Name: Génération substrat pour des endonucléases de CRISPR / Cas Systems (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-08T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Découvrez comment générer des substrats d'ARN pour l'étude des endonucléases Cas impliquées dans les systèmes immunitaires CRISPR. Cette méthode utilise l'amplification PCR et la transcription in vitro pour produire des pré-crRNA de différentes longueurs.

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Les auteurs tiennent à remercier Jeanette Schermuly pour la préparation de recombinaison ARN polymérase T7 et Ebelt Norman pour l&#39;assistance dans la préparation de la figure 1. Ce travail a été financé par des fonds de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) et la Société Max Planck.

1. Génération de longue pré-crRNA substrats par PCR <ol><li> Conception des amorces de PCR ciblant les régions d&#39;espacement d&#39;un cluster CRISPR. Ajouter l&#39;ARN polymérase T7 séquence promotrice (T7RNAP) (5 &#39;-taatacgactcactata-3&#39;) de l&#39;amorce sens et des sites de restriction pour le clonage du produit de PCR dans un vecteur à deux amorces (par exemple BamHI et HindIII pour pUC19, Fig. 2A) . Remarque: Le T7RNAP nécessite un résidu guanidine pour l&#39;initiation de la transcription correcte. </li><li> Amplifier votre pré-crRNA séquence d&#39;intérêt à partir de l&#39;ADN génomique par PCR. </li><li> Séparer les produits de PCR sur gel d&#39;agarose par électrophorèse sur gel et extraire la bande désirée. Digérer le produit de PCR par les enzymes de restriction pour créer des extrémités cohésives (par exemple BamHI et HindIII, Fig. 2A). Purifiez votre produit PCR avec un kit de purification PCR pour éliminer les sous-produits de clivage. </li><li> Mettre en place une réaction de ligature qui contient l&#39;ADN ligase T4, T4 tampon de ligase d&#39;ADN etun rapport molaire de 3:1 du produit clivé par PCR et le vecteur déphosphorylé linéaire correspondant pUC avec des extrémités cohésives. Incuber le mélange à 16 ° C pendant la nuit. Transformer le mélange de ligation dans des cellules compétentes d&#39;Escherichia coli DH5a par des protocoles standard et utiliser le bleu blanc de dépistage pour identifier ligature réussie. </li><li> Isoler plasmides des colonies blanches en utilisant un kit de préparation de plasmide. Identifier les clones positifs par séquençage du plasmide. Alternativement, une PCR sur colonie pourrait être utilisé pour le dépistage. </li></ol> 2. Génération de pré-intermédiaire crRNA substrats par l&#39;intermédiaire d&#39;un recuit d&#39;oligonucléotides d&#39;ADN <ol><li> Concevoir avant et arrière oligonucléotides avec le CRISPR répétition / entretoise séquence désirée. Les oligonucléotides contiennent la séquence d&#39;un promoteur T7 RNAP ainsi que des sites de restriction terminaux (par exemple BamHI et HindIII pour pUC19). Terminer les oligonucléotides assurer que le formulaire collant se termine après recuit (voir Fig. 2B </strong&gt;). </li><li> 5&#39;-phosphoryle 1 nmol de chaque oligonucléotide dans une réaction séparée contenant 5 pi 20 pi de T4 polynucléotide kinase (PNK), 2 pl de tampon T4 PNK 10x, 2 pl ATP (10 mM). Incuber chaque échantillon pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> L&#39;hybridation des deux oligonucléotides phosphorylés. Mélanger 1 ul du mélange oligo phosphorylée avant (de 2,2.), 1 pl du mélange d&#39;oligo inverse phosphorylée (de 2,2.), 1 pl de tampon ligase d&#39;ADN T4 10x dans une réaction de 10 ul. Incuber les échantillons pendant 5 min à 95 ° C sur un bloc chauffant ou dans l&#39;eau bouillante, éteignez la source de chaleur et laisser le mélange refroidir à température ambiante (~ 2-3 heures). Remarque: Dans cette étape critique, le refroidissement lent favorise le recuit des deux oligonucléotides par rapport à la formation de structures à