Protocole amélioré pour la microdissection laser d'îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux
6 janvier 2013
Microdissection laser est une technique qui permet la récupération des cellules sélectionnées à partir des quantités infimes de parenchyme. Nous décrivons ici un protocole pour l'acquisition des îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux être utilisés pour les études transcriptomiques. Notre protocole améliore l'autofluorescence intrinsèque des cellules bêta humaines, facilitant ainsi leur collection.
Bonjour, Je m’appelle Dorte de l’Institut Thea Hands de l’Université de technologie, Reen Laser. La microdissection est une technique qui permet d’obtenir une population cellulaire spéciale à partir de très petites quantités de tumeur parente. Les cellules disséquées peuvent être utilisées pour des études transcriptomiques et protéomiques, l’évaluation de l’ADN ou l’analyse des chromosomes.
Nous présentons ici notre protocole d’acquisition de métacellules pancréatiques humaines à partir d’échantillons chirurgicaux à utiliser pour les études transcriptomiques. Coupez le tissu pancréatique en petits morceaux. Placez un morceau au centre d’un moule cryogénique et couvrez-le d’un composé d’enrobage réfrigéré.
Congelez immédiatement le tissu Avec deux matériaux Bhoutan réfrigérés et stockés à moins 80 degrés Celsius. Étiquetez 40 lames adhésives et pré-refroidissez-les à l’intérieur de la chambre Christed. Fixez le tissu congelé sur le porte-échantillon avec le composé OCT après avoir coupé le bloc cryogénique.
Coupez 40 sections de 10 micromètres d’épaisseur. Transférez une section sur une diapositive en touchant l’arrière de la diapositive avec votre doigt pour réchauffer uniquement la position pour placer la section dessus.Essayez les sections deux à trois minutes à l’intérieur du cryos mort et stockez-les ensuite à moins 80 degrés Celsius, préparez les réactifs Ation et refroidissez tous les liquides sauf seline sur de la glace. Cela augmentera l’autofluorescence intrinsèque des cellules PET avant la microdissection.
Quatre sections seront déclassées à chaque fois. Manipulez deux sections à la fois. Fixez-les d’abord avec de l’éthanol à 70 % pendant 30 secondes.
Ensuite, lavez les sections avec cinq à six trempettes rapides. Dans l’eau traitée DPC ci-après. Déshydratez le tissu une minute dans de l’éthanol à 100 % et répétez cette étape, incubez les lames en seline pendant quatre minutes.
Pendant ce temps, commencez la déshydratation d’une autre paire de sections. Enfin, faites sécher les lames à l’air libre pendant trois à cinq minutes dans l’obscurité. Protégez le tissu de l’humidité et l’autofluorescence du blanchiment en plaçant les deux lames dos à dos dans une feuille Enveloppez un tube de 50 ml Avant la section, nettoyez le microscope avec les ARN et fixez le capuchon adhésif dans le robot Mover.
Insérez la glissière dans la platine et déplacez le capuchon près de la section sans la toucher. Localisez les œillets en identifiant les zones cellulaires autofluorescentes meilleures. L’autofluorescence intrinsèque des meilleures cellules humaines apparaît jaune dans la configuration, tandis que les canaux pancréatiques montrent une autofluorescence vert vif.
Sélectionnez les meilleures zones cellulaires à l’aide de l’outil de sélection à main levée et micro-disséquez-les en démarrant le laser. Disséquez les œillets de quatre sections cryogéniques déclassées en un seul capuchon adhésif en 40 à 60 minutes. Si vous le souhaitez, vérifiez le tissu capturé en déplaçant le capuchon au point de contrôle du microscope.
Retirez le capuchon du robot mobile et versez-le. Tampon d’extraction de 10 microlitres dans le couvercle du capuchon pour la rupture cellulaire. Incuber le capuchon à l’envers à 42 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Faites tourner le lysat, étiquetez le tube et conservez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que l’extraction de l’ARN puisse avoir lieu. Effectuez le laser Ation, la micro dissection et la lyse avec les 40 cryodissections. Ensuite, unissez les 10 lysats et poursuivez l’isolement de l’ARN à l’aide du kit d’isolement d’ARN UR PU en suivant le protocole fourni pour obtenir 11 microlitres d’ARN.
