Microfluidique picolitres bioréacteur pour Analyse microbienne unicellulaire: Fabrication, configuration du système, et l'opération

L'objectif général de cette procédure est d'analyser des bactéries individuelles et des microcolonies isogéniques en évolution avec une résolution spatiale et temporelle complète dans des conditions environnementales constantes, à l'aide d'un dispositif de culture microfluidique. Cela est réalisé en concevant d'abord un système de culture microfluidique à l'aide d'un logiciel de CAO. Ensuite, des dispositifs jetables de culture microfluidique sont fabriqués en polydiméthylsiloxane et contiennent des bioréacteurs de l'ordre du picolitre, d'une hauteur d'un micron, afin de limiter la croissance bactérienne à une couche unique.

La culture microbienne est ensuite introduite dans le dispositif microfluidique afin d'ensemencer des cellules mères individuelles à l'intérieur des bioréacteurs. Ces cellules sont développées par une perfusion continue de milieu de croissance à travers le système. Les résultats sont obtenus par microscopie automatisée en lapso-temporel, montrant la culture d'une souche industriellement pertinente de Corynebacterium glutamicum, les données de croissance et l'hétérogénéité entre les cellules.

Dans la biotechnologie conventionnelle, la plupart des analyses reposent sur des données moyennes. Notre dispositif de microfluidique permet l'analyse de cellules uniques de bactéries individuelles avec une résolution spatiale et temporelle. C'est un outil utile pour examiner attentivement l'hétérogénéité entre cellules au sein de microcolonies isogéniques.

Nous appliquons une photolithographie classique utilisant le SU-8 et un moulage de puce en polydiméthylsiloxane pour fabriquer des dispositifs microfluidiques jetables présentant une résolution des milieux submicrométrique. Nous avons démontré avec succès notre technologie à l’aide de plusieurs micro-organismes biotechnologiques, tels qu’Escherichia coli et Corynebacterium glutamicum. Pour commencer, concevez le dispositif microfluidique à l’aide d’un logiciel de CAO.

Le design présenté dans ce protocole comprend deux entrées d'ensemencement, un générateur de gradient pour mélanger deux substrats différents, une sortie, et six réseaux composés chacun de cinq bioréacteurs. Dans une salle blanche, préparez une plaquette de silicium de quatre pouces et appliquez par rotation une couche d'un micron de résine photosensible SU-8 2000.5 sur la plaquette, comme décrit dans le protocole textuel accompagnant. Placez la plaquette recouverte sur une plaque chauffante à 95 degrés Celsius afin d'éliminer le solvant en excès, puis insérez le premier masque photolithographique, comprenant les régions de piégeage des réacteurs picolitre, ainsi que la plaquette recouverte, dans l'aligneur de masque.

Ensuite, exposer la plaquette en mode contact sous vide à une lumière de 350 à 400 nanomètres pendant trois secondes à une intensité de sept milliwatts par centimètre carré. Réaliser une cuisson post-exposition sur une plaque chauffante plane à 95 degrés Celsius afin d'initier la polymérisation du SU-8. Puis, placer la plaquette dans un bain de révélateur SU-8 pendant une minute, puis transférer la plaquette dans un second récipient contenant du révélateur SU-8 frais pendant quelques secondes.

Rincez la plaquette à l'isopropanol pour éliminer le révélateur SU-8 et séchez-la à l'aide d'un flux d'azote ou d'un essoreur à plaquettes. Ensuite, effectuez une cuisson dure de la plaquette pendant 10 minutes à 150 degrés Celsius. Puis, fabriquez la deuxième couche comme décrit dans le protocole textuel accompagnant afin de compléter le moule maître.

Commencez la fabrication de la puce en PDMS en mélangeant la base et l'agent porteur dans un rapport de 10 à 1. Débarrassez le mélange de PDMS des bulles d'air pendant environ 30 minutes dans un dessiccateur sous vide, jusqu'à disparition complète des bulles. Ensuite, placez la plaquette en SU-8 dans un dispositif de moulage et versez une couche de trois millimètres de mélange de PDMS sur la plaquette.

Ensuite, faire durcir le PDMS pendant trois heures à 80 degrés Celsius dans une étuve. Une fois refroidi, décoller délicatement la plaque de PDMS du wafer et découper la plaque en puces individuelles à l’aide d’un scalpel propre et bien aiguisé. Laver les puces dans un bain de n-pentane pendant 90 minutes, puis effectuer deux bains de lavage à l’acétone de 90 minutes chacun.

Séchez les puces pendant la nuit pour éliminer tout résidu de solvant. Juste avant l'expérience, percez les orifices d'entrée et de sortie dans la puce en PDMS à l'aide d'une aiguille ou d'un poinçon ayant un diamètre légèrement inférieur à celui des connecteurs utilisés pour relier les tubulures à la puce en PDMS. Ensuite, nettoyez soigneusement la puce microfluidique en PDMS avec de l'isopropanol et utilisez du ruban adhésif transparent pour enlever les particules de poussière éventuellement accrochées.

