Injection sous-rétinien de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l'œil de la souris
25 novembre 2012
Cette technique chirurgicale illustre l'injection de vecteurs de thérapie génique et les cellules souches dans l'espace sous-rétinien de l'oeil de la souris.
La première étape consiste à assembler l'appareil à partir d'un kit de prélèvement sanguin. Coupez une aiguille de calibre 25 et trois quarts sur cette longueur de huit centimètres de tube stérile. À l'aide d'un raccord à vis, vous pouvez acheter une microcapillaire en verre de cent microns de diamètre, ou en fabriquer une vous-même à l'aide d'un tireur de pipettes Sutter P 97, puis aspirez du sérum physiologique stérile pour remplir l'espace mort du tube.
Fixez un tube capillaire en verre à l'extrémité du tube en plastique stérile, éjectez un peu de solution saline à travers l'aiguille pour vous assurer qu'il est correctement fixé et qu'il n'y a aucune fuite. Si vous observez au microscope, examinez la pression appliquée et le débit d'éjection du liquide à travers la pointe fine ; nous utiliserons une solution colorée pour représenter le vecteur viral ou les cellules souches. Placez cela dans une boîte de Pétri stérile, aspirez un peu d'air, puis la solution d'injection.
Pour nos besoins, nous utilisons des souris P5. Sur cette image, vous pouvez voir le museau. L'emplacement de l'œil est recouvert par une paupière.
Les lignes pointillées indiquent la marge palpébrale et le pli de la paupière là où l'incision sera effectuée. Des ciseaux droits Vanis sont utilisés pour réaliser une incision d'un millimètre et demi le long de la paupière fermée. Des pinces à pression de fissure sont utilisées pour écarter les paupières et faire ressortir l'œil, la marge palpébrale se situant légèrement en arrière du globe oculaire.
Pour réaliser la sclérotomie, il est important de pouvoir identifier quelques repères anatomiques. La transition entre la cornée transparente et la sclère est marquée par le limbe. Juste en dedans de la sclère se trouve l'épithélium pigmentaire rétinien, puis la rétine, et ensuite le vitré. Matomy est placé à mi-chemin en arrière ou à l'équateur du globe, par une incision réalisée en griffant la surface avec une lame microchirurgicale de 15 degrés, chez les animaux fortement pigmentés.
Un tissu pigmenté brun foncé deviendra visible au niveau de l'incision. Si l'incision est effectuée trop profondément, vous verrez en réalité un liquide s'écouler. Ce liquide correspond au vitré et indique que vous êtes allé trop loin.
Traverser la RPE de la rétine. Cette incision pourrait être utilisée pour une injection intravitréenne. Maintenant, animal BYO.
L'incision à ce stade est terminée. Des incisions et des griffures supplémentaires permettront de libérer le vitré pour une injection sous-rétinienne ; l'objectif est de placer le tube en verre capillaire microscopique dans l'espace sous-rétinien, juste entre la rétine et l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE). Si l'incision est trop profonde, l'aiguille peut traverser la rétine et pénétrer dans le vitré. Insérez l'aiguille parallèlement à la paroi externe de l'œil.
Pour pénétrer dans l'espace sous-rétinien, appliquez une légère pression sur le piston et commencez à injecter le liquide. Si l'aiguille est correctement positionnée, une résistance modérée sera ressentie et un BLE sera créé dans l'espace sous-rétinien.
Si l'aiguille se trouve dans le vitré, la pression rétrograde est nettement plus faible. Pour éviter un reflux important, maintenez le piston en place pendant 15 secondes supplémentaires avant de retirer l'aiguille. Cela permettra à la pression intraoculaire de se stabiliser.
Repoussez délicatement l’œil derrière les paupières, dans l’orbite, à l’aide d’une pince courbe pour pansement. Voici un autre exemple d’injection sous-rétinienne où le colorant remplit l’espace sous-rétinien et est clairement visible chez un animal albinos. Le ménisque d’air permet de voir quand vous atteignez la fin de l’injection.
Les injections de liquide dans un œil fortement pigmenté sont un peu plus difficiles. L'insertion soigneuse de l'aiguille permet d'obtenir d'excellents résultats.
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Aperçu
Cette technique chirurgicale illustre l'injection de vecteurs de thérapie génique et de cellules souches dans l'espace sous-rétinien de l'œil de la souris. Le processus implique l'assemblage minutieux d'un dispositif permettant une délivrance précise des agents thérapeutiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Thérapie génique
- Recherche sur les cellules souches
- Ophtalmologie
Contexte
- La thérapie génique vise à traiter ou prévenir des maladies en introduisant du matériel génétique dans les cellules.
- Les cellules souches ont la capacité de régénérer des tissus endommagés.
