Name: Génération d’un nouveau vaccin à cellules dendritiques utilisant des cellules souches de mélanome et de cancer malpighien (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Découvrez la génération d'un vaccin à cellules dendritiques basé sur des cellules souches cancéreuses pour l'immunothérapie antitumorale. Cette méthode améliore la réponse immunitaire comparée aux vaccins traditionnels.

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Ce travail a été soutenu par le Will and Jeanne Caldwell Endowed Research Fund du Comprehensive Cancer Center de l’Université du Michigan et en partie par la subvention CA82529 des NIH et la Gillson Longenbaugh Foundation.

1. Coloration ALDEFLUOR
<ol><li>Préparation d’échantillons cellulaires: Préparez une suspension unicellulaire de cellules tumorales, soit à partir de cellules tumorales cultivées, soit à partir d’échantillons tumoraux fraîchement récoltés. Comptez les cellules et ajustez la suspension cellulaire à une concentration de 1 x 106 cellules/ml dans aldefluor assay buffer.</li>
	<li>Étiqueter quatre tubes à essai en polystyrène de 12 mm x 75 mm comme tubes de commande comme suit : #1 : Non coloré, #2 : ALDEFLUOR, #3 : ALDEFLUOR plus DEAB et #4 : 7AAD.</li>
	<li>Pour ces tubes de commande, placez 1 ml de suspension cellulaire dans #1 et #4, mais 2 ml dans le tube #2. Ajouter 5 μl de DEAB (inhibiteur de l’ALDH) dans le tube #3 et garder sur la glace. Ajoutez ensuite 10 μl de substrat ALDEFLUOR activé sur le tube #2, mélangez et transférez immédiatement 1 ml du mélange sur le tube #3.</li>
	<li>Dans le même temps, ajoutez 2 μl de substrat ALDEFLUOR activé par million de cellules au reste des cellules (tubes d’échantillon) également à 1 x 106 cellules / ml dans le tampon d’analyse ALDEFLUOR.</li>
	<li>Incuber à la fois les 4 tubes de commande et les tubes d’échantillonnage pendant 30 min au bain-marie à 37 °C.</li>
	<li>Après incubation, ajouter 5 μl 7AAD dans le tube témoin #4 et 1 μl 7AAD 1 x 106 cellules au tube de l’échantillon. Incuber 10 min à 4 °C.</li>
	<li>Centrifuger tous les tubes pendant 5 min à 250 x g et enlever le surnageant.</li>
	<li>Ressusciter les cellules dans le tampon d’analyse ALDEFLUOR.</li>
	<li>Effectuez un tri basé sur la cytométrie de flux.</li>
	<li>Définissez les portes de tri à l’aide de cellules colorées par ALDEFLUOR traitées avec deAB comme témoin négatif et des cellules colorées à l’iodure de propidium (PI) 7AAD pour le contrôle de la viabilité. Basé sur ces contrôles, une porte a été établie pour distinguer les cellules aldefluor+/ALDHélevées,D5 et SCC7. Ces portes seront ensuite utilisées pour trier toutes les cellules d’échantillon préparées ci-dessus pour les cellules ALDEFLUOR+/ALDHhaute D5 et SCC7.</li>
</ol>2. Préparation du vaccin à cellules dendritiques à impulsions de lysat de cellules souches cancéreuses (CSC-TPDC)
<ol><li>Euthanasier des souris (syngénétique B6 et C3H, respectivement) en utilisant du CO2 et isoler les os du fémur et du tibia.</li>
	<li>Mettez les os dans de l’éthanol à 75% pendant 1 min à température ambiante. Ensuite, lavez les os à l’aide de HBSS.</li>
	<li>Coupez la tête des os et utilisez une aiguille de 21 G et une seringue de 10 ml pour pousser les cellules dans une boîte.</li>
	<li>Aspirer et souffler les cellules à l’aide de la seringue pour faire la suspension à cellule unique.</li>
	<li>Après centrifugation à 1 500 tr/min pendant 5 min, jetez le surnageant. Ajoutez ensuite 5 ml de tampon de lyse RBC à la lyse du GLOBULE ROUGE pendant 1 min au bain-marie à 37 °C.</li>
	<li>Comptez le nombre de cellules et ajustez la suspension cellulaire à une concentration de 1 million de cellules/ml en milieu complet (CM) contenant 10 ng/ml GM-CSF et 10 ng/ml IL-4.</li>
	<li>Culturez les cellules et compensez cm plus IL-4 et GM-CSF 3 jours plus tard.</li>
	<li>Au 5e jour, récolter les cellules dendritiques immatures (DC) et préparer le milieu d’isolement DC contenant 4,2 ml de solution C plus 1 ml de milieu gradient de densité OptiPrep.</li>
	<li>Suspendre les pastilles cellulaires dans 5 ml CM. Ajouter lentement la suspension cellulaire sur le milieu d’isolement. Centrifuger à 2 000 tr/min à température ambiante.</li>
	<li>Collectez les DCs entre le CM et le support d’isolation. Comptez le nombre de cellules et ajustez la suspension cellulaire à une concentration de 1 million de cellules/ml dans un milieu de culture contenant 10 ng/ml gm-CSF et 10 ng/ml IL-4.</li>
	<li>Préparer des lysats tumoraux en suspendant des cellules D5 ou SCC7aldh élevées ou non triées dans un milieu de culture et soumises à des expositions rapides au gel-dégel quatre fois suivies d’une rotation à ∼100 x g pendant 5 min pour recueillir la partie membranaire des lysats.</li>
	<li>Pour préparer CSC-TPDC, pulsez les DC avec le lysat des cellulesélevées autologues d’ALDH. Pour préparer H-TPDC, pulsez les DCs avec le lysat hétérogène non trié de cellules de tumeur. Le rapport de DC au lysat de cellules de tumeur est le même.</li>
</ol>3. Vaccination et évaluation de l’efficacité
<ol><li>Vacciner les souris B6 normales respectivement avec 2 500 cellules tumorales D5 CSC-TPDC ou D5 H-TPDC par voie sous-cutanée (s.c.). Vacciner les animaux C3H normaux s.c. avec 5 000 cellules tumorales SCC7 CSC-TPDC ou SCC7 H-TPDC, respectivement.</li>
	<li>Après la vaccination, défiez les souris B6 avec les cellules tumorales hétérogènes D5 i.v. Euthanasier les souris en utilisant le CO2 20 jours plus tard. Récoltez les poumons et énumérez les métastases pulmonaires.</li>
	<li>Dans le modèle SCC7, défiez les souris C3H avec des cellules tumorales SCC7 non triées s.c du côté opposé du vaccin DC. Surveillez la taille de la tumeur.</li>
	<li>A la fin des expériences euthanasier les souris B6 et C3H en utilisant du CO2. Au jour 34 après le premier vaccin, euthanasier les souris avec du CO2, et en même temps recueillir la rate de chaque groupe avec une procédure aseptique.</li>
	<li>Activer les cellules T et/ou B de rate avec des mAbs anti-CD3 et anti-CD28 immobilisés dans le CM contenant hrIL-2 ou LPS plus l’ascite anti-CD40 (FGK45) mAb.</li>
	<li>Après l’activation, recueillir des surnageants et l’utiliser pour le test ELISA.</li>
	<li>Pour le test ELISA, enrober les plaques d’anticorps pour IFNγ, GM-CSF et IgG à 4 °C O/N.</li>
	<li>Après l’application du tampon de blocage, ajoutez des échantillons et des étalons et incuber à température ambiante.</li>
	<li>Lavez la plaque et ajoutez des anticorps de détection HRP et un substrat TMB pour l’incubation.</li>
	<li>Mesurer l’absorbance sur un lecteur de plaque ELISA à 450 nm dans les 30 minutes après l’arrêt de la réaction.</li>
</ol>

