Génération substrat pour des endonucléases de CRISPR / Cas Systems

L'objectif général des expériences suivantes est de générer des substrats d'ARN pour l'étude de l'endonucléase Cas, qui joue un rôle crucial dans les systèmes immunitaires CRISPR-Cas présents chez les bactéries et les Archées afin d'obtenir des substrats d'ARN pour l'endonucléase Cas. Une amplification par PCR d'une région CRISPR spécifique peut être utilisée pour obtenir un long modèle d'ADN destiné à la production d'ARN in vitro. Si souhaité.

Deux oligonucléotides peuvent être utilisés pour générer des gabarits plus courts destinés à la production d'ARN substrat. Alternativement, des séquences répétées courtes et synthétisées sur mesure peuvent ensuite être testées dans des essais d'endonucléase CAS. Enfin, la production de transcrits d'ARN et leur clivage ultérieur par l'endonucléase CAS six peuvent être visualisés par autoradiographie.

Le principal objectif des techniques présentées est de permettre aux chercheurs d'étudier le traitement de l'ARN CRISPR à l'aide de substrats d'ARN de longueurs variables. Par conséquent, différentes méthodes sont utilisées pour générer de petits ARN, par exemple des éléments répétés simples ou de plus grands ARN tels que des transcrits crispr, ARN, couvrant plusieurs espacers. Bien que ces méthodes fournissent spécifiquement des informations sur la maturation des ARN CRISPR, des stratégies similaires de préparation des échantillons peuvent être adaptées à d'autres systèmes de traitement de l'ARN. La procédure sera démontrée par Muted Surface, étudiante diplômée, et Repl, postdoctorante, toutes deux issues d'un laboratoire étudiant les systèmes immunitaires CRISPR chez les bactéries et les ArchA.

Une séquence d'ADN viral appelée proto-espaceur peut être insérée entre deux éléments répétés dans un groupe CRISPR en cours de croissance, lors d'un processus nommé adaptation. Ensuite, l'ensemble du groupe CRISPR est transcrit puis traité en petits ARN CRISPR par une endonucléase Cas, par exemple Cas6. Ces petits ARN CRISPR sont ensuite intégrés au complexe protéique Cas, où ils assurent la défense de l'hôte contre une attaque virale répétée, en utilisant la complémentarité des bases entre l'ARN CRISPR et le proto-espaceur comme signal déclenchant la dégradation de l'ADN viral afin de produire de longs précurseurs d'ARN CRISPR.

Commencez par concevoir des amorces PCR ciblant les régions espacer d'un groupe CRISPR en ajoutant la séquence du promoteur de l'ARN polymérase T7 à l'amorce avant. Ajoutez ensuite des sites de restriction aux deux amorces afin de cloner le produit PCR dans un vecteur. Notez que l'ARN polymérase T7 nécessite un résidu de guanine I pour une initiation correcte de la transcription après amplification de la séquence d'ARN pré-CRISPR d'intérêt à partir de l'ADN génomique par PCR.

Séparez les produits de PCR par électrophorèse sur gel agarose, puis extrayez du gel la bande désirée. Digestez ensuite le produit de PCR à l'aide d'enzymes de restriction afin de créer des extrémités cohésives. Ensuite, après avoir purifié votre produit de PCR à l'aide d'un kit de purification de PCR afin d'éliminer tout sous-produit de clivage, ajoutez du tampon T4 DNA Ligase, de la T4 DNA Ligase et un rapport molaire de trois à un du produit de PCR clivé par rapport au vecteur plasmidique DFOs4 correspondant présentant des extrémités cohésives complémentaires. Incubez maintenant la réaction de ligation à 16 degrés Celsius toute la nuit, puis transformez le mélange dans des cellules compétentes d’e. coli DH5α selon des protocoles standards, en utilisant un criblage bleu-blanc pour identifier les ligations réussies.

Enfin, isolez les plasmides à partir des colonies blanches à l'aide d'un kit de préparation de plasmide et identifiez les clones positifs par séquençage du plasmide afin de générer des substrats d'ARN pré-CRISPR de taille intermédiaire. Commencez par concevoir des oligonucléotides directs et inverses contenant la séquence cible de répétition CRISPR similaire aux séquences indiquées ici. Notez que les oligonucléotides contiennent la séquence d'un promoteur d'ARN polymérase T7 ainsi que des sites de restriction terminaux après la terminaison des oligonucléotides, afin de garantir la formation d'extrémités cohésives.

Après une incubation à genou, incubez les échantillons avec la polynucléotide kinase T4 et le tampon de la polynucléotide kinase T4 pendant une heure à 37 degrés Celsius afin de phosphoryler en extrémité 5′ un nanomole de chacun des oligonucléotides. Incubez ensuite les oligonucléotides phosphorylés, direct et inverse, avec le tampon de l'ADN ligase T4 pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius sur un bloc chauffant. Une fois l'hybridation des échantillons terminée, éteignez la source de chaleur et laissez le mélange refroidir pendant environ deux à trois heures jusqu'à ce qu'il atteigne la température ambiante.

