFP. Ensuite, stimuler les lymphocytes T afin de provoquer leur prolifération en culture.Ensuite, analyser les lymphocytes T pour l'expression du transgène. En définitive, l'analyse par cytométrie en flux est utilisée pour démontrer une expression stable du transgène dans les lymphocytes T modifiés à l'aide du système de transposon piggyback. Contrairement à la transfection par plasmide des lymphocytes T humains, les transposons présentent l'avantage d'intégrer de façon stable les transgènes pour une expression à long terme.La clé consiste à suivre un protocole très précis lors de la manipulation des P BMCs pendant l'isolement et après la nucléofection. Nous avons d'abord mis en œuvre cette méthode pour créer des lignées cellulaires humaines stables en culture afin d'exprimer différents gènes. Cette approche permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine de l'immunologie, comme la manière de modifier les lymphocytes T pour améliorer leur fonction. La démonstration de la procédure sera effectuée par Sunon et Saha, un étudiant diplômé de mon laboratoire, à l'aide d'une ponction veineuse.Prélevez 20 millilitres de sang humain frais dans des tubes vacutainer contenant de l'héparinate de sodium. Mélangez le sang avec le milieu RPMI 1640 évolué dans un rapport un pour un. Ajoutez ensuite 20 millilitres de milieu lympho prep dans un tube de centrifugation de 50 millilitres.Superpose lentement 25 à 30 millilitres de sang dilué au-dessus du lympho prep et centrifuger à 400 × g pendant 40 minutes sans freinage. Transférez les deux couches, distincte et floue, dans 10 millilitres de PBS à température ambiante. Ajustez le volume total à 50 millilitres avec du PBS.Ensuite, récoltez les cellules par centrifugation à 450 × g pendant 10 minutes, aspirez complètement le surnageant, puis lavez les cellules une fois avec 20 millilitres de RPMI avancé après centrifugation. Resuspendez le culot cellulaire dans 10 millilitres de milieu complet pour lymphocytes T, supplémenté avec cinq nanogrammes par millilitre d'IL-15 humaine recombinante, puis énumérez les cellules maintenant dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits revêtue, en semant deux fois 10 à la puissance six cellules par puits.Ensuite, ajoutez de l'eau stérile dans tous les puits environnants. Incubez les BMCs P toute la nuit dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Diluez les anticorps anti-CD28 et anti-CD3 dans de l'eau stérile à une concentration de un microgramme par millilitre.Ajouter 500 microlitres de chaque solution d'anticorps dans cinq puits marqués d'une plaque de culture tissulaire 24 puits non revêtue. Ensuite, ajouter de l'eau stérile dans les autres puits. Envelopper la plaque et placer à quatre degrés Celsius.Préchauffez le milieu pour lymphocytes T à 37 degrés Celsius et complétez-le avec cinq nanogrammes par millilitre d'IL-15 humaine recombinante. Préparez également une solution fraîche de nucléoeffecteur complète. Répartissez maintenant cinq microgrammes de transposon et cinq microgrammes de transposase chacun dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre.Il peut être nécessaire d'optimiser la quantité d'ADN du transposon A et du transposase pour une livraison génique optimale. Afin de minimiser la toxicité cellulaire, récolter les PBMCs depuis la plaque de culture tissulaire 24 puits dans un tube de 50 millilitres. Après dénombrement des cellules, conserver deux fois 10 à la puissance 6 PBMCs à utiliser comme témoin lors de la cytométrie en flux.Ensuite, ajoutez entre sept et dix millions de cellules dans un tube de 15 millilitres et centrifugez à 400 ×g pendant cinq minutes. Aspirez le surnageant et tapez légèrement sur le culot avec le doigt. Ajoutez 100 microlitres de solution complète de nucléofection pour lymphocytes T au culot cellulaire desserré.Ajoutez maintenant le