<ol><li>Shafee, N., Smith, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+contribute+to+cisplatin+resistance+in+Brca1%2Fp53-mediated+mouse+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors.</a> Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).</li>
<li>Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+radiation+enhances+survivin-mediated+virotherapy+against+malignant+glioma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells.</a> Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).</li>
<li>Dallas, N. A., Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoresistant+colorectal+cancer+cells%2C+the+cancer+stem+cell+phenotype%2C+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).</li>
<li>Yamauchi, K., Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cancer+metastasis+by+cyclophosphamide+pretreatment+of+host+mice%3A+an+opposite+effect+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy.</a> Cancer Res. 68, 516-520 (2008).</li>
<li>Chang, A. E., Redman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+trial+of+tumor+lysate-pulsed+dendritic+cells+in+the+treatment+of+advanced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer.</a> Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).</li>
<li>Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CD137+monoclonal+antibody+administration+augments+the+antitumor+efficacy+of+dendritic+cell-based+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines.</a> Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).</li>
<li>Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dependent+antitumor+immunity+mediated+by+secondary+lymphoid+tissue+chemokine%3A+augmentation+of+dendritic+cell-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy.</a> Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).</li>
<li>Ning, N., Pan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+vaccination+confers+significant+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity.</a> Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).</li>
<li>Ginestier, C., Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR1+blockade+selectively+targets+human+breast+cancer+stem+cells+in+vitro+and+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts.</a> J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).</li>
<li>Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase-expressing+colon+stem+cells+contribute+to+tumorigenesis+in+the+transition+from+colitis+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer.</a> Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).</li>
<li>Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).</li>
</ol>

