Name: Microfluidique picolitres bioréacteur pour Analyse microbienne unicellulaire: Fabrication, configuration du système, et lopération (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Découvrez la fabrication et l'utilisation d'un bioréacteur microfluidique picolitres pour l'analyse unicellulaire de bactéries comme Corynebacterium glutamicum et Escherichia coli. Cette méthode révèle l'hétérogénéité phénotypique avec une résolution spatiale et temporelle optimale.

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Les auteurs tiennent à remercier la technicienne Agnes Müller-Schröer pour sa précieuse contribution. Ce travail a été réalisé en partie à l’installation nanoélectronique Helmholtz (HNF) du Forschungszentrum Jülich GmbH. Les auteurs sont reconnaissants de leur aide et de leur soutien généreux.

1. Fabrication de plaquettes
<ol>
	<li>Concevoir le dispositif microfluidique contenant les entrées, les sorties, les canaux principaux et les PLBR (Figure 1A) à l’aide d’un logiciel de CAO.</li>
	<li>La conception présentée dans ce protocole (Figure 2) se compose de deux entrées d’ensemencement, d’un générateur de gradient pour le mélange de deux substrats différents, d’une sortie et de six réseaux de PLBR. Chaque réseau contient 5 PLBR, ce qui donne 30 PLBR parallèles à l’intérieur d’un dispositif microfluidique.</li>
	<li>Créez un photomasque lithographique contenant les dispositions de puces souhaitées (Figure 1B). Le photomasque a été produit en interne par écriture par faisceau d’électrons avec une résolution submicronique. Le masque utilisé était composé d’une couche de chrome sur une plaque de verre 5 en2. 
	Remarque : effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions de salle blanche de classe 100 ou supérieures (un organigramme du processus est illustré aux figures 3A et 3B).</li>
	<li>Nettoyez une plaquette de silicium de 4 pouces avec du piranha (rapport 10:1 d’acide sulfurique et de peroxyde d’hydrogène) et de l’acide fluorhydrique pendant plusieurs minutes (Attention : produits chimiques dangereux). Rincer à l’eau déminéralisée (DI) pendant environ 10 secondes.</li>
	<li>Déshydrater la gaufrette pendant 20 min à 200 °C.</li>
	<li>Appliquer une couche de résine photosensible SU-8 2000.5 de 1 μm sur la plaquette (1ère couche) (4 ml de résine, essorage 10 secondes avec, v = 500 tr/min et A = 100 tr/min/s, essorage 30 secondes avec v = 1 000 tr/min et A = 300 tr/min/s).</li>
	<li>Placez la plaquette enrobée sur une plaque chauffante à 95 °C pour éliminer l’excès de solvant (1,5 min à 65 °C, 1,5 min à 95 °C et 1 min à 65 °C ; utilisez idéalement deux plaques de cuisson).</li>
	<li>Insérez le photomasque de 1ère couche (ici les zones de piégeage des réacteurs à picolitres) et la plaquette à l’intérieur de l’aligneur de masque et exposez la plaquette à 350-400 nm (contact sous vide, 64 mJ/cm², t = 3 sec, I = 7 mW/cm²).</li>
	<li>Effectuer la cuisson post-exposition sur une plaque chauffante à 95 °C pour initier la polymérisation du SU-8 (1 min à 65 °C, 1 min à 95 °C et 1 min à 65 °C). Remarque : après cette étape, les structures de la couche SU-8 peuvent être vues.</li>
	<li>Placez la plaquette dans un bain de révélateur SU-8 pendant 1 minute et transférez-la dans un deuxième récipient avec du révélateur SU-8 frais pendant quelques secondes.</li>
	<li>Rincez la plaquette à l’isopropanol pour éliminer le révélateur SU-8 et la plaquette sèche à l’aide de l’écoulement d’azote de la touffeuse de la plaquette.</li>
	<li>Faites cuire la gaufrette dure pendant 10 min à 150 °C.</li>
	<li>Appliquer la résine photosensible 9 μm SU-8 2010 sur la plaquette (2èmecouche) (distribution de 4 ml de résine, essorage 10 secondes avec v = 500 tr/min, a = 100 tr/min/s et essorage 30 s avec v = 4 000 tr/min, a = 300 tr/min/s).</li>
	<li>Placez la plaquette avec SU-8 sur une plaque chauffante à 95 °C pour éliminer l’excès de solvant (15 min à 65 °C, 45-60 min à 95 °C et 10 min à 65 °C). Remarque : une attention particulière doit être portée aux rides et aux bulles. Si la plaquette est chauffée à 95 °C, le solvant évaporé peut être encapsulé dans de minuscules bulles de gaz.</li>
	<li>Insérez le photomasque avec la disposition souhaitée (ici les canaux principaux pour l’approvisionnement en nutriments) et la plaquette dans l’aligneur du masque et exposez-la à 350-400 nm (contact dur, 64 mJ/cm², t = 10 sec, I = 7 mW/cm²)</li>
	<li>Effectuer la cuisson post-exposition sur une plaque chauffante à 95 °C pour finaliser la polymérisation du SU-8 (5 min à 65 °C, 3:30 min à 95 °C, 3 min à 65 °C). Remarque : après cette étape, les structures de la couche SU-8 peuvent être vues.</li>
	<li>Placez la plaquette dans un bain de révélateur SU-8 pendant 45 secondes, transférez-la dans un deuxième récipient avec du révélateur SU-8 frais et développez-la pendant 60 secondes.</li>
	<li>Rincez la plaquette 20 secondes avec de l’isopropanol pour éliminer tout résidu de révélateur SU-8 et séchez la plaquette à l’aide d’azote sous pression.</li>
	<li>Enfin, faites cuire la gaufrette à 150 °C. En conséquence, la plaquette finale (Figure 1C) est obtenue, qui sera utilisée comme moule maître pour le moulage PDMS.</li>
	<li>Effectuer des mesures de profilomètre (Figure 3C) pour valider les hauteurs de structure du SU-8. Remarque : des imprécisions dans la hauteur de la structure peuvent entraîner un piégeage inefficace des cellules ou la perte de cellules pendant la culture.</li>
</ol>
2. Fabrication de puces de polydiméthylsiloxane
Remarque : Toutes les étapes suivantes doivent idéalement être effectuées dans des conditions d’écoulement laminaire pour éviter que les particules de poussière n’interfèrent avec le processus de fabrication (un organigramme du processus est illustré à la figure 4).