l&#39;intérieur de chaque oligonucléotide simple. </li><li> Ligaturer 4 pl du mélange d&#39;hybridation, 1 microlitre de vecteur pUC digéré et déphosphorylé (0,1 pg /ul) avec l&#39;ADN ligase T4, T4 ADN ligase tampon 10x et 10 mM d&#39;ATP dans un mélange de 20 ligature ul. Incuber l&#39;échantillon à 16 ° C pendant la nuit. </li><li> Transformer les plasmides ligaturés dans des cellules compétentes d&#39;Escherichia coli DH5a par des protocoles standard et utiliser dépistage bleu blanc. Isoler et identifier les plasmides des clones positifs par digestion (pour cribler pour des inserts de la taille désirée) et le séquençage du plasmide ultérieur. </li></ol> 3. Génération de courte substrats ARN Cas via la synthèse à façon d&#39;oligonucléotides ARN Conception court Cas ARN substrats (par exemple, des séquences répétitives simples, Fig. 2C) et d&#39;utiliser les installations personnalisées d&#39;ARN de synthèse d&#39;oligonucléotides. Remarque: L&#39;inclusion d&#39;un désoxyribonucléotide à une position spécifiée d&#39;un oligonucléotide d&#39;ARN (Fig. 2C) peut être utilisé pour localiser le site de clivage de l&#39;ARN. 4. T in vitro7 transcription ARN polymérase <ol><li> Isoler plasmides avec votre concept conçu (à partir de 1.9. Ou 2.7.) En utilisant un kit de purification de plasmide maxiprep. </li><li> Linéariser le plasmide avec l&#39;enzyme de restriction qui clive en aval du fragment cloné (par exemple HindIII). Assurer une digestion complète. Remarque: Si un 3 divergent délimité &#39;de l&#39;ARN transcrit est souhaitée, la construction conçu doit contenir un site de restriction spécifique supplémentaire pour &quot;run-off&quot; de la transcription en amont de la séquence HindIII. </li><li> Purifier le plasmide linéarisé par phénol: chloroforme (1:1) et l&#39;extraction de précipitation à l&#39;éthanol. Récupérer les acides nucléiques en remettant en suspension le culot dans de l&#39;eau stérile traitée au DEPC. </li><li> Mettre en place un embryon in vitro T7 ARNP ruissellement mélange de transcription qui contient 40 mM de HEPES / KOH (pH 8), 22 mM MgCl2, 5 mM de dithiothréitol, 1 spermidine mm, 4 mm de chaque nucléoside triphosphate (ATP, CTP, GTP, UTP ), 40-100 pg / ml de digéréPlasmides et 0,1 mg / ml T7 RNAP dans l&#39;eau traitée au DEPC. Incuber pendant 3 heures à 37 ° C. </li><li> Analyser les relevés de notes obtenus ARN sur un gel dénaturant de polyacrylamide 8 M d&#39;urée 12% (figure 3A). Les transcrits d&#39;ARN peut être purifié par Mono Q chromatographie échangeuse d&#39;anions 13 et récupéré par précipitation à l&#39;éthanol des fractions d&#39;ARN et de remise en suspension du culot dans de l&#39;eau DEPC stérile traité. Pour une utilisation ultérieure, conservez l&#39;ARN à -80 ° C. </li></ol> 5. Cas6 test endonucléase <ol><li> Mettre en place un 20 ul in vitro T7 ARNP ruissellement mélange de transcription (voir 4.4) qui contient une quantité réduite de 2 mM d&#39;ATP et est complété avec 2,5 ul-α [32 P] ATP (10 mCi / ml, 5000 Ci / mmol). Purifier les produits de réaction par extraction sur gel dénaturant à partir d&#39;un gel d&#39;urée 8 M polyacrylamide à 12%. Visualiser les bandes par autoradiographie. </li><li> Produire et purifier les protéines recombinantes souhaitées Cas. Dans cet exemple, CAS6 de Clostridium thermocellum a été purifié par précipitations et la chaleur Ni-NTA chromatographie. </li><li> Mettre en place une réaction de dosage endonucléase (par exemple pour Clostridium thermocellum Cas6, le mélange réactionnel contient 20 mM de HEPES (pH 8 KOH), 250 mM de KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 12 000 cpm ARN substrat et 1 uM enzyme et a été incubé à 37 ° C pendant 30 min). </li><li> Chargez 5 ul du mélange réactionnel (+ 10 pl de tampon de chargement ARN contenant 95% de formamide) sur un gel de polyacrylamide 8 M d&#39;urée 12%. Visualisez les produits de clivage après électrophorèse par autoradiographie. