Protocole amélioré pour la microdissection laser d'îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux
6 janvier 2013
Microdissection laser est une technique qui permet la récupération des cellules sélectionnées à partir des quantités infimes de parenchyme. Nous décrivons ici un protocole pour l'acquisition des îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux être utilisés pour les études transcriptomiques. Notre protocole améliore l'autofluorescence intrinsèque des cellules bêta humaines, facilitant ainsi leur collection.
Bonjour, je m'appelle Dorte de l'Institut Thea Hands de l'Université de Technologie, Reen Laser. La microdissection est une technique qui permet d'obtenir une population cellulaire spécifique à partir de très faibles quantités de tumeur d'origine. Les cellules dissectées peuvent être utilisées pour des études transcriptomiques et protéomiques, des évaluations de l'ADN ou des analyses chromosomiques.
Ici, nous fournissons notre protocole pour obtenir des métacellules pancréatiques humaines à partir de prélèvements chirurgicaux destinés à des études transcriptomiques. Coupez le tissu pancréatique en petits morceaux. Placez un morceau au centre d'un moule à cryo-inclusion et recouvrez-le de composé d'inclusion refroidi.
Congelez immédiatement le tissu avec deux matériaux réfrigérés du Bhoutan et stockez-le à moins 80 degrés Celsius. Étiquetez des lames adhésives 40 et pré-refroidissez-les à l'intérieur de la chambre Christed. Fixez le tissu congelé sur le porte-échantillon à l'aide du composé OCT après avoir paré le bloc de cryo-inclusion.
Découper 40 sections de 10 micromètres d'épaisseur. Transférer une section sur une lame en touchant l'arrière de la lame avec le doigt afin de réchauffer uniquement l'emplacement prévu pour déposer la section. Sécher les sections deux à trois minutes dans le cryostat, puis les conserver ensuite à moins 80 degrés Celsius. Préparer les réactifs d'atmosphère et refroidir tous les liquides, sauf la sélénie, sur de la glace. Ceci augmentera l'autofluorescence intrinsèque des cellules pét avant la microdissection.
Quatre sections seront déclassées à chaque fois. Manipulez deux sections simultanément. Fixez-les d'abord dans de l'éthanol à 70 % pendant 30 secondes.
Ensuite, lavez les sections par cinq à six trempages rapides dans de l'eau traitée au DPC. Déshydratez le tissu une minute dans de l'éthanol à 100 % et répétez cette étape. Incubez les lames dans du sélénium pendant quatre minutes.
Pendant ce temps, commencez la déshydratation d'une autre paire de sections. Enfin, laissez sécher les lames à l'air libre pendant trois à cinq minutes à l'abri de la lumière. Protégez le tissu contre l'humidité et l'autofluorescence en évitant la décoloration, en plaçant les deux lames dos à dos dans un tube de 50 ml enveloppé de papier d'aluminium. Avant la section, nettoyez le microscope avec RNAs away et fixez le bouchon adhésif dans le robo Mover.
Insérez la lame sur la platine et déplacez le capuchon près de la section sans la toucher. Localisez les orifices en identifiant les zones des cellules sébacées présentant une autofluorescence plus marquée. L'autofluorescence intrinsèque des cellules sébacées humaines apparaît jaune dans ce dispositif, tandis que les canaux pancréatiques présentent une autofluorescence verte intense.
Sélectionnez les zones cellulaires les plus appropriées à l’aide de l’outil de sélection manuelle et microdisséquez-les en activant le laser. Disséquez au laser les orifices de quatre sections cryogéniques dégradées dans un capuchon adhésif en 40 à 60 minutes. Si désiré, vérifiez le tissu capturé en déplaçant le capuchon vers le point de contrôle du microscope.
Retirez le capuchon du robo mover et ajoutez-y 10 microlitres de tampon d'extraction dans le couvercle du capuchon pour la lyse cellulaire. Incubez le capuchon à l’envers à 42 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Faire centrifuger le lysat, étiqueter le tube et le conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que l’extraction d’ARN puisse être réalisée. Réaliser le laser d’ablation, la microdissection et la lyse avec les 40 prélèvements cryogéniques. Par la suite, rassembler les 10 lysats et poursuivre l’isolement de l’ARN à l’aide du kit d’isolement d’ARN UR PU en suivant le protocole fourni afin d’obtenir 11 microlitres d’ARN.
En général, nous n'avons pas observé de relation directe entre la quantité de tissu microdisséqué et le rendement en ARN. Les différences d'intervalle de temps entre la récolte par les chirurgiens et la congélation de l'échantillon pancréatique après son examen par le pathologiste pourraient en partie expliquer la qualité et la quantité de l'ARN récupéré. D'autres facteurs importants à prendre en compte sont l'énergie laser appliquée pour la microdissection, une énergie plus faible permettant une meilleure intégrité de l'ARN, ainsi que la focalisation du laser et la distance entre les points ciblés par le coupeur laser à pression. Par ailleurs, la quantité d'ARN peut être optimisée en maintenant la distance entre le capot adhésif et le tissu aussi faible que possible.
Éviter la perte de tissu microdisséqué pendant le processus de capture, à condition qu'un microscope de microdissection laser soit disponible. Cette procédure pourrait être mise en œuvre dans tous les établissements de recherche effectuant des pancréatectomies partielles, augmentant ainsi l'accès au tissu palpébral humain provenant de sujets non diabétiques et diabétiques.