<ol>
	<li>Préparez un mélange de base de polydiméthylsiloxane (PDMS) et d’agent de durcissement dans un rapport de 10:1. Mélangez soigneusement jusqu’à l’obtention d’une solution homogène qui semble opaque. Préparez autant que nécessaire pour la hauteur de couche souhaitée (ici 3 mm).</li>
	<li>Dégazez le mélange PDMS pendant environ 30 minutes sous vide léger jusqu’à ce que toutes les bulles aient disparu.</li>
	<li>Préparez le dispositif de moulage (ou la boîte de Pétri) avec la plaquette SU-8 appropriée et versez-y le mélange PDMS (Figure 1D).</li>
	<li>Faites cuire le PDMS pendant 3 heures à 80 °C au four.</li>
	<li>Décollez délicatement la plaque PDMS de la plaquette. Coupez la plaque en copeaux simples à l’aide d’un scalpel propre et tranchant.</li>
	<li>Lavez les copeaux dans un bain de n-pentane pendant 90 min, suivi de deux bains de lavage à l’acétone (90 min chacun). Séchez les copeaux pendant la nuit pour éliminer tout résidu de solvant. Attention : effectuez le lavage PDMS sous hotte. Remarque : pendant le lavage au n-pentane, les monomères et les dimères sont éliminés du PDMS durci et la taille de la puce peut temporairement doubler pendant la procédure de lavage.</li>
	<li>Stockez les puces PDMS microfluidiques dans des conteneurs fermés jusqu’à l’expérience finale.</li>
	<li>Juste avant l’expérience, percez les trous d’entrée et de sortie dans la puce PDMS à l’aide d’une aiguille (ou d’un perforateur) d’un diamètre légèrement inférieur à celui des connecteurs utilisés pour connecter les tubes avec la puce PDMS.</li>
	<li>Nettoyez soigneusement la puce PDMS microfluidique avec de l’isopropanol et utilisez du scotch pour enlever toutes les particules de poussière qui pourraient coller du côté du PDMS structuré. Utilisez le scotch plusieurs fois jusqu’à ce qu’aucune particule ne soit visible sur la puce.</li>
	<li>Nettoyez successivement une lame de verre mince de 170 μm avec de l’acétone et de l’isopropanol. Enfin, nettoyez avec de l’eau déminéralisée et séchez avec de l’azote sous pression.</li>
	<li>Avant l’activation du plasma, réchauffez le nettoyeur plasma et faites-le fonctionner pendant environ 300 secondes. Oxydez au plasma la lame de verre et la puce PDMS (puissance 50 W, temps = 25 secondes, débit d’oxygène = 20 sccm).</li>
	<li>Alignez le PDMS et la puce de verre avant de coller. Enfin, placez soigneusement la puce PDMS sur la lame de verre (Figure 1E). Le PDMS et le verre se collent en quelques secondes. Remarque : ne poussez pas avec une pince à épiler sur le dessus de la puce PDMS pendant le processus de collage. Cela peut conduire à ce que l’on appelle l’effondrement du toit des canaux et des petites structures.</li>
	<li>Afin de renforcer l’adhérence, faites cuire la dernière puce de verre PDMS pendant 10 secondes à 80 °C.</li>
</ol>
3. Préparation de la culture bactérienne
Remarque : Toutes les cultures doivent être préparées dans un milieu filtré stérile pour éviter l’accumulation de particules indésirables, qui peuvent interférer pendant la culture.