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Un exemple de l&#39;ARN substrats pour l&#39;analyse de l&#39;activité endonucléase Cas est montré sur la figure 3A. Une aliquote de 5 ul d&#39;une analyse 100 pi réaction de transcription in vitro ont été chargés. S&#39;il vous plaît noter que l&#39;efficacité de la production d&#39;ARN varie entre différentes constructions. Certains facteurs tchapeau ont été observés pour influencer la quantité d&#39;ARN obtenus sont (i) la séquence initiale à la suite de la G +1 requis pour l&#39;initiation de la transcription, (ii) la possibilité de formation de structure de l&#39;ARN lors de la transcription et (iii) le choix du site de restriction pour la génération de la position de coupure d&#39;écoulement. L&#39;enquête sur l&#39;activité endonucléase ARN exige à la fois hautement purifiée de protéines recombinantes Cas (Fig. 3B) et des contrôles appropriés négatifs. Idéalement, cet échantillon de contrôle négatif diffère aussi peu que possible de la réaction endonucléase Cas d&#39;une enquête. Ceci peut être obtenu par incubation de l&#39;ARN avec un tampon de réaction et la cellule-lysat sans Cas expression (et la suite de la procédure de purification identique). Un contrôle négatif idéal est l&#39;ajout d&#39;un désoxyribonucléotide au niveau du site de clivage proposé. La figure 3C, le clivage d&#39;une séquence 5 &#39;terminale de répétition marqué est représenté à Clostridium thermocellum Cas6. Sous<html> des conditions identiques, cette répétition n&#39;est pas un substrat plus quand un désoxyribonucléotide est introduit en position -9. Cette méthode fournit également des informations sur le site de clivage. Enfin, une longue interne étiquetés pré-crRNA est clivée par Cas6 et deux fragments de clivage sont respectées. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig1.jpg" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble schématique de CRISPR / Cas activité. La description ci-après l&#39;insertion d&#39;une séquence d&#39;ADN viral (protospacer) dans le groupe CRISPR (adaptation), la transcription et la transformation de la matrice de petites CRISPR dans crRNAs par une endonucléase de Cas6, l&#39;absorption de crRNAs dans le complexe en cascade et le brouillage d&#39;un répétée attaque virale basée sur la complémentarité entre crRNA et protospacer. Protospacer motifs adjacents (PAM) des séquences virales marque protospacer. igure 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg &quot;/&gt; Figure 2. Génération de l&#39;ARN substrats des protéines Cas. Le schéma montre le flux de travail pour produire (A) de longueur pré-crRNA substrats, (B) intermédiaire de pré-crRNA substrats et (C) Cas court ARN substrats pour pré-crRNA production. Exemple des séquences sont présentés pour l&#39;ensemble CRISPR de Clostridium thermocellum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4277/4277fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4277/4277fig3.jpg" /> Figure 3. Cas6 test endonucléase. A.) Toluidine gel de polyacrylamide bleu teinté d&#39;un oligonucléotide conçu sur mesure ARN (250 pmol) et deux ARN in vitro transcriptions (5 pi d&#39;un type de réaction 100 pi). B.) gel SDS-PAGE d&#39;une préparation Cas6 (80 pmol) de Clostridium thermocellum après la chaleurprécipitation à 50 ° C pendant 1 heure et chromatographie Ni-NTA. C) La détection de endonucléolytique Cas6 activité 5 &#39;terminale des séquences répétées étiquetés et pré-crRNA transcrits in vitro. L&#39;introduction d&#39;un dNTP à position -9 abolit Cas6 clivage d&#39;un substrat à court Cas ARN (S, fig. 2C). A 5 &#39;terminal 8 tag nt est également généré pour la maturation crRNA de longue pré-crRNA substrats (L, Fig. 2A). Les bandes ont été séparés sur un gel dénaturant 8 M d&#39;urée 12% de polyacrylamide et visualisés par autoradiographie.

