Microfluidique picolitres bioréacteur pour Analyse microbienne unicellulaire: Fabrication, configuration du système, et l'opération

L’objectif global de cette procédure est d’analyser des bactéries uniques et des microcolonies isogéniques en évolution avec une résolution spatiale et temporelle complète dans des conditions environnementales constantes à l’aide d’un dispositif de culture microfluidique. Pour ce faire, il faut d’abord concevoir un système de culture microfluidique à l’aide d’un logiciel de CAO. Ensuite, des dispositifs de culture microfluidique jetables sont fabriqués à partir de polydiméthylsiloxane qui contiennent des bioréacteurs picolitres, d’un micron et d’une hauteur pour limiter la croissance des bactéries à une monocouche.

La culture microbienne est ensuite infusée dans le dispositif microfluidique pour inoculer des cellules mères uniques dans les bioréacteurs. Ces cellules sont dilatées par infusion continue de milieu de croissance à travers le système. Les résultats sont obtenus à partir d’une microscopie accélérée automatisée montrant la culture d’une souche de Corynebacterium glutamicum pertinente pour l’industrie, les données de croissance et l’hétérogénéité cellule-cellule.

En biotechnologie conventionnelle, la plupart des analyses sont basées sur des données moyennes. Notre dispositif microfluidique facilite l’analyse de cellules uniques de bactéries individuelles avec une résolution spatiale et temporelle. C’est un outil utile pour examiner de près l’hétérogénéité cellulaire des microcolonies isogéniques.

Nous appliquons la photolithographie SU-8 et le moulage de puces de polydiméthylsiloxane pour fabriquer des dispositifs microfluidiques à usage unique avec une résolution sub micro media. Nous avons démontré avec succès notre technologie avec plusieurs micro-organismes biotechniques tels que Escherichia coli et Corynebacterium glutamicum. Pour commencer, concevez le dispositif microfluidique à l’aide d’un logiciel de CAO.

La conception présentée dans ce protocole se compose de deux entrées d’ensemencement, d’un générateur de gradient pour mélanger deux substrats différents, d’une sortie et de six réseaux composés de cinq bioréacteurs chacun. Dans une salle blanche, préparez une plaquette de silicium de quatre pouces et appliquez un code de spin d’un micron de résine photosensible SU-8 2000.5 sur la plaquette, comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Placez la plaquette revêtue sur une plaque chauffante à 95 °C pour chasser l’excès de solvant, puis insérez le masque photo de première couche composé des régions de piégeage des réacteurs picolitres et de la plaquette revêtue à l’intérieur de l’aligneur de masque.

Ensuite, exposez la plaquette en mode de contact sous vide à une lumière de 350 à 400 nanomètres pendant trois secondes à une intensité de sept milliwatts par centimètre carré. Effectuez une cuisson post-exposition sur une plaque chauffante à 95 degrés Celsius pour initier la polymérisation du SU-8. Ensuite, placez la plaquette dans un bain de révélateur SU-8 pendant une minute, puis transférez la plaquette dans un deuxième récipient avec un révélateur SU-8 frais pendant quelques secondes.

Rincez la plaquette à l’isopropanol pour éliminer le révélateur SU-8 et séchez la plaquette à l’aide d’un flux d’azote ou d’une essoreuse de plaquette. Ensuite, faites cuire la gaufrette pendant 10 minutes à 150 degrés Celsius. Ensuite, fabriquez la deuxième couche comme décrit dans le protocole de texte ci-joint afin de terminer le moule maître.

Commencez la fabrication de la puce PDMS en mélangeant la base et l’agent porteur dans un rapport de 10 pour un. Dégazez le mélange PDMS pendant environ 30 minutes à l’intérieur d’un dessiccateur sous vide jusqu’à ce que toutes les bulles aient disparu. Ensuite, placez la plaquette SU-8 dans un dispositif de moulage et versez une couche de trois millimètres de mélange PDMS sur la plaquette.

Ensuite, faites cuire le PDMS pendant trois heures à 80 degrés Celsius dans un four. Une fois refroidie, décollez soigneusement la plaque PDMS de la plaquette et coupez la plaque en copeaux simples à l’aide d’un scalpel propre et tranchant. Lavez les copeaux dans un bain de n-pentane pendant 90 minutes, suivi de deux bains de lavage à l’acétone pendant 90 minutes chacun.

Séchez les copeaux pendant la nuit pour éliminer tout résidu de solvant. Juste avant l’expérience, percez les trous d’entrée et de sortie dans la puce PDMS à l’aide d’une aiguille ou d’une perforatrice d’un diamètre légèrement inférieur à celui des connecteurs utilisés pour connecter les tubes avec la puce PDMS. Ensuite, nettoyez soigneusement la puce PDMS microfluidique avec de l’isopropanol et utilisez du scotch pour enlever toutes les particules de poussière collantes.