<ol>
	<li>À l’aide d’une plaque de gélose contenant les organismes souhaités (ici, C. glutamicum ATCC 13032) et inoculer une colonie dans 20 ml de milieu BHI frais, incuber pendant une nuit (≈ 8 à 14 heures) à 30 °C sur un agitateur rotatif (120 tr/min).</li>
	<li>Transférez 10 μl de la préculture dans le milieu souhaité (ici CGXII21) qui sera utilisé lors de la culture microfluidique et laissez la cellule se développer pendant la nuit à 30 °C sur un agitateur rotatif (120 tr/min).</li>
	<li>Transférez la quantité souhaitée de suspension cellulaire (entre 10 et 500 μl, selon le début de l’expérience) dans le milieu souhaité (ici CGXII21) qui sera utilisé lors de la culture cellulaire microfluidique. Remarque : le mieux est d’utiliser des cellules de la phase logarithmique précoce pour l’ensemencement. Pour la culture de C. glutamicum, la meilleure densité optique (DO600) pour l’ensemencement était comprise entre 0,5 et 2.</li>
	<li>Transférez 1 ml de la culture bactérienne dans un tube stérile de 2 ml. Remarque : cela doit être fait juste après l’assemblage de la puce PDMS microfluidique afin de minimiser le temps de transfert entre le ballon agité et la culture microfluidique. En règle générale, le temps de transfert est d’environ 15 minutes et doit être aussi court que possible pour éviter l’impact sur le métabolisme causé par la limitation de l’oxygène et les changements de température.</li>
</ol>
4. Configuration expérimentale
Remarque : Toutes les étapes sont effectuées avec un microscope inversé.
<ol>
	<li>Démarrez l’incubateur de microscope 2 heures avant l’expérience pour réchauffer le système. Remarque : la microscopie doit être équipée d’un incubateur de taille normale pour contrôler la température et, si vous le souhaitez, le débit de gaz. Un contrôle supplémentaire de l’humidité n’est pas nécessaire car le système de puce est continuellement infusé de fluide.</li>
	<li>Ouvrez le système d’incubation, sélectionnez l’objectif souhaité et, si nécessaire, ajoutez de l’huile d’immersion sur l’objectif.</li>
	<li>Montez la puce à l’intérieur du porte-puce. Si nécessaire, fixez la plaque de verre avec du ruban adhésif afin d’éviter tout mouvement d’éclat pendant le fonctionnement de la scène.</li>
	<li>Centrez l’échantillon sur le microscope et concentrez-vous sur les réseaux PLBR.</li>
	<li>Raccordez les entrées et les sorties à l’aide d’un tube approprié (Figure 1F). Connectez le tube à un réservoir à déchets. Une puce représentative peut être vue sur la figure 4D.</li>
	<li>Insérez les seringues dans les pompes et démarrez le flux de fluide. Utilisez un milieu, un tampon ou si nécessaire une solution de revêtement et rincez les canaux microfluidiques pendant environ 1 h. Remarque : la solution de revêtement est utilisée pour revêtir les parois des canaux afin d’éviter l’adhérence cellulaire non spécifique.</li>
	<li>Pour E. coli, une solution à 0,1 % de BSA est utilisée pour revêtir les parois du canal. Pour C. glutamicum, aucun enrobage n’est nécessaire. Après la procédure de revêtement, rincez la puce avec du milieu avant l’ensemencement cellulaire.</li>
	<li>Avant l’ensemencement et la culture des cellules, vérifiez qu’il n’y a pas de fuite et que la température est constante.</li>
</ol>
5. Ensemencement de cellules bactériennes dans le dispositif microfluidique
<ol>
	<li>Assurez-vous que les solutions bactériennes souhaitées sont disponibles dans des seringues appropriées reliées à la tubulure.</li>
	<li>Déconnectez le tampon ou la solution de revêtement et connectez la suspension de cellule à la puce. Pour minimiser le volume de mort, les bulles d’air indésirables et pour réduire le temps d’expérience, changez l’aiguille complète ainsi que le tube, plutôt que seulement les seringues.</li>
	<li>Injecter la suspension cellulaire dans les canaux à un débit volumétrique de 200 nl/min jusqu’à ce que la plupart des PLBR soient remplis de la quantité souhaitée de cellules (Figure 5A). Remarque : les résultats optimaux de l’ensemencement dépendent de la souche bactérienne, OD600, et du milieu de croissance de la préculture. Ces paramètres doivent être adaptés pour augmenter l’efficacité et le temps de piégeage jusqu’à ce qu’un nombre suffisant de cellules soient piégées dans les structures du réacteur. Pour C. glutamicum, une suspension cellulaire deOD 600 0,5-2 a généralement été utilisée ; pour E. coli, la DO600 était comprise entre 0,5 et 1.</li>
	<li>Si seul un petit nombre de PLBR est rempli, augmentez le débit à 800-1 200 nl/min.</li>
	<li>Débranchez la suspension cellulaire et connectez le milieu de croissance à la puce (Figure 5B). Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est introduite lors du changement de fluide. Perfusion avec des milieux de croissance frais à 100 nl/min.</li>
</ol>
6. Imagerie en accéléré
<ol>
	<li>Sélectionnez des PLBR spécifiques pour l’imagerie en accéléré. En règle générale, on choisit des PLBR qui contiennent une seule cellule mère au début d’une expérience. Le nombre de régions d’intérêt pouvant être étudiées dans une expérience dépend de la fréquence d’images souhaitée et de la configuration microscopique.</li>
	<li>Sélectionnez une fréquence d’images appropriée en fonction du nombre de PLBR. Assurez-vous que le microscope peut gérer la quantité souhaitée de retours sur investissement dans l’intervalle de temps.</li>
	<li>Choisissez les jeux de filtres appropriés (ici YFP). Fermez automatiquement l’obturateur pendant le mouvement de la scène et après chaque mesure de time-lapse pour éviter le blanchiment des chromophores.</li>
	<li>Configurez la séquence de microscopie time-lapse et démarrez l’expérience.</li>
	<li>Une fois que tous les PLBR sont envahis par la végétation, l’expérience peut être arrêtée, la puce PDMS microfluidique peut être mise au rebut et l’expérience peut être évaluée.</li>
</ol>
7. Analyse
Remarque : Les étapes ou parties suivantes de la procédure peuvent être effectuées manuellement ou par des programmes d’analyse d’images tels que ImageJ, etc.