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les méthodes présentées permettent la génération de substrats endonucléase SAE de gammes de tailles différentes et avec plus ou moins de liberté dans la conception de séquence. L&#39;approche la plus straight-forward pour la génération de substrats synthétiques d&#39;oligonucléotides d&#39;ARN est limitée à de courtes créations d&#39;ARN en raison de l&#39;augmentation des coûts et des limitations techniques dans la création de plus oligomères d&#39;ARN. Bien réussir la synthèse d&#39;ARN a été rapportée pour les oligomères d&#39;ARN non modifiés de plus de 100 nucléotides de longueur, le maximum pratique et économique pour l&#39;ARN de synthèse sur mesure est inférieure à 40 nucléotides. Cependant, toute séquence donnée peut être synthétisé et l&#39;introduction ciblée de nucléotides modifiés (par exemple désoxyribonucléotides) peut être utilisé pour analyser des sites de clivage dans le détail. Plus pré-ARNc doit être généré par transcription in vitro. Le recuit d&#39;oligonucléotides qui contiennent un promoteur de T7 ARN polymérase permet la production d&#39;une longueur intermédiaire de pré-CRRNComme. La longueur maximale de routine et économiquement oligonucléotides d&#39;ADN synthétisés se trouve au-dessus de 150 nucléotides et représente le maximum de pré-synthèse crRNAs par cette méthode. L&#39;assemblage de plusieurs paires d&#39;oligonucléotides d&#39;ADN recuit qui forment des extrémités cohésives avec l&#39;autre peut étendre cette durée maximale, mais nécessite des défis croissants dans le clonage de la construction. Le principal avantage de cette méthode est sa capacité à générer des pré-crRNA constructions (et donc Cas endonucléase de substrats) avec un ordre quelconque. Ceci permet à l&#39;essai de prototypes de crRNA synthétiques. Enfin, les grandes pré-crRNAs peut être obtenu à partir de produits d&#39;amplification PCR des éléments entiers CRISPR génomiques ou en fractions. Des altérations de la transcription in vitro dans le modèle plasmide peut être introduit par mutagénèse dirigée pour la génération de pré-crRNA variantes. Ces constructions peuvent être utilisées pour analyser le motif de clivage mondial endonucléolytique au sein d&#39;un ensemblepré-crRNA. Le travail de pionnier pour la production d&#39;ARN non modifié par l&#39;ARN polymérase T7 transcription in vitro a été basée sur 14 ARN de transfert et ARN virus de la mosaïque du brome 15. Le promoteur consensus T7 ARN polymérase est constituée d&#39;un domaine de reconnaissance (-17 à travers -5) et un domaine d&#39;initiation (-4 à travers +6) avec initiation de la transcription à une guanosine essentiel +1 16. En aval des postes de +1 peut être variée qui permet la transcription de presque toute séquence d&#39;ARN désiré. Les méthodes présentées pour générer des modèles de transcription in vitro de ruissellement pour permettre la synthèse in vitro de pré-complets qui correspondent à des régions crRNAs CRISPR génomique ou synthétique pré-crRNA variantes. Les transcrits sont générés en présence d&#39;un triphosphate 5&#39;-terminale à moins que la réaction de transcription est amorcée avec GMP pour obtenir 5 &#39;monophosphate extrémités 14. Ces terminaisons sont nécessaires si les relevés de notes doivent être étiquetésla T4 polynucléotide kinase et γ-[32P]-ATP. Activité de clivage de Cas6 et Cas6 enzymes analogues génère crRNA qui contiennent 5&#39;-hydroxyle et un 2 &#39;, 3&#39;-phosphate extrémités cycliques. Ces ARN peuvent ensuite être analysées pour la reconnaissance par le complexe Cascade.