STEMCELL Technologies a soutenu les frais de publication en libre accès.

Les hôtes immunodéprimés, tels que les souris SCID, empêchent les évaluations immunologiques des CSC en raison du manque d’immunité adaptative chez les hôtes. Dans cette étude, nous avons évalué l’immunogénicité de CSCs dans les centres serveurs immunocompetent, qui pourraient plus étroitement imiter des arrangements patients. Les CSC enrichis sont immunogènes et pourraient induire une immunité protectrice tumorale plus efficace lorsque leurs lysats sont chargés dans les CD en tant que vaccin par rapport aux CD lysat-pulsés de cellules tumorales non sélectionnés.  Mécaniquement, la protection a été conférée par l’induction sélective d’anticorps csc-réactifs et de cellules T8 ainsi que la production de cytokines de type 1, par exemple IFNγ et GM-CSF.
La plupart des immunothérapies actuelles, y compris les vaccins à base de cellules dendritiques et le transfert de lymphocytes T adoptifs, sont conçues pour cibler les antigènes différenciés par tumeur. Les CSC, qui peuvent ne pas exprimer ces antigènes différenciés, peuvent donc échapper à ces ciblages immunologiques. En revanche, le vaccin CSC conçu pour cibler spécifiquement les cellules souches cancéreuses peut détruire cette population spéciale de cellules cancéreuses et ainsi améliorer l’efficacité thérapeutique du vaccin en prévenant la rechute tumorale et les métastases.
Dans les cellules cultivées de tumeur et les tumeurs fraîchement moissonnes, nous avons identifié la population CSC-enrichie par l’écoulement cytometry basé sur l’activité élevée de déshydrogénase d’aldéhyde. De telles cellulesélevées d’ALDH pourraient être isolées par tri de flux pour être utilisées comme source d’antigènes pour pulser DC pour générer des CSC-TPDC. La comparaison utilisant des cellulesélevées d’ALDH isolées à partir de cellules tumorales cultivées par rapport à des tumeurs fraîchement récoltées n’a démontré aucune différence significative dans le terme de l’induction de l’immunité anti-CSC8. Ces résultats ont indiqué le potentiel d’employer CSCs d’isolement dans les cellules cultivées de tumeur ou des tumeurs fraîchement moissonnes pour l’application clinique.
Pour être cliniquement pertinent, un vaccin doit être examiné dans un contexte thérapeutique. Ces expériences sont maintenant réalisées dans notre laboratoire.

Les cellules souches cancéreuses sont relativement résistantes à la chimiothérapie et à la radiothérapie conventionnelles1,2. D’autre part, cette population de cellules pourrait être les cellules responsables de la rechute et de la progression des cancers après les thérapies anticancéreuses traditionnelles1-4. En raison du manque d’expression des antigènes tumoraux différenciés sur les cellules souches cancéreuses, les cellules souches cancéreuses peuvent échapper aux interventions immunologiques actuelles de la thérapie contre le cancer, qui sont principalement conçues pour cibler les antigènes sur les cellules tumorales différenciées. Par conséquent, l’élaboration de nouvelles stratégies ciblant et détruisant spécifiquement les cellules souches cancéreuses pourrait promettre d’accroître l’efficacité thérapeutique du traitement actuel du cancer. À cette fin, nous avons isolé des populations enrichies de cellules souches cancéreuses (CSC) de deux tumeurs animales (mélanome D5 et cancer épidermoïde SCC7), et nous les avons utilisées comme source d’antigène pour pulser les cellules présentatrices d’antigènes (cellules dendritiques, DC) pour préparer le vaccin CSC-TPDC. Nous avons ensuite évalué l’immunité antitumorale induite par le vaccin CSC-TPDC chez les hôtes immunocompétents syngéniques, les souris B6 et les souris C3H respectivement. L’efficacité antitumorale induite par CSC-TPDC a été comparée au vaccin DC traditionnel pulsé avec du lysat provenant de cellules tumorales hétérogènes non triées (H-TPDC), qui a déjà été utilisé par notre groupe5,6, ainsi que par d’autres chercheurs7 à la fois dans des études précliniques et dans des essais cliniques.

