Analyse de la fusion membranaire médiée SNARE en utilisant un dosage enzymatique cellulaire Fusion

L'objectif général de cette procédure est de quantifier les événements de fusion cellulaire médiés par les SNARE grâce à l'expression activée de la bêta-galactosidase. Cela est réalisé en exprimant d'abord de manière ectopique les protéines SNARE V et T à la surface de cellules COS-7. L'étape suivante de la procédure consiste à combiner les cellules exprimant les protéines SNARE V avec celles exprimant les protéines SNARE T.

Cela entraîne une fusion cellulaire médiée par les SNARE et l'expression activée de la bêta-galactosidase. En fin de compte, l'activité de la bêta-galactosidase induite par la fusion cellulaire est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le dosage de la région SAL au microscope, est qu'elle permet d'analyser plusieurs combinaisons de SNARE.

Sur le plan quantitatif, bien que cette méthode puisse être appliquée pour comprendre le mécanisme et la régulation de la fusion membranaire médiée par les SNARE, elle peut également être utilisée pour des études à haut débit. La procédure sera démontrée par Doc Na Hassan, postdoctorant, et David Humphrey, technicien de mon laboratoire, la veille du chargement de la transfection.

Préparer deux puits par combinaison de cellules exprimant des plasmides uniques dans des plaques de 24 puits contenant des lamelles en verre de 12 millimètres pour l'expérience sur ces lamelles. Séminer 30 000 cellules COS-7 cultivées dans du DMEM supplémenté en 4,5 grammes par litre de glucose et 10 % de FBS à transfecter. Ajouter aux cellules V, dans chaque puits, un quart de microgramme du plasmide TTA et un jeu de plasmides d'expression.

Les protéines d'intérêt inversées, dans ce cas des VAMP inversées, permettent de transfecter les cellules T : ajoutez un quart de microgramme du plasmide codant pour TRE qui manque de Z, ainsi que le jeu complémentaire de plasmides codant pour les protéines d'intérêt inversées. Dans ce cas, SNAP 25, syntaxine 1 et syntaxine 4. Transfectez maintenant les cellules COS-7 avec l'agent de transfection Lipofectamine selon les instructions du fabricant, puis cultivez les cellules pendant 24 heures. Vingt-quatre heures après la transfection, fixez les cellules dans du paraformaldéhyde supplémenté pendant 10 minutes. Après la fixation, rincez les cellules trois fois avec du PBS++, puis bloquez les cellules avec du FBS supplémenté pendant 30 minutes.

Après le blocage, incuber les cellules avec l'anticorps monoclonal anti-mic. Neuf E 10 pendant 30 minutes, puis après quatre lavages avec du PBS plus plus, incuber les cellules pendant une heure avec des anticorps secondaires conjugués à la fitzy à une dilution de un sur 500. Après quatre autres lavages avec du PBS plus plus, monter les cellules marquées dans un réactif anti-fade du commerce.

Les cellules sont désormais prêtes pour la microscopie confocale. La veille de la transfection, ensemencez 1,2 million de cellules COST-7 dans chaque boîte de culture tissulaire de 100 millimètres et 200 000 cellules COST-7 dans chaque puits d'une plaque à six puits, pour chaque combinaison de plasmides à analyser. Préparez une culture par puits et incubez les cellules pendant 24 heures. Le jour suivant, ajoutez les plasmides destinés à la transfection : pour les cellules V, transfectez un plasmide exprimant la protéine d'intérêt inversée et cinq microgrammes de pTet-Off dans chaque boîte de culture de 100 millimètres.

Transfectez les cellules contrôles dans une boîte de culture de 100 millimètres avec un vecteur vide et le gène P te off aux mêmes concentrations relatives que les cellules V. Une fois tous les plasmides ajoutés aux cellules V et aux cellules contrôles, ajoutez de la tcomycine à ces puits afin d'empêcher la N-glycosylation des vamps. Dans chaque puits des plaques à six puits, faites une co-transfection des cellules T avec un microgramme de PBIG et les plasmides complémentaires exprimant les protéines d'intérêt.