De plus, nettoyez d’abord une lame de verre mince de 170 microns avec de l’acétone, puis de l’isopropanol, puis de l’eau désionisée, et séchez la lame avec un jet d’azote. Une fois propre et sec, le plasma oxyde la lame de verre et de la puce PDMS pendant 25 secondes en utilisant une puissance de 50 Watts et un débit d’oxygène de 20 sccm. Ensuite, alignez soigneusement le PDMS et la puce de verre avant de placer le PDMS sur le verre, ce qui le fera se coller en quelques secondes.

Fixez le lien en cuisant la configuration pendant 10 secondes à 80 degrés Celsius. Pour préparer les bactéries à une expérience de puce, inoculez une seule colonie d’une souche bactérienne souhaitée, telle que C. glutamicum, dans 20 millilitres de milieu BHI frais, et incubez la culture pendant la nuit à 30 degrés Celsius sur un agitateur rotatif à 120 tr/min. Le lendemain matin, transférez 10 microlitres de la culture de démarrage dans une deuxième culture contenant 20 millilitres du milieu souhaité et laissez les cellules se développer pendant la nuit dans les mêmes conditions.

Le lendemain, préchauffez l’incubateur d’un microscope inversé à 30 degrés Celsius. Cela peut prendre jusqu’à deux heures selon la configuration individuelle. Pendant que l’installation se réchauffe, ouvrez l’incubateur et sélectionnez l’objectif souhaité et préparez-le avec n’importe quel support de montage requis.

Ensuite, montez la puce à l’intérieur du porte-puce et fixez-la en place. Centrez l’échantillon sur le microscope et concentrez-vous sur les réseaux de bioréacteurs picolitres. Avec la puce en place, connectez les entrées et les sorties avec un tube approprié, puis placez le tube de sortie dans un réservoir à déchets.

Ensuite, remplissez une seringue d’un produit frais, placez-la dans une pompe à seringue et rincez les canaux microfluidiques pendant une heure à un débit de 200 nanolitres par minute pour amorcer la puce. Alors que les cellules sont encore au début de la phase de croissance exponentielle, transférez un millilitre de la culture bactérienne dans une seringue stérile et remplacez la seringue et le tube contenant le milieu par la suspension cellulaire et le tube frais. Infuser la suspension cellulaire dans les canaux à un débit volumétrique de 200 nanolitres par minute jusqu’à ce que la plupart des bioréacteurs picolitres soient remplis.

Si seul un petit nombre de bioréacteurs est rempli, augmentez le débit à 800 à 1200 nanolitres par minute. Lorsque la quantité souhaitée de cellules a été ensemencée, débranchez la suspension cellulaire, reconnectez le milieu de croissance à la puce et perfuser avec un milieu frais à 100 nanolitres par minute. Ensuite, scannez la puce et sélectionnez des bioréacteurs spécifiques pour l’imagerie en accéléré.

Ensuite, configurez une séquence de microscopie time-lapse afin d’imager les bioréacteurs du début à la fin et de commencer l’expérience. Une fois que tous les bioréacteurs picolitres sont envahis par la végétation, arrêtez l’expérience et jetez les puces de manière appropriée. Pour commencer l’analyse, déterminez d’abord quels bioréacteurs remplissent tous les critères souhaités pour l’expérience, tels que le nombre et la position des cellules mères.

À l’aide d’un programme d’analyse, tel que l’image J, déterminez le taux de croissance de chaque microcolonie en comptant le nombre de cellules à chaque point temporel. Calculez le taux de croissance maximal en traçant le temps en fonction du logarithme du nombre de cellules. Le système présenté ici peut être appliqué à l’étude de diverses espèces bactériennes par rapport à différents paramètres biologiques tels que la croissance, la morphologie ou un signal fluorescent.

Dans cet exemple, C. glutamicum a été cultivé dans des conditions de culture standard et les courbes de croissance résultantes dérivées de trois microcolonies isogéniques sont illustrées ici. Les bioréacteurs à picolitres se sont également avérés utiles pour accéder à la production de protéines grâce à l’utilisation de la microscopie à fluorescence à intervalle de temps, comme illustré ici. En exposant les cellules à une faible concentration de l’inducteur protéique IPTG, les variations de cellule à cellule de la protéine peuvent être étudiées au niveau de la cellule unique au sein des colonies à partir d’une seule cellule mère.

La technique démontrée peut être appliquée pour surveiller et analyser des cellules bactériennes uniques avec un contrôle parfait de l’environnement. Cela n’est guère possible avec les systèmes de culture conventionnels à l’échelle de laboratoire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des puces de culture microfluidique pour effectuer des analyses de cellules uniques comparables.