<table><tbody><tr><td>ALDHEFLOUR KIT</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>Murin IL-4</td><td>Pepro Tech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>Murin GM-CSF</td><td>Pepro Tech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>Souris GM-CSF ELISA KIT</td><td>BD Biosciences</td><td>555167</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Gradient de densité Moyen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>BD OptEIA TMB Réactif de substrat Set</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Équipement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>336834</td><td></td></tr><tr><td>Kcjunior</td><td>Bio-Tek Instruments</td><td>176058</td><td></td></tr></tbody></table>

génération d’un nouveau vaccin à cellules dendritiques utilisant des cellules souches de mélanome et de cancer malpighien

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Nous avons identifié des populations enrichies de cellules souches cancéreuses (CSC) du mélanome murin D5 syngénéique à des souris C57BL/6 et du cancer squameux SCC7 syngénéique aux souris C3H en utilisant ALDEFLUOR/ALDH comme marqueur, et testé leur immunogénicité en utilisant le lysat cellulaire comme source d’antigènes aux cellules dendritiques de pouls (DCs). DCs pulsé avec des lysatsélevés d’ALDH CSC induit une immunité antitumorale protectrice sensiblement plus élevée que le DCs pulsé avec les lysats des lysats entiers non triés de cellules de tumeur dans les deux modèles et dans un arrangement de métastase de poumon et un s.c. arrangement de croissance de tumeur, respectivement. Ce phénomène était attribuable aux réactions humorales et cellulaires anti-SCC induites par le vaccin du SCC. En particulier, les splénocytes isolés de l’hôte soumis au vaccin CSC-DC ont produit une quantité significativement plus élevée d’IFNγ et de GM-CSF que les splénocytes isolés de l’hôte soumis au vaccin lysat de cellules tumorales non triés pulsé-DC. Ces résultats appuient les efforts visant à mettre au point un vaccin thérapeutique autologue à base de CSC à usage clinique en milieu adjuvant.