Liez maintenant les oligonucléotides obtenus à un mélange d'hybridation composé du vecteur P digéré et déphosphorylé, du tampon pour l'ADN ligase T4 et d'un TP, à 16 °C pendant la nuit. Ensuite, transformez les plasmides ligaturés dans des cellules compétentes E. coli DH5α selon des protocoles standards, en utilisant un criblage bleu-blanc pour identifier les ligations réussies. Enfin, isolez les plasmides et identifiez les clones positifs par digestion enzymatique suivie d'un séquençage du plasmide.

Des séquences courtes de substrat d'ARN à répétition unique peuvent être conçues de manière similaire aux exemples présentés ici. Veillez à inclure un désoxyribonucléotide. Si le site de clivage de l'ARN doit être déterminé, une structure de synthèse sur mesure peut ensuite être utilisée pour réaliser la production de l'oligonucléotide d'ARN.

Après avoir isolé les plasmides avec le substrat personnalisé de votre choix, linéarisez les plasmides à l’aide d’un kit de purification de plasmides de type maxi prep et d’un enzyme de restriction qui coupe en aval des fragments clonés. Ensuite, après avoir vérifié la digestion complète, purifiez le plasmide linéarisé par extraction au phénol-chloroforme et précipitation à l’éthanol. Récupérez les acides nucléiques par resuspension du culot dans de l’eau stérile traitée au DEPC.

Incubez maintenant les plasmides digestifs dans un mélange fraîchement préparé de transcription in vitro par polymérase ARN T7 en présence d'ATP, CTP, GTP et UTP pendant trois heures à 37 degrés Celsius. Enfin, analysez les transcrits ARN obtenus sur un gel dénaturant d'acrylamide 12 % contenant huit molar d'urée. Il est également possible de purifier les transcrits par chromatographie d'échange d'anions sur colonne Mono Q, puis de récupérer les transcrits par précipitation à l'éthanol des fractions d'ARN et de resuspendre les culots dans de l'eau stérile traitée au DEPC afin d'analyser les substrats conçus par des tests d'endonucléase. Commencez par visualiser les bandes de substrat par autoradiographie et purifiez les produits de réaction par extraction au gel à partir d'un gel dénaturant contenant huit molar d'urée.

Gel de polyacrylamide à 12 %, puis produire et purifier les protéines CAS recombinantes souhaitées par précipitation thermique et chromatographie sur colonne au nickel NTA, comme illustré pour cette protéine CAS six provenant de Clostridium thermo cell. Ensuite, combiner la protéine CAS avec un mélange de réaction d'endonucléase fraîchement préparé pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius afin de permettre la réaction du test d'endonucléase. Enfin, charger cinq microlitres du mélange de réaction sur un gel d'urée à huit molaires.

Gel de polyacrylamide à 12 % et visualisation des produits de clivage après électrophorèse par autoradiographie. Ici, un gel de polyacrylamide coloré au Bleu de Hinne contenant un oligonucléotide ARN sur mesure ainsi que deux ARN transcrits in vitro est présenté. Remarquez que l'efficacité de production des ARN varie selon les constructions de taille courte, longue ou intermédiaire.

L'analyse de l'activité d'endonucléase sur l'ARN nécessite des contrôles positifs et négatifs, ainsi que des protéines Cas recombinantes hautement purifiées. Sur cette figure, un gel SDS-PAGE d'une préparation d'échantillon de Cas6 provenant de Clostridium thermocellum.

Après la précipitation thermique et la chromatographie sur colonne NTA au nickel réalisée parallèlement à un marqueur protéique standard, on observe un échantillon de contrôle négatif approprié contenant un lysat cellulaire sans expression de CAS six, mais ayant suivi la procédure de purification identique de CAS six, dont la préparation s'est révélée posséder le degré de pureté requis. Ici, le clivage d'un substrat d'ADN répétitif marqué à l'extrémité 5' par la protéine CAS six de Clostridium thermocellum peut être visualisé par autoradiographie.

Chaque piste contient un substrat marqué radioactivement, de l'ARN après incubation avec la protéine ca six, comme indiqué par les signes positifs, ou avec un tampon servant de contrôle négatif, comme noté par les signes négatifs, des substrats longs ou courts, avec ou sans ajout du désoxyribonucléotide. Les positions situées à moins neuf ont été utilisées afin de faciliter la réaction d'endonucléase. Remarquez l'absence de clivage des substrats courts lorsque le désoxyribonucléotide était inclus dans la molécule d'ARN suite à cette procédure.

Les nucléases CAS six peuvent également être utilisées comme outil pour générer des ARN mûrs et précis. Ces ARN peuvent être intégrés dans des complexes en cascade afin d'obtenir des informations sur leur implication dans l'interférence des attaques virales. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la conception et de la production de substrats CRISPR pour les Cas et les nucléases.

Ces différents substrats sont utiles pour aborder des questions relatives à la maturation et à l'utilisation des CRISPR Es.