Transfectez maintenant les cellules COS-7 avec du lipide selon les instructions du fabricant. Incubez ensuite les cellules pendant 24 heures ; 24 heures après la transfection, détachez les cellules V de leurs boîtes de culture à l’aide d’un tampon de dissociation cellulaire sans enzyme. Commencez par laver les cellules une fois avec 20 millilitres de PBS.

Ensuite, ajoutez cinq millilitres de tampon de dissociation sans enzyme. Après une incubation de 10 minutes à température ambiante, les cellules se détacheront en tapant énergiquement sur la plaque ; vérifiez leur détachement au microscope. Si moins de la moitié des cellules se sont détachées, attendez encore cinq minutes et tapez à nouveau sur la plaque.

Poursuivre l'incubation dans le tampon de détachement jusqu'à ce que plus de la moitié des cellules se soient détachées. Ensuite, compter les cellules V à l'aide d'un hémocytomètre. Puis resuspendre les cellules V à une concentration d'environ 480 000 cellules par millilitre dans du DMEM complété au tampon heis.

Ajoutez maintenant un millilitre de cellules V resuspendues dans chaque puits contenant les cellules T et replacez les plaques dans l’incubateur. Après six, douze ou vingt-quatre heures de co-culture des cellules, lavez-les avec du PBS et ajoutez du tampon de lyse. Ensuite, grattez les cellules des puits et transférez-les dans des tubes pour centrifugation.

Après centrifugation, transférez le surnageant dans un nouveau tube et mesurez l'expression de la bêta-galactosidase à l'aide d'un dosage disponible dans le commerce, conformément aux instructions du fabricant. Au cours de ce protocole, veillez à interrompre la réaction colorimétrique après 90 minutes en ajoutant du carbonate de sodium à une concentration d'un molaire afin de quantifier les résultats. Mesurez l'absorbance à 420 nanomètres sur un spectrophotomètre. Lorsque les cellules CO7 ont été transfectées avec des plasmides SNARE inversés, les protéines SNARE inversées ont été exprimées à la surface cellulaire.

La cytométrie en flux a été utilisée pour mesurer les niveaux d'expression des protéines snare à la surface cellulaire. Afin de comparer leurs capacités de fusion membranaire, il était nécessaire que les vamps soient exprimés au même niveau. Par conséquent, la concentration de chaque plasmide snare inversé utilisé lors de la transfection a été titrée et optimisée pour la transfection.

Dans de telles conditions, les VAMP 1, 3, 4, 5, 7 et huit ainsi que la syntaxine une et quatre ont été exprimés au même niveau au niveau de la surface cellulaire ; respectivement, les SNARE neuronales qui médiatisent l’exocytose synaptique ont été utilisées pour tester la faisabilité du dosage. En effet, lorsque les cellules V exprimant la VAMP deux et les cellules T exprimant la SYNTAXINE une et la SNAP 25 ont été combinées, une expression robuste de bêta-galactosidase a été détectée. Toutefois, lorsque la VAMP deux ou la SNAP 25 n’étaient pas exprimées, seule une activité basale de bêta-galactosidase a été observée, indiquant que la fusion cellulaire et l’expression de la bêta-galactosidase dépendent globalement des interactions entre les SNARE v et t. Dans l’ensemble, la SYNTAXINE une, la SNAP 25, la VAMP une, la VAMP trois et la VAMP huit ont présenté des activités de fusion comparables et les plus élevées.

En revanche, l'activité basale de la bêta-GAL suggère que la combinaison de protéines n'induit pas la fusion membranaire, contrairement au cas de VAMP5 et de la syntaxine 1. Lors de la réalisation du test de fusion enzymatique, il est important de se rappeler d'ajouter l'unicamycine afin d'empêcher la N-glycosylation des protéines ESNA et de rajouter du DTT pour éviter la formation de ponts disulfure entre les protéines ESNA.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser le test de fusion cellulaire.