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Antarctique Phosphatase </td><td> ONE </td><td> M0289L </td><td></td></tr><tr><td> dans Triphosphates transcription in vitro ultrapure année nucléotides </td><td> Jena Bioscience </td><td> NU-1010 - NU-1013 </td><td></td></tr><tr><td> Chromatographie en phase liquide, ktapurifier 100 </td><td> GE Healthcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oligonucléotides d&#39;ADN </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oligonucléotides d&#39;ARN </td><td> MWG Operon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel Extraction Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> Kit de purification de PCR </td><td> QIAGEN </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> Spin Miniprep </td><td> QIAGEN </td><td> 27106 </td><td></td></tr><tr><td> Maxi Kit plasmide </td><td> QIAGEN </td><td> 12163 </td><td></td></tr><tr><td> BamHI </td><td> ONE </td><td> R0136L </td><td></td></tr><tr><td> HindIII </td><td> ONE </td><td> R0104L </td><td></td></tr><tr><td> ADN ligase de T4 </td><td> ONE </td><td> M0202S </td><td></td></tr><tr><td> T4 polynucléotide kinase </td><td> Ambion </td><td> AM2310 </td><td></td></tr><tr><td> T7 RNA Polymerase </td><td> propre préparation </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mix Solution désoxynucléotide </td><td> ONE </td><td> N0447L </td><td></td></tr><tr><td> Mini-PROTEAN d&#39;électrophorèse Tetra </td><td> Bio-Rad </td><td> 165-8001 </td><td></td></tr><tr><td> Storm 840 Scanner </td><td&gt; GE Healthcare </td><td> 163723 </td><td></td></tr><tr><td> Stockage Phosphorscreen </td><td> Molecular Dynamics </td><td> 63-0034-81 </td><td></td></tr><tr><td> Mono Q 5/50 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5166-01 </td><td></td></tr><tr><td> Polymérase Phusion ADN haute fidélité </td><td> ONE </td><td> M0530L </td><td> utiliser le tampon GC </td></tr><tr><td> Bleu de toluidine </td><td> Sigma </td><td> T3260 </td><td></td></tr><tr><td> pUC19 </td><td> ONE </td><td> N3041S </td><td></td></tr><tr><td> γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP </td><td> Hartmann Analytic </td><td> SRP-401, PRS-307 </td><td></td></tr></tbody></table>

génération substrat pour des endonucléases de crispr / cas systems

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

L&#39;interaction des virus et leurs hôtes procaryotes façonné l&#39;évolution de la vie bactérienne et Archaea. Les procaryotes développé plusieurs stratégies pour échapper aux attaques virales qui comprennent la modification restriction, infection abortive et CRISPR / Cas des systèmes. Ces systèmes immunitaires adaptatives trouvés dans de nombreuses bactéries et les archées se composent de plus lustré c r i egularly nterspaced s hort p alindromic r EPEAT (CRISPR) et un certain nombre de séquences de C RISPR que sociated (CAS) gènes (Fig. 1) 1-3. Différents ensembles de protéines Cas et répète définir au moins trois grands types divergents de CRISPR / Cas systèmes 4. Les protéines universelles CAS1 et CAS2 sont proposées pour être impliqués dans l&#39;absorption de l&#39;ADN viral quigénère un nouveau élément d&#39;écartement entre deux répétitions à l&#39;extrémité 5 &#39;d&#39;une grappe CRISPR s&#39;étendant 5. L&#39;ensemble du cluster est transcrit en un précurseur contenant tous crRNA-entretoise et des séquences répétées et est ensuite traité par une enzyme de la famille diversifiée Cas6 en petits crRNAs 6-8. Ces crRNAs constitués de la séquence flanquée par une entretoise 5 &#39;terminale (8 nucléotides) et une région 3&#39; terminale variable dérivée de la séquence répétée 9. Une infection répétée du virus peuvent maintenant être bloqué comme la nouvelle crRNA sera dirigé par un complexe protéique Cas (Cascade) à l&#39;ADN viral et l&#39;identifier comme tel via 10 la complémentarité de base. Enfin, pour CRISPR / Cas des systèmes de type 1, le CAS3 nucléase va détruire l&#39;envahisseur détecté l&#39;ADN 11,12. Ces processus définissent CRISPR / Cas en tant que système immunitaire adaptatif des procaryotes et a ouvert un domaine de recherche fascinant pour l&#39;étude des protéines impliquées