- L'espace sous-rétinien constitue une zone critique pour les interventions oculaires.
- Les modèles murins sont couramment utilisés pour les études précliniques en recherche sur la vision.
Objectif de l'étude
- Démontrer une technique chirurgicale pour l'administration de vecteurs de thérapie génique.
- Explorer le potentiel des cellules souches dans le traitement des maladies rétiniennes.
- Affiner les méthodes d'injections précises dans l'œil.
Méthodes utilisées
- Assemblage d'un dispositif à partir d'un kit de prélèvement sanguin.
- Préparation d'une aiguille en capillaire de verre pour l'injection.
- Aspiration de sérum physiologique stérile pour remplir le dispositif.
- Utilisation d'une solution colorée pour représenter le vecteur viral ou les cellules souches pendant la procédure.
Résultats principaux
- Le dispositif permet une injection contrôlée dans l'espace sous-rétinien.
- Visualisation réussie de l'éjection du liquide au microscope.
- Démonstration de la faisabilité de la technique pour des applications en thérapie génique.
- Implications potentielles pour les traitements futurs des maladies rétiniennes.
Conclusions
- Cette technique fournit une méthode fiable pour la délivrance de thérapie génique.
- Des études supplémentaires sont nécessaires pour évaluer les résultats à long terme.
- Elle ouvre des pistes pour des traitements innovants des troubles rétiniens.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette technique chirurgicale permet une administration précise de vecteurs de thérapie génique et de cellules souches dans l'espace sous-rétinien des yeux de souris périnatales, facilitant ainsi la validation préclinique de thérapeutiques oculaires. En minimisant les lésions tissulaires et en assurant un ciblage précis, la méthode améliore la reproductibilité des protocoles de découverte en phase précoce pour les modèles de maladies rétiniennes. Elle offre une plateforme évolutible pour évaluer des candidats thérapeutiques avant de passer à des études sur des animaux de plus grande taille ou à des recherches permettant l'obtention d'une autorisation de mise en essai clinique (IND).
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation fonctionnelle de constructions de thérapie génique dans un microenvironnement oculaire pertinent pour la maladie.
- Valeur opérationnelle : Facilite la validation de la cible en confirmant l'acheminement vers les couches rétiniennes visées.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des données quantifiables sur la distribution du vecteur ou des cellules grâce à la formation visible de bulles dans l'espace sous-rétinien.
- Valeur opérationnelle : Standardise les paramètres d'injection pour une administration reproductible de composés ou de cellules au sein des cohortes d'étude.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Facilite la réduction des risques mécanistiques en permettant une évaluation longitudinale de l'attecement ou de l'expression dans des modèles périnatals.
- Valeur opérationnelle : Permet des tests de relation dose-réponse essentiels à l'évaluation préclinique de la sécurité et de l'efficacité.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, de la validation de la cible à l'identification de composés précurseurs et à l'évaluation préclinique, en particulier pour les thérapies oculaires géniques et cellulaires.
- Biologie de la découverte : Teste des hypothèses concernant le tropisme vectoriel, l'activité des promoteurs ou l'engraftement des cellules souches dans le créneau rétinien.
- Écrantage : Délivre des volumes standardisés d'agents thérapeutiques afin de permettre l'écrantage comparatif de candidats.
- Analytique : Fournit des lectures visuelles et spatiales (par exemple, taille des bulles, fluorescence) pour quantifier le succès de la délivrance.
- Recherche translationnelle : Fait le lien entre la découverte et les études précliniques en validant la délivrance dans un modèle d'œil néonatal physiologiquement pertinent.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme chirurgicale réutilisable pour les tests itératifs de multiples vecteurs ou lignées cellulaires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans l'engagement de la cible en confirmant la localisation subcellulaire des agents délivrés.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité grâce à un assemblage standardisé du dispositif et une technique d'injection normalisée.
- Valeur stratégique : Réduit les retards liés à la détection des risques biologiques en permettant une validation fonctionnelle précoce in vivo.
- Impact sur le portefeuille : Soutient les décisions d'aller ou de ne pas aller de l'avant, basées sur des indicateurs d'efficacité de délivrance et d'intégrité tissulaire.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microchirurgie et une connaissance approfondie de l'anatomie oculaire néonatale.
- Dépend d'un équipement de précision, notamment de lames microchirurgicales, de pinces et d'outils de préparation des capillaires en verre.
- Exige une formation standardisée afin de minimiser les variations de la profondeur des incisions et du positionnement de l'aiguille entre différents opérateurs.
- Doit tenir compte des difficultés de visualisation liées à la pigmentation lors de l'adaptation à différentes souches de souris.
- Est limitée par le niveau de compétence technique requis pour éviter la pénétration du vitré et assurer un positionnement sous-rétinien.