mélange de cellules en solution aux plasmides. Ensuite, ajoutez le mélange de cellules et de plasmides en solution au fond du tube d'af​fec​tion nu​cléai​re. Veillez à ne pas introduire de bulles, car elles pourraient af​fec​ter les cellules. Appliquez une af​fec​tion nu​cléai​re aux cellules à l'aide du programme U-tiret-0-1-4.Pour les lymphocytes T humains non stimulés, transférer les cellules dans un puits contenant 1,5 millilitre de milieu préchauffé supplémenté de R-H-I-I-L 15, puis incuber les lymphocytes T non stimulés affectés dans un incubateur de culture cellulaire pendant la nuit. Après la récolte des cellules, déterminer le nombre de cellules et réserver 0,5 fois 10 à la puissance 6 des PBMC non transfectés comme témoins pour la détermination par cytométrie en flux de la fréquence des cellules positives pour la GFP. Ensuite, aspirer la solution d'anticorps CD 3 28 à partir de la plaque non revêtue pour culture cellulaire et rincer chaque puits avec du milieu pour lymphocytes T, puis resuspendre.Les cellules nucléofectées à 0,5 fois 10 puissance 6 cellules par millilitre. Dans le milieu CTL complet, supplémenté avec cinq nanogrammes par millilitre de RH IL-15, ajouter 2,0 millilitres. Chaque lot de cellules nucléofectées dans quatre puits de la plaque non destinée à la culture tissulaire.Ajouter 0,5 fois 10 à la puissance six. Les cellules non nucléaires affectées à la puissance cinq. Incuber la plaque pendant trois jours dans un incubateur humide à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Le cinquième jour, récolter les lymphocytes T stimulés à partir de la plaque de culture tissulaire non revêtue. Ensuite, dans une plaque de culture tissulaire revêtue de 24 puits, à 0,7 × 10⁶ cellules par millilitre dans un milieu pour lymphocytes T contenant 5 ng/mL d'IL-15. Après la récolte des cellules, effectuer une immunomarquage pour CD8, CD3 ou CD4 afin d'évaluer le pourcentage d'expression de la GFP, puis analyser les préparations cellulaires par cytométrie en flux si une expansion des lymphocytes T est nécessaire.Ensuite, au jour huit, après la transfection, plaquez les cellules à une densité de 0,7 × 10⁶ cellules par puits dans un milieu pour lymphocytes T contenant l'IL-15, afin de réaliser une modification génique des lymphocytes T humains par système piggyback. Les cellules humaines primaires sont transfectées avec deux plasmides. Le plasmide transposase assure l'expression constitutive de la protéine piggyback sous un promoteur CMV.Le transposon sur le plasmide contient le gène rapporteur GFP et les répétitions inversées piggyback nécessaires au transfert génique. L'expression stable du transgène GFP dans les lymphocytes T modifiés à l'aide du système transposon piggyback peut être étudiée par analyse en cytométrie en flux. Ici, les cellules ont été marquées avec un anticorps anti-CD8 conjugué à la PC et analysées pour la fluorescence EGFP et A PC au jour un.L'expression d'EGFP est détectée dans 76,4 % des cellules CD8 positives. La diminution de l'expression d'EGFP entre le jour 1 et le jour 7 est probablement due au fait que toutes les cellules transfectées n'effectuent pas une intégration stable de l'ADN du transposon. Vous devriez maintenant avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler les PBMC et de réaliser une modification génique stable.Les modifier à l'aide du système de transposition piggyback. N'oubliez pas d'utiliser une technique stérile lors de la phlébotomie. Travailler rapidement pour préserver la viabilité cellulaire.Après cette procédure, d'autres méthodes, comme un dosage de cytotoxicité des lymphocytes T, peuvent être réalisées afin de déterminer la spécificité antigénique des lymphocytes T. De futures expériences exploreront l'utilisation de transposons pour l'immunothérapie basée sur les lymphocytes T chez le cancer et chez la souris.