Cas.La fonction d&#39;un grand nombre de protéines Cas est toujours insaisissable et les causes de la diversité apparente des systèmes CRISPR / Cas restent à éclairer. Les activités potentielles de la plupart des protéines ont été prédites par Cas des analyses détaillées de calcul. Une fraction importante de protéines Cas sont soit montré ou proposé à fonctionner comme endonucléases 4. Ici, nous présentons les méthodes pour générer des précurseurs et crRNAs-ARNc pour l&#39;étude de Cas endoribonucléases. Dosages différents exigent des endonucléases de séquences répétées courtes soit qui peuvent être directement synthétisés comme oligonucléotides d&#39;ARN ou des séquences plus crRNA et pré-crRNA qui sont générés in vitro par l&#39;ARN polymérase T7 de ruissellement de la transcription. Cette méthodologie permet l&#39;incorporation de nucléotides radioactifs pour la production de substrats marqués endonucléase interne et la création de crRNAs synthétiques ou mutant. Cas6 activité endonucléase est utilisé pour mûrir pré-crRNAs en crRNAs avec 5&#39;-hydroxyle et un 2 &#39;, 3&#39;-terminales phosphate cyclique.

CRISPR / Cas systèmes médiate immunité adaptative dans les bactéries et les archées. De nombreuses protéines sont proposées Cas d&#39;agir comme endoribonucléases agissant sur les précurseurs crRNA de longueur variable. Ici, nous illustrons trois approches différentes pour générer des pré-crRNA substrats pour l&#39;analyse biochimique de l&#39;activité endonucléase de Cas.

Génération substrat pour des endonucléases de CRISPR / Cas Systems

L'interaction entre les virus et leurs hôtes procaryotes a façonné l'évolution de la vie bactérienne et archéenne. Les procaryotes ont développé plusieurs stratégies pour...

L'objectif général des expériences suivantes est de générer des substrats d'ARN pour l'étude de l'endonucléase Cas, qui joue un rôle crucial dans les systèmes immunitaires CRISPR-Cas présents chez les bactéries et les Archées afin d'obtenir des substrats d'ARN pour l'endonucléase Cas. Une amplification par PCR d'une région CRISPR spécifique peut être utilisée pour obtenir un long modèle d'ADN destiné à la production d'ARN in vitro. Si souhaité.Deux oligonucléotides peuvent être utilisés pour générer des gabarits plus courts destinés à la production d'ARN substrat. Alternativement, des séquences répétées courtes et synthétisées sur mesure peuvent ensuite être testées dans des essais d'endonucléase CAS. Enfin, la production de transcrits d'ARN et leur clivage ultérieur par l'endonucléase CAS six peuvent être visualisés par autoradiographie.Le principal objectif des techniques présentées est de permettre aux chercheurs d'étudier le traitement de l'ARN CRISPR à l'aide de substrats d'ARN de longueurs variables. Par conséquent, différentes méthodes sont utilisées pour générer de petits ARN, par exemple des éléments répétés simples ou de plus grands ARN tels que des transcrits crispr, ARN, couvrant plusieurs espacers. Bien que ces méthodes fournissent spécifiquement des informations sur la maturation des ARN CRISPR, des stratégies similaires de préparation des échantillons peuvent être adaptées à d'autres systèmes de traitement de l'ARN. La procédure sera démontrée par Muted Surface, étudiante diplômée, et Repl, postdoctorante, toutes deux issues d'un laboratoire étudiant les systèmes immunitaires CRISPR chez les bactéries et les ArchA.Une séquence d'ADN viral appelée proto-espaceur peut être insérée entre deux éléments répétés dans un groupe CRISPR en cours de croissance, lors d'un processus nommé adaptation. Ensuite, l'ensemble du groupe CRISPR est transcrit puis traité en petits ARN CRISPR par une endonucléase Cas, par exemple Cas6. Ces petits ARN CRISPR sont ensuite intégrés au complexe protéique Cas, où ils assurent la défense de l'hôte contre une attaque virale répétée, en utilisant la complémentarité