La Citrobacter rodentium: Étudier Contributions des agents pathogènes et l'hôte de la colite infectieuse

L’objectif global de cette procédure est d’induire une colite en infectant des souris avec l’agent pathogène miroir à Gram négatif, le rongeur citrobacter, permettant l’étude des interactions entre l’agent pathogène et l’hôte dans le tractus gastro-intestinal. Ceci est accompli en inoculant d’abord, une culture de rédemption zéro du jour au lendemain. Dans la deuxième étape, les souris sont infectées par gavage oral avec l’inoculum de nuit.

Ensuite, le septième jour après l’infection, le cæcum du côlon et le contenu luminal sont collectés lors de l’étape finale. Les tissus sont mis en plaques, les colonies bactériennes sont comptées et les tissus sont immunocolorés pour les protéines de l’hôte d’intérêt. En fin de compte, la charge pathogène, la fonction barrière, les dommages histologiques et les changements dans la réponse de l’hôte peuvent être évalués par immunohistochimie.

Bien que cette méthode offre un modèle robuste de la colite infectieuse, permettant d’étudier les interactions hôte-pathogène et les réponses immunitaires, elle peut également être adaptée pour examiner les effets de l’infection bactérienne sur le risque de cancer du côlon. Généralement, chez les individus novices à cette méthode lutteraient naturellement contre l’infection bactérienne des souris, avec ou avec, ou gage. Commencez par utiliser une boucle d’inoculation stérile pour tracer un rachat de C viable à partir d’un stock de glycérol congelé sur une galvanoplastie LB.

Après une nuit d’incubation à 37 degrés Celsius, utilisez une boucle d’inoculation pour transférer les colonies de la plaque LB à trois millilitres de bouillon stérile. Ensuite, incubez la culture ERO Dunum en aérobie dans un agitateur d’incubation de paillasse à 200 tr/min pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, le bouillon de lb inoculé devrait apparaître trouble.

Agitez doucement la culture pour répartir uniformément la culture de cellules bactériennes, puis chargez une seringue d’un millilitre de bouillon et fixez-la à une aiguille de gavage gastrique. Sélectionnez une souris à gavage en saisissant fermement la peau lâche de son cou et de son dos avec fem et les doigts. Tirez ensuite la tête de l’animal vers l’arrière avec un index pour immobiliser la tête de l’animal et redressez l’œsophage pour l’insérer.

En maintenant la souris en position verticale, dirigez l’extrémité du bulbe de l’aiguille du gavage gastrique le long du côté de la bouche de l’animal et sur sa langue. Passez doucement l’aiguille le long du toit de la bouche de l’animal et avancez l’aiguille dans l’œsophage. Enfin, utilisez la seringue pour injecter lentement 100 microlitres de l’inoculum bactérien, puis retirez délicatement l’aiguille du gavage.

Surveillez le rythme respiratoire et le comportement de la souris après l’avoir renvoyée, dans sa cage le jour du test, ébouriffez la souris comme cela vient d’être démontré, puis gavage de l’animal avec 150 microlitres de dextrine fitzy fraîchement préparée. Retirer la nourriture de la cage à ce moment-là, quatre heures après le gavage, puis la sédation de l’animal. Utilisez la ponction cardiaque pour recueillir autant de sang que possible de l’animal anesthésié.

Ajoutez le sang à une concentration finale de citrate acide de dextrose à 3 % dans un microtube de centrifugation pour dissuader la coagulation. Ensuite, faites tourner les échantillons de sang pendant 12 minutes à 1000 fromages et quatre degrés Celsius. Ensuite, collectez le sérum et réduisez-le à un à 10 et un à 100 dans le PBS à 100 microlitres de chaque échantillon.

À ces deux dilutions à une plaque de 96 puits en double. Pour préparer la courbe standard, diluez des échantillons de 100 microlitres des 80 milligrammes par millilitre d’origine. Fitz Dextrin utilisé pour gaver les souris dans du PBS dans des microtubes de centrifugation sombres.

Ajoutez ensuite les échantillons standard dans une plaque de 96 puits en trois exemplaires. Ensuite, utilisez un fluorimètre pour quantifier la fluorescence de chaque échantillon et pour déterminer la concentration de dextrine FXI à l’aide d’une technique aseptique, commencez cette étape en ajoutant un millilitre de PBS stérile et une bille métallique d’autoclave à fond rond à deux tubes de centrifugation de millilitre. Pesez ensuite chaque tube.

Ensuite, après avoir retiré le sérum et le côlon de la souris, séparez le sérum du côlon et ouvrez-les longitudinalement. Prélevez le contenu luminal à l’aide d’une pince et ajoutez-le dans un tube de PBS. Lavez les tissus de la séquelle et du côlon avec du PBS stérile avant de les placer dans des tubes séparés.

Pesez maintenant les tubes de tissu et homogénéisez les échantillons à l’aide d’un batteur à billes pendant six minutes. À 30 hertz, ajoutez 180 microlitres de PBS stérile par puits à une plaque de 96 puits. Ajoutez ensuite 20 microlitres de chaque échantillon homogénéisé dans le premier puits de chaque rangée et mélangez bien.