piggybac-transposon-system-modification-of-primary-human-t-cells

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous présentons un protocole pour produire l'antigène spécifique de la souris de cellules T à l'aide transduction...

Transduction rétrovirale des récepteurs de cellules T dans les lymphocytes T de souris

Cette vidéo montre la procédure de génération de motoneurones par transfection d’iPSC humaines avec le système de transposon PiggyBac par l’expression ectopique de facteurs de transcription spécifiques à la lignée.

Édition de gènes médiée par transposon PiggyBac dans les iPSC humaines : une procédure pour intégrer le gène d’intérêt dans les iPSC humaines à l’aide du système de transposon PiggyBac

Lymphocytes T exprimant un récepteur CD19 chimérique antigène spécifique (RCA) sont infusés comme traitement expérimental des cellules B malignes dans nos first-in-humains essais de thérapie génique. Nous décrivons la modification génétique des cellules T en utilisant...

Application clinique de<em&gt; Belle au Bois Dormant</em&gt; Et artificielle cellules présentatrices d&#39;antigènes pour modifier génétiquement des cellules T du sang de cordon ombilical et périphériques

Dans cette étude, nous générons des cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules de liquide amniotique de souris, en utilisant un système de transposon non viral.

La production de cellules souches pluripotentes de souris amniotique Cellules Fluid Utilisation d&#39;un système de transposon

Ce protocole décrit une méthode pour réaliser l’intégration stable d’un gène d’intérêt dans le génome humain par le système transcriptionnellement réglementé de la Belle au bois dormant . Préparation de l’intégration des vecteurs LENTIVIRAUX défectueux, la transduction in vitro des cellules humaines et l’analyse moléculaire sur les cellules transduits sont signalés.

Une méthode de Transposition efficace In Vitro par un système de beauté dormir transcriptionnellement réglementé empaquetée dans un vecteur Lentiviral défectueux de l’intégration

Nous décrivons un protocole de 9 jours pour la transduction et l’expansion des cellules mononucléaires périphériques de sang de macaque de rhésus qui donne des cellules avec une excellente co-expression des gènes d’intérêt dans le nombre suffisant pour des études de perfusion de l’efficacité cellulaire.

Transduction et expansion des lymphocytes T primaires en neuf jours avec maintien du phénotype de la mémoire centrale

Ici, nous décrivons une méthode détaillée d’édition de gènes transparente dans des cellules souches pluripotentes humaines en utilisant un plasmide donneur à base de piggyBac et le mutant Cas9 nickase. Deux mutations ponctuelles ont été introduites dans l’exon 8 du locus du facteur nucléaire 4 alpha des hépatocytes (HNF4α) dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh).

Introduction de mutations ponctuelles dans des cellules souches pluripotentes humaines à l’aide d’une édition transparente du génome

Nous avons développé un protocole pour transfecter les cellules épithéliales pigmentaires humaines primaires par électroporation avec le gène codant pour le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF) à l’aide du système de transposon de la Belle au bois dormant (SB). La réussite de la transfection a été démontrée par la réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR), l’immunoblot et le dosage immuno-enzymatique (ELISA).

Modification génétique basée sur l’électroporation de cellules épithéliales pigmentaires humaines primaires à l’aide du système de transposon de la Belle au bois dormant

Ici, un protocole pour isoler et transfecter les cellules épithéliales pigmentaires primaires de l’iris et de la rétine de divers mammifères (souris, rats, lapins, porcs et bovins) est présenté. La méthode est parfaitement adaptée à l’étude des approches de thérapie génique oculaire dans diverses configurations pour des analyses ex vivo et des études in vivo transférables à l’homme.

Isolement, culture et génie génétique de cellules épithéliales pigmentaires primaires de mammifères pour la thérapie génique non virale

Une transformation germinale réussie chez la légionnaire d’automne, Spodoptera frugiperda,a été obtenue en utilisant l’ARNm de la transposase hyperactive piggyBac.

Transformation germinale hyperactive médiée par la transposase chez la chenille légionnaire d’automne, Spodoptera frugiperda

Un protocole détaillé est fourni pour l’utilisation de la technologie CRISPR/Cas9 afin d’obtenir un knock-in ciblé très efficace de grandes constructions multicistroniques dans les cellules T humaines primaires via la voie de réparation de l’ADN HMEJ (Homology-Mediated End Joindre). Les lymphocytes T conçus avec ce protocole adaptable à la GMPc maintiennent une excellente expansion cellulaire, une cytotoxicité et une production de cytokines.

Ingénierie non virale de lymphocytes T humains primaires via l’intégration ciblée de grandes matrices d’ADN

Découvrez la modification génétique stable des cellules T humaines primaires par le système de transposon piggyBac non viral. Cette méthode permet une expression transgénique durable pour la recherche et la thérapie cellulaire.

Modification piggyBac système transposon des cellules T humaines primaires

Explorer plus de vidéos