En outre, nettoyez une lame de verre fine de 170 microns d'abord avec de l'acétone, puis de l'isopropanol, suivis d'eau déionisée, et séchez la lame à l'aide d'un courant d'azote. Une fois propre et sèche, oxydez par plasma la lame de verre et la puce PDMS pendant 25 secondes en utilisant une puissance de 50 watts et un débit d'oxygène de 20 sccm. Ensuite, alignez soigneusement la puce PDMS et la lame de verre avant de poser le PDMS sur le verre, ce qui provoquera une liaison en quelques secondes.

Fixez le lien en faisant cuire l'assemblage pendant 10 secondes à 80 degrés Celsius. Pour préparer les bactéries pour une expérience sur puce, inoculez une colonie unique d'une souche bactérienne choisie, telle que C.glutamicum, dans 20 millilitres de milieu BHI frais, puis incubez la culture toute la nuit à 30 degrés Celsius sur un agitateur rotatif à 120 tr/min. Le lendemain matin, transférez 10 microlitres de la culture initiale dans une seconde culture contenant 20 millilitres du milieu choisi et laissez les cellules croître toute la nuit dans les mêmes conditions.

Le lendemain, préchauffer l'incubateur d'un microscope inversé à 30 degrés Celsius. Cela peut prendre jusqu'à deux heures selon le dispositif utilisé. Pendant que le dispositif atteint la température souhaitée, ouvrir l'incubateur, sélectionner l'objectif souhaité et le préparer avec tout milieu de montage nécessaire.

Ensuite, montez la puce à l'intérieur du support de puce et fixez-la en place. Centrez l'échantillon sur le microscope et focalisez sur les réseaux de bioréacteurs picolitriques. Une fois la puce au point, reliez les entrées et sorties avec les tubulures appropriées, puis placez la tubulure de sortie dans un réservoir de déchets.

Ensuite, remplissez une seringue avec du milieu frais, insérez-la dans une pompe à seringue et rincez les canaux microfluidiques pendant une heure à un débit de 200 nanolitres par minute afin d'amorcer la puce. Tandis que les cellules sont encore en phase exponentielle précoce de croissance, transférez un millilitre de la culture bactérienne dans une seringue stérile et remplacez la seringue et le tube contenant le milieu par la suspension cellulaire et un tube neuf. Injectez la suspension cellulaire dans les canaux à un débit volumétrique de 200 nanolitres par minute jusqu'à ce que la majorité des bioréacteurs picolitre soient remplis.

Si un petit nombre de bioréacteurs sont remplis, augmentez le débit à 800 à 1200 nanolitres par minute. Lorsque la quantité souhaitée de cellules a été ensemencée, déconnectez la suspension cellulaire, reconnectez le milieu de croissance à la puce et perfusez avec un milieu frais à 100 nanolitres par minute. Ensuite, analysez la puce et sélectionnez des bioréacteurs spécifiques pour l'acquisition d'images en lapse de temps.

Ensuite, configurez une séquence de microscopie en time-lapse afin d'imaginer les bioréacteurs du début à la fin et de démarrer l'expérience. Une fois que tous les bioréacteurs de l'ordre du picolitre sont surcroîtés, arrêtez l'expérience et éliminez les puces de manière appropriée. Pour commencer l'analyse, déterminez d'abord quels bioréacteurs remplissent tous les critères souhaités pour l'expérience, tels que le nombre et la position des cellules mères.

À l'aide d'un programme d'analyse, tel qu'ImageJ, déterminez la vitesse de croissance de chaque microcolonne en comptant le nombre de cellules à chaque point temporel. Calculez la vitesse maximale de croissance en traçant le temps en fonction du logarithme du nombre de cellules. Le système présenté ici peut être appliqué à l'étude de diverses espèces bactériennes en fonction de différents paramètres biologiques tels que la croissance, la morphologie ou un signal fluorescent.

Dans cet exemple, C.glutamicum a été cultivé dans des conditions standard de culture, et les courbes de croissance obtenues à partir de trois microcolonies isogéniques sont présentées ici. Les bioréacteurs de volume picolitre se sont également révélés utiles pour l'analyse de la production protéique au moyen de la microscopie à fluorescence en prise de vue différée, comme illustré ici. En exposant les cellules à une faible concentration de l'inducteur protéique IPTG, les variations de la protéine d'une cellule à l'autre peuvent être étudiées au niveau individuel, au sein de colonies issues d'une seule cellule mère.

La technique démontrée peut être appliquée pour surveiller et analyser des cellules bactériennes individuelles avec un contrôle environnemental parfait. Cela est difficilement réalisable à l’aide de systèmes conventionnels de culture à l’échelle du laboratoire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des puces de culture microfluidiques afin d’effectuer des analyses comparables au niveau de la cellule unique.