<ol>
	<li>Déterminez les PLBR d’intérêt où la culture remplit tous les critères souhaités, par exemple le nombre de cellules mères, la position des cellules mères, etc.</li>
	<li>Pour déterminer le taux de croissance d’une microcolonie, comptez le nombre de cellules dans chaque période de temps.</li>
	<li>Calculez le taux de croissance maximal en traçant le temps en fonction de ln (numéro de cellule). La pente du graphique représente le taux de croissance en [1/h] (voir Figure 6).</li>
	<li>L’analyse des données de fluorescence dépend fortement de l’expérience réalisée. Dans ce rapport, un exemple a été choisi pour illustrer l’hétérogénéité d’une colonie à l’autre et d’une cellule à l’autre entre différentes microcolonies isogéniques (voir la figure 7).</li>
</ol>

<ol><li>Muzzey, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Time-Lapse+Fluorescence+Microscopy+in+Single+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Single Cells.</a> Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 25, 301-327 (2009).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons décrit la fabrication, la configuration expérimentale et les procédures de fonctionnement associées d’un dispositif PDMS microfluidique contenant plusieurs (PLBR) pour l’analyse de bactéries sur cellule unique.
La microfabrication à l’aide de techniques de lithographie douce permet d’ajuster rapidement les dimensions de l’appareil pour différentes tailles et morphologies de bactéries. Actuellement, nous optimisons le bioréacteur picoliter en ce qui concerne la culture de différents organismes microbiens et le débit de culture. Afin d’augmenter l’efficacité du piégeage, la géométrie du réacteur est également en cours d’optimisation. La figure 8 montre quatre nouveaux dispositifs PLBR qui sont actuellement validés. Dans l’ensemble, le canal de semis a été redessiné en termes de largeur et de forme. En pratique, cela semble avoir un effet sur le nombre de cellules piégées, mais nécessite des investigations plus approfondies. Des améliorations significatives de l’efficacité du piégeage ont également été obtenues grâce à l’incorporation de canaux de débordement supplémentaires, ce qui a entraîné un débit de convection plus élevé à travers le réacteur et un plus grand nombre de cellules piégées. Cependant, en même temps, on augmente le risque de laver les cellules pendant la culture.
Le dispositif est une alternative intéressante aux cultures à l’échelle macroscopique qui sont utilisées depuis des décennies pour étudier les processus de croissance et de production au niveau de la cellule unique. Cependant, il a quelques exigences importantes : pour la surveillance parallèle de plusieurs bioréacteurs picolitres, une configuration microscopique haute résolution et entièrement motorisée avec compensation de la dérive de mise au point est obligatoire. De plus, un système d’incubation est nécessaire pour maintenir la température de culture souhaitée constante tout au long des mesures.
Nous atteignons un taux de réussite de 95 % dans la fabrication de dispositifs. Les principaux problèmes sont liés à un collage inefficace du verre PDMS, à l’effondrement du toit PDMS ou à des fuites de fluide (voir le tableau 1 pour le dépannage de la plupart des problèmes survenus). Bien que le travail expérimental soit effectué en partie dans des conditions non stériles, nous voyons rarement une contamination pendant les expériences, en raison du système fluidique fermé. Les dispositifs microfluidiques PDMS sont optiquement transparents, ce qui permet d’être utilisé pour l’imagerie in vivo à haute résolution. Bien que le PDMS semble être parfait pour l’application, il a une grande affinité pour les molécules hydrophobes, ce qui limite l’utilisation de solvants largement utilisés dans les processus biocatalytiques à cellules entières. Cependant, des revêtements appropriés sont disponibles pour adapter le protocole à ce type d’applications.
Le PLBR proposé est bien adapté à l’analyse spatio-temporelle des événements cellulaires et même subcellulaires de divers types de bactéries. Un avantage majeur de la présente approche réside dans la possibilité de quantifier directement la croissance des microcolonies par rapport aux méthodes conventionnelles. De plus, le PLBR permet l’élevage dans des conditions définies et constantes. Parce que le système facilite l’utilisation de petites quantités de réactifs ou de matériaux, il présente l’avantage d’être peu coûteux, personnalisable et adapté à un débit élevé. Dans les méthodes traditionnelles, les valeurs moyennes de l’ensemble de la population sont prises en compte lors de l’analyse de la culture microbienne. De plus, les méthodes existantes nécessitent un échantillonnage manuel, ce qui peut entraîner une dégradation des échantillons et donc des erreurs de mesure. Le PLBR offre de nouvelles perspectives pour le développement de bioprocédés et l’analyse de l’hétérogénéité des populations en microbiologie. Le PLBR est un outil prometteur pour diverses applications dans le développement de bioprocédés et pourrait être appliqué dans divers domaines de recherche, par exemple l’analyse de l’hétérogénéité entre cellules, l’analyse de grappes cellulaires spécifiques au sein de lignées cellulaires, le criblage de souches de production microbienne et l’étude en temps réel des phénotypes cellulaires.