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Aperçu
Cet article présente un protocole de microdissection laser pour récupérer des îlots pancréatiques humains à partir de prélèvements chirurgicaux. La technique améliore la collecte de cellules bêta pour des études transcriptomiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Transcriptomique
Contexte
- La microdissection au laser permet l'isolement de populations cellulaires spécifiques.
- Elle est particulièrement utile pour les petits échantillons de tissu.
- La technique peut être appliquée à diverses études, notamment les analyses transcriptomiques et protéomiques.
- L'amélioration de l'autofluorescence facilite la collecte des cellules ciblées.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole détaillé pour l'acquisition d'îlots pancréatiques humains.
- Faciliter l'étude des cellules bêta dans la recherche transcriptomique.
- Améliorer l'efficacité de la collecte des cellules à partir de prélèvements chirurgicaux.
Méthodes utilisées
- Technique de microdissection laser appliquée à un tissu pancréatique.
- Préparation des échantillons de tissu en les découpant en petits morceaux.
- Inclusion du tissu dans un composé refroidi pour une dissection optimale.
- Collecte des cellules bêta pour des analyses ultérieures.
Résultats principaux
- Isolation réussie d'îlots pancréatiques humains.
- Amélioration de l'autofluorescence des cellules bêta observée.
- Le protocole a démontré son efficacité pour les études transcriptomiques.
- Permet la collecte de populations cellulaires ciblées à partir de petits échantillons.
Conclusions
- Le protocole améliore la récupération des îlots pancréatiques humains.
- La microdissection laser est un outil précieux pour l'analyse cellulaire.
- Des méthodes améliorées peuvent conduire à de meilleurs aperçus dans la recherche transcriptomique.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La microdissection au laser permet l'isolement précis de cellules bêta pancréatiques humaines à partir de prélèvements chirurgicaux limités, répondant ainsi à un goulot d'étranglement critique dans les études transcriptomiques des tissus liés au diabète. En amplifiant l'autofluorescence intrinsèque grâce à un traitement à froid avec des réactifs, le protocole réduit le temps de manipulation des tissus et améliore la préservation de l'ARN, soutenant directement la validation ciblée dans la recherche sur les maladies métaboliques. Cette approche renforce la dé-risquisation mécanistique en fournissant des populations cellulaires purifiées pour des applications omiques en aval dans les flux de travail de découverte précoce.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en isolant des populations pures de cellules bêta pour l'analyse de voies dans des modèles de diabète de type 2.
- Valeur opérationnelle : Facilite la détection biologique des risques grâce à une identification rapide et précise des cellules cibles par autofluorescence améliorée, réduisant ainsi les faux positifs dans le choix des cibles.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour la standardisation des tests en fournissant des entrées d'ARN cohérentes et de haute intégrité provenant d'îlots microdisséqués.
- Valeur opérationnelle : Soutient des résultats quantitatifs reproductibles, essentiels pour la préparation au criblage et la réutilisation de la plateforme dans les voies de découverte de biomarqueurs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Préserve la pertinence pathologique en permettant l'analyse transcriptomique d'îlots pancréatiques humains directement liés à la physiopathologie du diabète.
- Valeur opérationnelle : Garantit la continuité entre la découverte et la validation préclinique en fournissant des populations cellulaires définies pour des études mécanistiques complémentaires.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre au continuum de la découverte en permettant la vérification d'hypothèses en biologie précoce, en soutenant le développement de tests grâce à des entrées standardisées et en éclairant les décisions translationnelles par un profilage moléculaire quantitatif.
- Biologie de la découverte : Facilite l'élucidation des voies biologiques et la réduction des risques biologiques en isolant les cellules bêta pour une validation fonctionnelle des cibles dans des modèles de maladies métaboliques.
- Criblage : Fournit des échantillons prêts à l'essai avec des rendements reproductibles en ARN, essentiels pour analyser les effets de composés sur les îlots isolés.
- Analytique : Produit des données transcriptomiques quantitatives permettant de comparer les états diabétiques et non diabétiques afin de guider l'identification de candidats thérapeutiques.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en fournissant des échantillons pertinents pour l'humain, reliant ainsi les résultats in vitro aux mécanismes de la maladie.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une capacité réutilisable d'accès à des îlots humains primaires dans plusieurs projets, réduisant ainsi la dépendance à l'égard de sources de donneurs variables.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant l'ambiguïté mécanistique des voies de signalisation spécifiques aux cellules bêta.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et la reproductibilité grâce à un traitement contrôlé des tissus et à des paramètres de dissection définis.
- Valeur stratégique : Permet de mieux décider de poursuivre ou non un projet en facilitant l'évaluation précoce de l'engagement de la cible dans des cellules pertinentes pour l'humain, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation des cibles pour le diabète ajustée au risque, sur la base de profils transcriptomiques validés d'îlots humains.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en histologie, en cryocoupe et en instrumentation de microdissection laser.
- Dépend de l'accès à un système PALM MicroBeam ou à une plateforme équivalente de microdissection laser dotée de la fonction AutoLPC.
- Exige des protocoles standardisés de manipulation des réactifs afin de préserver l'autofluorescence et l'intégrité de l'ARN entre différents utilisateurs.
- Implique des ajustements selon la qualité variable des échantillons pancréatiques et le temps d'ischémie entre la récolte et la congélation.
- Limité par les contraintes de rendement en ARN, nécessitant la combinaison de plusieurs échantillons microdissectés pour obtenir une quantité suffisante en entrée des kits en aval.