Diluez en série les échantillons en ajoutant 20 microlitres de chaque puits précédent pour obtenir une dilution de 10 puissance moins un dans le premier puits jusqu’à 10 puissance moins six. Ensuite, plaquez 10 microlitres de chaque dilution de chaque échantillon en trois exemplaires sur une plaque LB à fond carré avec une grille après une nuit d’incubation à 37 degrés Celsius. Comptez les unités formant colonie sur une assiette.

Faites la moyenne des triplets pour chaque échantillon, puis notez la dilution à laquelle chaque échantillon a été compté. Multipliez l’UFC moyenne par 50 et par le facteur de dilution auquel l’échantillon a été compté, ce qui donne des UFC par millilitre. Enfin, divisez par le poids du tissu pour déterminer les UFC par gramme après une nuit, formelle et fixation de la section du côlon et du sécum de 0,5 centimètre précédemment enregistrée.

Le lendemain matin, lavez les mouchoirs avec de l’éthanol à 70 % et placez-les dans une cassette pour les envoyer à un centre d’histologie pour les intégrer dans de la paraffine et les colorer à l’hématine et à l’éosine pour dépariser les tissus. Placez les lames dans un bocal de coloration coplan dans un bain-marie à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Maintenant, placez les lames dans du xylène pendant quatre lavages de deux minutes.

Chacun réhydrate les lames avec deux lavages de cinq minutes et 100 % d’éthanol, suivis d’un lavage de cinq minutes dans chacun des éléments suivants : 95 % d’éthanol, 75 % d’éthanol et de l’eau distillée. Placez les lames lavées dans un bocal coplan avec un tampon de citrate de sodium préchauffé, puis placez le bocal dans un cuiseur vapeur pendant 30 minutes après avoir laissé reposer le bocal à température ambiante pendant encore 30 minutes, lavez les lames trois fois avec PBS Zied pendant cinq minutes.

Lorsque les lames sont sèches, marquez la zone autour du tissu avec un stylo Pap. Bloquez ensuite le tissu avec un tampon de blocage dans une chambre d’humidité d’immunocoloration à température ambiante. Au bout d’une heure, videz le tampon de blocage et incubez les tissus dans 50 à 100 microlitres d’anticorps primaires à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Après la période d’incubation, lavez les tissus trois fois avec du PBS Azi pendant cinq minutes. Ensuite, incubez les lames dans 50 à 100 microlitres de l’anticorps secondaire dans l’obscurité à température ambiante après une heure, lavez les lames trois fois avec de l’eau distillée pendant cinq minutes. Enfin, déshydratez les tissus, recouvrez les lames avec du dpi, un support de montage à l’or prolongé, puis appliquez une lamelle de protection observée les lames sous un microscope à fluorescence.

Cette première figure montre la dextrine de Fitz mesurée dans le sérum de souris C57 black six, ainsi que de souris à récepteur de type Toll à des souris knock-out, qui présentaient auparavant une intégrité altérée de la barrière épithéliale pendant l’infection en présence d’une barrière épithéliale intestinale intacte. La dextrine ZI est peu perméable à travers cette couche. Par conséquent, des niveaux accrus de dextrine Fitz dans le sérum suggèrent une altération de l’intégrité de la barrière épithéliale intestinale pendant l’infection, permettant à cette molécule de s’infiltrer en tant que contrôle des niveaux sériques chez les souris non infectées.

Des gavages à la dextrine Fitz sont également présentés. Assent est un agent pathogène luminal qui peut adhérer intimement aux cellules épithéliales intestinales. Les charges bactériennes dans le contenu luminal, les séquelles et les tissus du côlon peuvent être au septième jour. Après l’infection.

On a constaté que les charges bactériennes dans le côlon atteignent un pic d’environ 10 à 9 UFC par gramme. La plupart des pathologies observées au cours de l’infection à C DUM chez les souris C 57 PL six se produisent dans les deux centimètres distaux du côlon de manière macroscopique au septième jour après l’infection. Un épaississement de la muqueuse colique, ainsi qu’un raccourcissement et une longueur du côlon sont observés normalement pendant l’infection.

C 57 PL six souris ne souffrent que d’une inflammation et d’une pathologie modérées caractérisées histologiquement par une infiltration de cellules immunitaires, un allongement des cryptes coliques et une appauvrissement des cellules du coït. Pour caractériser davantage les réponses de l’hôte pendant l’infection avec zéro rédemption, la coloration immunofluorescente peut être utilisée pour examiner les changements dans les protéines d’intérêt, tels que les marqueurs de prolifération, ou pour examiner des aspects de la réponse bactérienne tels que sa localisation dans le tissu infecté. Cette figure illustre un exemple de cette technique de coloration, l’examen de la protéine hôte KI 67, un marqueur de la prolifération cellulaire qui apparaît en rouge et de la déchirure de la protéine zéro, qui apparaît en vert pour examiner la localisation bactérienne au 12e jour après l’infection.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques minutes si elle est effectuée correctement. Lors de cette procédure, il est important que la technique de jaugeage soit effectuée correctement pour s’assurer que les souris sont infectées et que la santé de l’animal est surveillée tout au long de l’infection. Au cours des 10 à 15 dernières années, le modèle de rongeur Citrobacter est devenu la référence pour l’étude de la fixation d’un pathogène bactérien confronté tel que l’epec dans le diable.

De plus, il est devenu un modèle bien reconnu pour l’étude des réponses immunitaires des muqueuses aux bactéries, telles que le développement des réponses TH 17 dans l’intestin.