La microscopie time-lapse est un outil puissant pour étudier les cellules vivantes in vivo1. Parallèlement, les plates-formes de microscopie entièrement automatisées disponibles dans le commerce, y compris la compensation de la dérive de focale induite thermiquement, sont couramment utilisées dans la recherche biologique pour étudier des phénomènes dépendants du temps, allant de la recherche sur le cancer et les cellules neuronales à l’ingénierie tissulaire et aux études dynamiques avec des cellules uniques de levure ou bactériennes2-6.
Généralement, des plaques transparentes, des tampons agaraux ou simplement des lames de microscopie sont utilisés pour fournir des environnements de culture cellulaire pendant l’imagerie en accéléré7. Même s’ils conviennent à certaines recherches, ces systèmes simples ont un contrôle très limité sur les conditions environnementales et ne permettent pas de perturbations plus complexes ou de changements de milieu bien définis et rapides. Des dispositifs à puce microfluidique jetables produits par production de masse ont été introduits sur le marché récemment, mais sont principalement adaptés aux types de cellules eucaryotes de plus grandetaille 4. Bien que la croissance puisse être suivie, des études de croissance bien définies concernant, par exemple, le piégeage précis des cellules, la taille de la colonie, la direction de la croissance et la capacité d’élimination des cellules sont limitées. Des habitats et des réacteurs microfluidiques, dans lesquels des cellules bactériennes sont cultivées dans des environnements 3D, ont été développés8 à 10, présentent des inconvénients lorsqu’il s’agit d’études quantitatives au niveau de la cellule unique. Bien que l’hétérogénéité globale de la population puisse être analysée, de nombreux paramètres cellulaires ne peuvent pas être déterminés avec précision avec une résolution unicellulaire, car la croissance n’est pas limitée aux monocouches.
Cette limitation a déclenché le développement de microsystèmes permettant la culture de cellules dans des canaux et des habitats bien définis, avec des cellules poussant en monocouches plates avec une résolution de cellule unique et un contrôle particulièrement strict de l’approvisionnement en milieux et des conditions environnementales6,11,12. Peu d’exemples de systèmes microfluidiques pour la culture de cellules bactériennes ont été démontrés12-14. Les bactéries présentent généralement des taux de croissance très rapides et nécessitent des structures microfluidiques de l’ordre de quelques micromètres et moins, en particulier lorsque des monocouches cellulaires sont souhaitées pour la microscopie. Keymer et al. a démontré la croissance et la propagation des souches d’E. coli dans des paysages microfabriqués15,16. Comme ils s’intéressaient à la dynamique des populations, ils n’ont pas étudié avec une résolution unicellulaire.
Nous avons développé le bioréacteur à picolitres (PLBR)13, qui est actuellement utilisé pour étudier divers indicateurs de performance biotechnologiques tels que la croissance17 et l’analyse de productivité couplée à la fluorescence au niveau18,19 de la cellule unique. Le dispositif microfluidique actuel permet le contrôle du réacteur environnemental à un volume de culture défini d’environ un picolitre et l’observation continue d’une seule cellule simultanément. Par rapport aux systèmes de caisson monocouche ouverts11,14, où un ou deux côtés sont ouverts au canal d’alimentation du fluide, le PLBR permet un piégeage et une culture contrôlés. La conception permet la culture à long terme de bactéries sans risque que plusieurs colonies adjacentes forment une grande population. De plus, le système intègre des régions de culture de 1 μm de hauteur (dans l’ordre du diamètre de la cellule) pour limiter la croissance des bactéries aux monocouches cellulaires. En revanche, les canaux d’alimentation sont 10 fois plus profonds pour minimiser la résistance hydraulique.
Par rapport aux systèmes de culture par lots miniaturisés20, le système actuel permet la culture avec des paramètres environnementaux constants grâce à un flux continu de fluides. De plus, les paramètres environnementaux tels que la composition du fluide, la température, les débits et les échanges gazeux peuvent être facilement contrôlés et modifiés en quelques secondes. Cela permet d’étudier spécifiquement la réponse cellulaire aux changements environnementaux, par exemple la disponibilité des nutriments ou les stimuli de stress. La demande de volumes de milieux réduits, à savoir de l’ordre de quelques microlitres seulement, permet aux chercheurs d’effectuer de nouvelles études, par exemple la perturbation des cellules lors de l’imagerie en accéléré avec un surnageant d’expériences à grande échelle démêlant la réponse cellulaire dans ces conditions environnementales spécifiques17. Le bioréacteur picoliter fournit aux chercheurs un système robuste qui contrôle étroitement les conditions biophysiques et fonctionne à l’aide de pousse-seringues de haute précision et d’une microscopie automatisée à fond clair et à fluorescence pour l’imagerie en accéléré. Ici, nous rapportons un protocole complet comprenant la conception et la fabrication de dispositifs et des applications exemplaires.