des bases entre l'ARN CRISPR et le proto-espaceur comme signal déclenchant la dégradation de l'ADN viral afin de produire de longs précurseurs d'ARN CRISPR.Commencez par concevoir des amorces PCR ciblant les régions espacer d'un groupe CRISPR en ajoutant la séquence du promoteur de l'ARN polymérase T7 à l'amorce avant. Ajoutez ensuite des sites de restriction aux deux amorces afin de cloner le produit PCR dans un vecteur. Notez que l'ARN polymérase T7 nécessite un résidu de guanine I pour une initiation correcte de la transcription après amplification de la séquence d'ARN pré-CRISPR d'intérêt à partir de l'ADN génomique par PCR.Séparez les produits de PCR par électrophorèse sur gel agarose, puis extrayez du gel la bande désirée. Digestez ensuite le produit de PCR à l'aide d'enzymes de restriction afin de créer des extrémités cohésives. Ensuite, après avoir purifié votre produit de PCR à l'aide d'un kit de purification de PCR afin d'éliminer tout sous-produit de clivage, ajoutez du tampon T4 DNA Ligase, de la T4 DNA Ligase et un rapport molaire de trois à un du produit de PCR clivé par rapport au vecteur plasmidique DFOs4 correspondant présentant des extrémités cohésives complémentaires. Incubez maintenant la réaction de ligation à 16 degrés Celsius toute la nuit, puis transformez le mélange dans des cellules compétentes d’e. coli DH5α selon des protocoles standards, en utilisant un criblage bleu-blanc pour identifier les ligations réussies.Enfin, isolez les plasmides à partir des colonies blanches à l'aide d'un kit de préparation de plasmide et identifiez les clones positifs par séquençage du plasmide afin de générer des substrats d'ARN pré-CRISPR de taille intermédiaire. Commencez par concevoir des oligonucléotides directs et inverses contenant la séquence cible de répétition CRISPR similaire aux séquences indiquées ici. Notez que les oligonucléotides contiennent la séquence d'un promoteur d'ARN polymérase T7 ainsi que des sites de restriction terminaux après la terminaison des oligonucléotides, afin de garantir la formation d'extrémités cohésives.Après une incubation à genou, incubez les échantillons avec la polynucléotide kinase T4 et le tampon de la polynucléotide kinase T4 pendant une heure à 37 degrés Celsius afin de phosphoryler en extrémité 5′ un nanomole de chacun des oligonucléotides. Incubez ensuite les oligonucléotides phosphorylés, direct et inverse, avec le tampon de l'ADN ligase T4 pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius sur un bloc chauffant. Une fois l'hybridation des échantillons terminée, éteignez la source de chaleur et laissez le mélange refroidir pendant environ deux à trois heures jusqu'à ce qu'il atteigne la température ambiante.Liez maintenant les oligonucléotides obtenus à un mélange d'hybridation composé du vecteur P digéré et déphosphorylé, du tampon pour l'ADN ligase T4 et d'un TP, à 16 °C pendant la nuit. Ensuite, transformez les plasmides ligaturés dans des cellules compétentes E. coli DH5α selon des protocoles standards, en utilisant un criblage bleu-blanc pour identifier les ligations réussies. Enfin, isolez les plasmides et identifiez les clones positifs par digestion enzymatique suivie d'un séquençage du plasmide.Des séquences courtes de substrat d'ARN à répétition unique peuvent être conçues de manière similaire aux exemples présentés ici. Veillez à inclure un désoxyribonucléotide. Si le site de clivage de l'ARN doit être déterminé, une structure de synthèse sur mesure peut ensuite être utilisée pour réaliser la production de l'oligonucléotide d'ARN.Après avoir isolé les plasmides avec le substrat personnalisé de votre choix, linéarisez les plasmides à l’aide d’un kit de purification de plasmides de type maxi prep et d’un enzyme de restriction qui coupe en aval des fragments clonés. Ensuite, après avoir vérifié la digestion complète, purifiez le plasmide