En général, nous n’avons pas trouvé de relation directe entre la quantité de tissu microdisecté et le rendement en ARN. Les différences dans l’intervalle de temps entre le prélèvement par les chirurgiens et la congélation de l’échantillon pancréatique après son examen par le pathologiste pourraient expliquer en partie la qualité thériale et la quantité d’ARN récupéré. D’autres facteurs clés à prendre en compte sont l’énergie laser appliquée pour la micro-dissection avec l’énergie la plus faible, en utilisant l’intégrité de l’ARN la plus élevée, ainsi que la focalisation laser et la distance des points de pointage du découpeur à pression laser. De plus, la quantité d’ARN peut être optimisée en maintenant la distance entre le capuchon adhésif et le capuchon adhésif aussi faible que possible.
Évitez la perte de tissu microdisséqué pendant le processus de capture, à condition que le microscope de microdissection laser soit disponible. Cette procédure pourrait être mise en œuvre dans tous les établissements de recherche pratiquant des ectomies partielles du pancréas, augmentant ainsi l’accès au matériel des paupières humaines chez les sujets non diabétiques et diabétiques.
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Aperçu
Cet article présente un protocole de microdissection au laser pour récupérer les îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux. La technique améliore la collecte des cellules bêta pour des études transcriptomiques.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neuroscience
- Biologie cellulaire
- Transcriptomique
Contexte
- La microdissection au laser permet l'isolement de populations cellulaires spécifiques.
- Elle est particulièrement utile pour les petits échantillons de tissus.
- La technique peut être appliquée à diverses études, y compris les analyses transcriptomiques et protéomiques.
- L'amélioration de l'autofluorescence aide à la collecte de cellules ciblées.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole détaillé pour l'acquisition d'îlots pancréatiques humains.
- Faciliter l'étude des cellules bêta dans la recherche transcriptomique.
- Améliorer l'efficacité de la collecte de cellules à partir de spécimens chirurgicaux.
Méthodes utilisées
- Technique de microdissection au laser appliquée au tissu pancréatique.
- Préparation des échantillons de tissus en les coupant en petits morceaux.
- Incorporation du tissu dans un composé réfrigéré pour une dissection optimale.
- Collecte des cellules bêta pour une analyse ultérieure.
Résultats principaux
- Isolement réussi des îlots pancréatiques humains.
- Amélioration de l'autofluorescence des cellules bêta observée.
- Le protocole a démontré son efficacité pour les études transcriptomiques.
- Facilitation de la collecte de populations cellulaires ciblées à partir de petits échantillons.
Conclusions
- Le protocole améliore la récupération des îlots pancréatiques humains.
- La microdissection au laser est un outil précieux pour l'analyse cellulaire.
- Les méthodes améliorées peuvent conduire à de meilleures perspectives dans la recherche transcriptomique.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Laser microdissection enables precise isolation of human pancreatic beta cells from limited surgical specimens, addressing a critical bottleneck in transcriptomic studies of diabetes-relevant tissues. By enhancing intrinsic autofluorescence through ice-cold reagent processing, the protocol reduces tissue handling time and improves RNA preservation, directly supporting target validation in metabolic disease research. This approach strengthens mechanistic de-risking by providing purified cell populations for downstream omics applications in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating pure beta cell populations for pathway analysis in type 2 diabetes models.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through rapid, accurate identification of target cells via enhanced autofluorescence, reducing false positives in target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for assay standardization by providing consistent, high-integrity RNA inputs from microdissected islets.
- Operational Value: Supports reproducible quantitative outputs essential for screening readiness and platform reuse in biomarker discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by enabling transcriptomic analysis of human pancreatic islets directly linked to diabetic pathophysiology.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supplying defined cell populations for mechanistic follow-up studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis testing in early biology, supporting assay development through standardized inputs, and informing translational decisions via quantitative molecular profiling.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating beta cells for functional target validation in metabolic disease models.
- Screening: Delivers assay-ready samples with reproducible RNA yields, critical for screening compound effects on isolated islets.
- Analytics: Generates quantitative transcriptomic readouts that allow comparison between diabetic and non-diabetic states to inform lead identification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing human-relevant samples that bridge in vitro findings to disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for accessing primary human islets across multiple projects, reducing dependency on variable donor sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in beta cell-specific signaling pathways.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through controlled tissue processing and defined dissection parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target engagement in human-relevant cells, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of diabetes targets based on validated human islet transcriptomic profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, cryosectioning, and laser microdissection instrumentation.
- Dependent on access to a PALM MicroBeam system or equivalent LMD platform with AutoLPC capability.
- Necessitates standardized reagent handling protocols to maintain autofluorescence and RNA integrity across users.
- Involves adaptation considerations for varying pancreatic specimen quality and ischemic time between harvest and freezing.
- Limited by RNA yield constraints, necessitating pooling of multiple microdissected samples for sufficient input to downstream kits.