<table><tbody><tr><td>Plaquette de silicium de 100 mm de diamètre, P/BOR < 100></td><td>Si-MAT, Silicon Materials, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoresist SU-8 2000.5</td><td>Micro Resist Technology GmbH, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoresist SU-8 2010</td><td>Micro Resist Technology GmbH, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Développeur mr DEV- 600</td><td>Micro Resist Technology GmbH, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polydiméthylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone</td><td>Dow Corning ; Farnell GmbH, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles de distribution Embouts de précision&nbsp ; 27 G ; ID = 0,2 mm, OD = 0,42 mm</td><td>Nordson EFD Deutschland, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques de verre D263 T eco, 30 mm x 25 mm x 0,17 mm</td><td>Schott AG, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perforateur AKA 5130-B-90</td><td>Harris Uni-Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubing Tygon S-54-HL, ID = 0,25 mm, OD = 0,76 mm</td><td>Saint Gobain ; VWR International GmbH, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringues jetables &ndash ; Omnifix Spritzen BRAUN Omnifix 40 Duo, 1 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG, Allemagne</td><td>552-183143</td><td></td></tr><tr><td>Seringues, 1 ml Seringues stériles en verre</td><td>INNOVATIVE LABOR SYSTEME GMBH (ILS), Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Produits chimiques</td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull ; 7H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FeSO4&bull ; 7H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&bull ; H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&bull ; 7H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NiCl2&bull ; 6H2O</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide procatéchuique</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose-Monohydrate</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHI</td><td>Becton, Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cellules</td></tr><tr><td>Corynebacterium glutamicum ATTC 13032</td><td>DSMZ ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MG 1655</td><td>DSMZ ; Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Wafer Cleaner SSEC 3300</td><td>Solid State Equipment LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater SPIN150 -NPP</td><td>SPS Europe B.V.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aligneur de masque MA-6</td><td>Karl Suess</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hot Plate HP30A - 2</td><td>Torrey Pines</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scientific Four de laboratoire Memmert UN 200</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur de plasma FEMTO</td><td>Diener Electronics, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>neMESYS pousse-seringues</td><td>Cetoni GmbH, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitateur magnétique CB 162</td><td>Stuart</td><td>VWR 442-0304</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon Microscopie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope incubateur</td><td>Pecon GmbH, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse minispin plus " ligne noire"</td>Photomètre <td>9776501</td><td></td> <td>Eppendorf</td></tr><tr><td>BioPhotometer plus&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>6132000008</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur/incubateur de flacons agitateurs 3031</td><td>GFL - Gesellschaft f&uuml ; r Labortechnik mbH, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Profilomètre, Dektak 150 Stylus Profiler</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microfluidique picolitres bioréacteur pour analyse microbienne unicellulaire: fabrication, configuration du système, et l&#39;opération

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

Dans ce protocole, la fabrication, la configuration expérimentale et le fonctionnement de base du bioréacteur microfluidique à picolitres (PLBR) récemment introduit sont décrits en détail. Le PLBR peut être utilisé pour l’analyse de bactéries uniques et de microcolonies afin d’étudier des questions biotechnologiques et microbiologiques concernant, par exemple, la croissance cellulaire, la morphologie, la réponse au stress et la production de métabolites ou de protéines au niveau de la cellule unique. L’appareil dispose d’un flux de fluide continu permettant des conditions environnementales constantes pour les études de perturbation, mais permet en outre des changements rapides de fluide ainsi que des conditions oscillantes pour imiter toute situation environnementale souhaitée. Pour fabriquer les dispositifs à usage unique, une plaquette de silicium contenant des structures SU-8 de taille submicrométrique a servi de moule de réplication pour la coulée rapide de polydiméthylsiloxanes. Les puces ont été découpées, assemblées, connectées et installées sur un microscope haute résolution et entièrement automatisé adapté à l’imagerie en accéléré, un outil puissant pour l’analyse spatio-temporelle des cellules. Ici, l’organisme de la plate-forme biotechnologique Corynebacterium glutamicum a été ensemencé dans le PLBR et la croissance cellulaire et la fluorescence intracellulaire ont été suivies pendant plusieurs heures, démêlant l’hétérogénéité de la population dépendante du temps au niveau de la cellule unique, ce qui n’est pas possible avec les méthodes d’analyse conventionnelles telles que la cytométrie en flux. Outre les connaissances sur la fabrication de dispositifs, la préparation de la préculture, le chargement, le piégeage des bactéries et la culture PLBR de cellules uniques et de colonies sont démontrés. Ces appareils ajouteront une nouvelle dimension à la recherche microbiologique pour analyser les phénomènes dépendants du temps de bactéries uniques sous un contrôle environnemental strict. En raison de la simplicité et du processus de fabrication relativement court, la technologie peut être facilement adaptée dans n’importe quel laboratoire de microfluidique et simplement adaptée à des besoins spécifiques.