linéarisé par extraction au phénol-chloroforme et précipitation à l’éthanol. Récupérez les acides nucléiques par resuspension du culot dans de l’eau stérile traitée au DEPC.Incubez maintenant les plasmides digestifs dans un mélange fraîchement préparé de transcription in vitro par polymérase ARN T7 en présence d'ATP, CTP, GTP et UTP pendant trois heures à 37 degrés Celsius. Enfin, analysez les transcrits ARN obtenus sur un gel dénaturant d'acrylamide 12 % contenant huit molar d'urée. Il est également possible de purifier les transcrits par chromatographie d'échange d'anions sur colonne Mono Q, puis de récupérer les transcrits par précipitation à l'éthanol des fractions d'ARN et de resuspendre les culots dans de l'eau stérile traitée au DEPC afin d'analyser les substrats conçus par des tests d'endonucléase. Commencez par visualiser les bandes de substrat par autoradiographie et purifiez les produits de réaction par extraction au gel à partir d'un gel dénaturant contenant huit molar d'urée.Gel de polyacrylamide à 12 %, puis produire et purifier les protéines CAS recombinantes souhaitées par précipitation thermique et chromatographie sur colonne au nickel NTA, comme illustré pour cette protéine CAS six provenant de Clostridium thermo cell. Ensuite, combiner la protéine CAS avec un mélange de réaction d'endonucléase fraîchement préparé pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius afin de permettre la réaction du test d'endonucléase. Enfin, charger cinq microlitres du mélange de réaction sur un gel d'urée à huit molaires.Gel de polyacrylamide à 12 % et visualisation des produits de clivage après électrophorèse par autoradiographie. Ici, un gel de polyacrylamide coloré au Bleu de Hinne contenant un oligonucléotide ARN sur mesure ainsi que deux ARN transcrits in vitro est présenté. Remarquez que l'efficacité de production des ARN varie selon les constructions de taille courte, longue ou intermédiaire.L'analyse de l'activité d'endonucléase sur l'ARN nécessite des contrôles positifs et négatifs, ainsi que des protéines Cas recombinantes hautement purifiées. Sur cette figure, un gel SDS-PAGE d'une préparation d'échantillon de Cas6 provenant de Clostridium thermocellum.Après la précipitation thermique et la chromatographie sur colonne NTA au nickel réalisée parallèlement à un marqueur protéique standard, on observe un échantillon de contrôle négatif approprié contenant un lysat cellulaire sans expression de CAS six, mais ayant suivi la procédure de purification identique de CAS six, dont la préparation s'est révélée posséder le degré de pureté requis. Ici, le clivage d'un substrat d'ADN répétitif marqué à l'extrémité 5' par la protéine CAS six de Clostridium thermocellum peut être visualisé par autoradiographie.Chaque piste contient un substrat marqué radioactivement, de l'ARN après incubation avec la protéine ca six, comme indiqué par les signes positifs, ou avec un tampon servant de contrôle négatif, comme noté par les signes négatifs, des substrats longs ou courts, avec ou sans ajout du désoxyribonucléotide. Les positions situées à moins neuf ont été utilisées afin de faciliter la réaction d'endonucléase. Remarquez l'absence de clivage des substrats courts lorsque le désoxyribonucléotide était inclus dans la molécule d'ARN suite à cette procédure.Les nucléases CAS six peuvent également être utilisées comme outil pour générer des ARN mûrs et précis. Ces ARN peuvent être intégrés dans des complexes en cascade afin d'obtenir des informations sur leur implication dans l'interférence des attaques virales. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la conception et de la production de substrats CRISPR pour les Cas et les nucléases.Ces différents substrats sont utiles pour aborder des questions relatives à la maturation et à l'utilisation des CRISPR Es.

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