Dans ce protocole, la fabrication, la configuration et le fonctionnement de base d’un bioréacteur microfluidique à picolitres (PLBR) pour l’analyse unicellulaire de micro-organismes procaryotes sont introduits. Des micro-organismes pertinents pour l’industrie ont été analysés comme preuve de principe, ce qui a permis de mieux comprendre le taux de croissance, la morphologie et l’hétérogénéité phénotypique sur certaines périodes, ce qui est difficilement possible avec les méthodes conventionnelles.

Microfluidique picolitres bioréacteur pour Analyse microbienne unicellulaire: Fabrication, configuration du système, et l&#39;opération

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

L'objectif général de cette procédure est d'analyser des bactéries individuelles et des microcolonies isogéniques en évolution avec une résolution spatiale et temporelle complète dans des conditions environnementales constantes, à l'aide d'un dispositif de culture microfluidique. Cela est réalisé en concevant d'abord un système de culture microfluidique à l'aide d'un logiciel de CAO. Ensuite, des dispositifs jetables de culture microfluidique sont fabriqués en polydiméthylsiloxane et contiennent des bioréacteurs de l'ordre du picolitre, d'une hauteur d'un micron, afin de limiter la croissance bactérienne à une couche unique.La culture microbienne est ensuite introduite dans le dispositif microfluidique afin d'ensemencer des cellules mères individuelles à l'intérieur des bioréacteurs. Ces cellules sont développées par une perfusion continue de milieu de croissance à travers le système. Les résultats sont obtenus par microscopie automatisée en lapso-temporel, montrant la culture d'une souche industriellement pertinente de Corynebacterium glutamicum, les données de croissance et l'hétérogénéité entre les cellules.Dans la biotechnologie conventionnelle, la plupart des analyses reposent sur des données moyennes. Notre dispositif de microfluidique permet l'analyse de cellules uniques de bactéries individuelles avec une résolution spatiale et temporelle. C'est un outil utile pour examiner attentivement l'hétérogénéité entre cellules au sein de microcolonies isogéniques.Nous appliquons une photolithographie classique utilisant le SU-8 et un moulage de puce en polydiméthylsiloxane pour fabriquer des dispositifs microfluidiques jetables présentant une résolution des milieux submicrométrique. Nous avons démontré avec succès notre technologie à l’aide de plusieurs micro-organismes biotechnologiques, tels qu’Escherichia coli et Corynebacterium glutamicum. Pour commencer, concevez le dispositif microfluidique à l’aide d’un logiciel de CAO.Le design présenté dans ce protocole comprend deux entrées d'ensemencement, un générateur de gradient pour mélanger deux substrats différents, une sortie, et six réseaux composés chacun de cinq bioréacteurs. Dans une salle blanche, préparez une plaquette de silicium de quatre pouces et appliquez par rotation une couche d'un micron de résine photosensible SU-8 2000.5 sur la plaquette, comme décrit dans le protocole textuel accompagnant. Placez la plaquette recouverte sur une plaque chauffante à 95 degrés Celsius afin d'éliminer le solvant en excès, puis insérez le premier masque photolithographique, comprenant les régions de piégeage des réacteurs picolitre, ainsi que la plaquette recouverte, dans l'aligneur de masque.Ensuite, exposer la plaquette en mode contact sous vide à une lumière de 350 à 400 nanomètres pendant trois secondes à une intensité de sept milliwatts par centimètre carré. Réaliser une cuisson post-exposition sur une plaque chauffante plane à 95 degrés Celsius afin d'initier la polymérisation du SU-8. Puis, placer la plaquette dans un bain de révélateur SU-8 pendant une minute, puis transférer la plaquette dans un second récipient contenant du révélateur SU-8 frais pendant quelques secondes.Rincez la plaquette à l'isopropanol pour éliminer le révélateur SU-8 et séchez-la à l'aide d'un flux d'azote ou d'un essoreur à plaquettes. Ensuite, effectuez une cuisson dure de la plaquette pendant 10 minutes à 150 degrés Celsius. Puis, fabriquez la deuxième couche comme décrit dans le protocole textuel accompagnant afin de compléter le moule maître.Commencez la fabrication de la puce en PDMS en mélangeant la base et l'agent porteur dans un rapport de 10 à 1. Débarrassez le mélange de PDMS des bulles d'air pendant environ 30 minutes dans un dessiccateur sous vide, jusqu'à disparition complète des bulles. Ensuite, placez la plaquette en SU-8 dans un dispositif de moulage et versez une couche de trois millimètres de mélange de PDMS sur la plaquette.Ensuite, faire durcir le PDMS pendant trois heures à 80 degrés Celsius dans une étuve. Une fois refroidi, décoller délicatement la plaque de PDMS du wafer et découper la plaque en puces individuelles à l’aide d’un scalpel propre et bien aiguisé. Laver les puces dans un bain de n-pentane pendant 90 minutes, puis effectuer deux bains de lavage à l’acétone de 90 minutes chacun.Séchez les puces pendant la nuit pour éliminer tout résidu de solvant. Juste avant l'expérience, percez les orifices d'entrée et de sortie dans la puce en PDMS à l'aide d'une aiguille ou d'un poinçon ayant un diamètre légèrement inférieur à celui des connecteurs utilisés pour relier les tubulures à la puce en PDMS. Ensuite, nettoyez soigneusement la puce microfluidique en PDMS avec de l'isopropanol et utilisez du ruban adhésif transparent pour enlever les particules de poussière éventuellement accrochées.En outre, nettoyez une lame de verre fine de 170 microns d'abord avec de l'acétone, puis de l'isopropanol, suivis d'eau déionisée, et séchez la lame à l'aide d'un courant d'azote. Une fois propre et sèche, oxydez par plasma la lame de verre et la puce PDMS pendant 25 secondes en utilisant une puissance de 50 watts et un débit d'oxygène de 20 sccm. Ensuite, alignez soigneusement la puce PDMS et la lame de verre avant de poser le PDMS sur le verre, ce qui provoquera une liaison en quelques secondes.Fixez le lien en faisant cuire l'assemblage pendant 10 secondes à 80 degrés Celsius. Pour préparer les bactéries pour une expérience sur puce, inoculez une colonie unique d'une souche bactérienne choisie, telle que C.glutamicum, dans 20 millilitres de milieu BHI frais, puis incubez la culture toute la nuit à 30 degrés Celsius sur un agitateur rotatif à 120 tr/min. Le lendemain matin, transférez 10 microlitres de la culture initiale dans une seconde culture contenant 20 millilitres du milieu choisi et laissez les cellules croître toute la nuit dans les mêmes conditions.Le lendemain, préchauffer l'incubateur d'un microscope inversé à 30 degrés Celsius. Cela peut prendre jusqu'à deux heures selon le dispositif utilisé. Pendant que le dispositif atteint la température souhaitée, ouvrir l'incubateur, sélectionner l'objectif souhaité et le préparer avec tout milieu de montage nécessaire.Ensuite, montez la puce à l'intérieur du support de puce et fixez-la en place. Centrez l'échantillon sur le microscope et focalisez sur les réseaux de bioréacteurs picolitriques. Une fois la puce au point, reliez les entrées et sorties avec les tubulures appropriées, puis placez la tubulure de sortie dans un réservoir de déchets.Ensuite, remplissez une seringue avec du milieu frais, insérez-la dans une pompe à seringue et rincez les canaux microfluidiques pendant une heure à un débit de 200 nanolitres par minute afin d'amorcer la puce. Tandis que les cellules sont encore en phase exponentielle précoce de croissance, transférez un millilitre de la culture bactérienne dans une seringue stérile et remplacez la seringue et le tube contenant le milieu par la suspension cellulaire et un tube neuf. Injectez la suspension cellulaire dans les canaux à un débit volumétrique de 200 nanolitres par minute jusqu'à ce que la majorité des bioréacteurs picolitre soient remplis.Si un petit nombre de bioréacteurs sont remplis, augmentez le débit à 800 à 1200 nanolitres par minute. Lorsque la quantité souhaitée de cellules a été ensemencée, déconnectez la suspension cellulaire, reconnectez le milieu de croissance à la puce et perfusez avec un milieu frais à 100 nanolitres par minute. Ensuite, analysez la puce et sélectionnez des bioréacteurs spécifiques pour l'acquisition d'images en lapse de temps.Ensuite, configurez une séquence de microscopie en time-lapse afin d'imaginer les bioréacteurs du début à la fin et de démarrer l'expérience. Une fois que tous les bioréacteurs de l'ordre du picolitre sont surcroîtés, arrêtez l'expérience et éliminez les puces de manière appropriée. Pour commencer l'analyse, déterminez d'abord quels bioréacteurs remplissent tous les critères souhaités pour l'expérience, tels que le nombre et la position des cellules mères.À l'aide d'un programme d'analyse, tel qu'ImageJ, déterminez la vitesse de croissance de chaque microcolonne en comptant le nombre de cellules à chaque point temporel. Calculez la vitesse maximale de croissance en traçant le temps en fonction du logarithme du nombre de cellules. Le système présenté ici peut être appliqué à l'étude de diverses espèces bactériennes en fonction de différents paramètres biologiques tels que la croissance, la morphologie ou un signal fluorescent.Dans cet exemple, C.glutamicum a été cultivé dans des conditions standard de culture, et les courbes de croissance obtenues à partir de trois microcolonies isogéniques sont présentées ici. Les bioréacteurs de volume picolitre se sont également révélés utiles pour l'analyse de la production protéique au moyen de la microscopie à fluorescence en prise de vue différée, comme illustré ici. En exposant les cellules à une faible concentration de l'inducteur protéique IPTG, les variations de la protéine d'une cellule à l'autre peuvent être étudiées au niveau individuel, au sein de colonies issues d'une seule cellule mère.La technique démontrée peut être appliquée pour surveiller et analyser des cellules bactériennes individuelles avec un contrôle environnemental parfait. Cela est difficilement réalisable à l’aide de systèmes conventionnels de culture à l’échelle du laboratoire. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des puces de culture microfluidiques afin d’effectuer des analyses comparables au niveau de la cellule unique.

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Microfluidique picolitres bioréacteur pour Analyse microbienne unicellulaire: Fabrication, configuration du système, et lopération (Vidéo) | JoVE Journal

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