ALDEFLUOR/ALDH a été utilisé comme marqueur unique pour isoler les cellules souches dans de multiples tumeurs malignes8-11. Nous avons identifié des populations enrichies de cellules souches cancéreuses dans deux modèles tumoraux D5 et SCC7 en utilisant ALDEFLUOR comme marqueur. Nous avons détecté les cellules d’ALDEFLUOR+ dans le mélanome murin B16-D5 et le cancer de cellules squamous SCC7. Nous avons constaté que les cellules ALDEFLUOR+ contribuent à environ 0,5% et 5,2% dans les lignées cellulaires tumorales D5 et SCC7 cultivées, respectivement (Figure 1). Des cellules fraîchement récoltées de tumeur des tumeurs établies ont été analysées pour confirmer l’existence des cellules d’ALDEFLUOR+. Comme le montre également la figure 1,il y avait 2,5% et 4,2% des cellules ALDEFLUOR+ provenant de tumeurs D5 et SCC7 établies in vivo, respectivement. La tumorigénicité et la capacité d’auto-renouvellement de ces populationsélevées triées D5 et SCC7 ALDEFLUOR+/ALDH ont été évaluées chez l’hôte immunocompétent syngénéique, les souris C57BL/6 et C3H, respectivement8.
Nous avons utilisé le lysat hétérogène de cellules tumorales non triées pour pulser les DCs (H-TPDC) à la fois dans les études animales et dans les essais cliniques5,6. Pour examiner l’immunogénicité des CSC, nous avons isolé le CSCélevé d’ALDH et pulsé le DC avec le lysat des CSC pour générer le CSC-TPDC (figure 2) et avons employé H-TPDC comme contrôle conventionnel de vaccin contre le cancer pour tester si CSC-TPDC a n’importe quel effet bénéfique en empêchant la croissance de tumeur.
Nous avons évalué l’immunogénicité de CSCs en examinant l’immunité antitumorale protectrice induite par CSC-TPDC. Dans le modèle D5, des souris immunocompétentes naïves ont été vaccinées s.c avec CSC-TPDC ou H-TPDC (au même rapport lysat: DC). Les groupes témoins ont reçu une solution saline (PBS). Une semaine après le dernier vaccin, les souris ont été contestées avec des cellules non triées de tumeur D5 intraveineusement(i.v.),et les poumons ont été moissés 3 semaines plus tard pour énumérer des métastases de poumon. Comme le montre le tableau 1,comparativement au groupe PBS, les souris traitées avec le H-TPDC ont développé moins de métastases pulmonaires. Il est important de noter que les souris traitées par CSC-TPDC présentaient significativement moins de métastases pulmonaires que le groupe vaccinal H-TPDC dans les deux expériences réalisées. Dans le modèle SCC7, les animaux C3H normaux ont été vaccinés s.c avec SCC7 CSC-TPDC ou H-TPDC respectivement sur le flanc droit, suivis de défier avec les cellules non triées de tumeur SCC7 s.c dans le flanc gauche. Comparé au groupe de PBS, H-TPDC a induit l’immunité anti-tumorale modeste contre la croissance de tumeur. Cependant, il y avait une inhibition significative de la croissance tumorale chez les souris qui ont été traitées avec CSC-TPDC par rapport au groupe témoin et au groupe H-TPDC (p<0,05, figure 3). Ces résultats indiquent que CSCs pourrait être employé comme source plus efficace d’antigène pour charger des DCs que les cellules non triées traditionnelles de tumeur en induisant l’immunité protectrice contre le défi des cellules de tumeur.
Pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à l’immunité antitumorale protectrice causée par CSC observée, nous avons récolté la rate des animaux soumis aux vaccinations de DC à la fin des expériences. Les cellules de rate ont été alors activées par anti-CD3/CD28/IL-2 ou anti-CD3/CD28/IL-2 + LPS/anti-CD40. Ensuite, les surnageants de culture ont été collectés pour détecter l’expression des cytokines et des anticorps.  Les productions d’IFNγ et de GM-CSF par les cellules de la rate ont été significativement plus élevées chez les animaux vaccinés avec D5 CSC-TPDC ou SCC7 CSC-TPDC (Figure 4). En outre, il y avait significativement (p<0,05) production plus élevée d’IgG par les cellules de rate activées par LPS/anti-CD40 recueillies chez les animaux vaccinés avec D5 CSC-TPDC ou SCC7 CSC-TPDC par rapport à D5 H-TPDC ou SCC7 H-TPDC. Ces anticorps se sont avérés pour se lier à D5 et SCC7 CSCCS respectivement, et une telle liaison pourrait avoir comme conséquence la lyse CSC en présence du complément8.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1.jpg"> Figure 1. Des populationsélevées d’ALDHFLUOR+/ALDH ont été détectées dans cultivée aussi bien que le mélanome murin frais nouvellement récolté D5 et les tumeurs squamous SCC7 de cellules. Des cellules de tumeur traitées avec 50 mmol/L DEAB, un inhibiteur spécifique d’ALDH, ont été employées comme commande négative.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2.jpg"> Figure 2. Génération de vaccins à base de cellules souches cancéreuses à base de cellules dendritiques. Pour la préparation de CSC-TPDC et de H-TPDC, des cellules dendritiques moelle-dérivées ont été pulsées avec des lysatsélevés ou non triés de cellules de tumeur d’ALDH, respectivement.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a> 
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3.jpg"> Figure 3. Le vaccin CSC-TPDC (CSC-TPDC) lysat pulsé pourrait induire une immunité antitumorale protectrice plus efficace dans le s.c. Modèle de tumeur SCC7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a> 

<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4.jpg"> Figure 4. Réponses cellulaires systémiques plus puissantes chez l’hôte immunocompétent vacciné par CSC-TPDC.  Des splénocytes ont été récoltés à partir des animaux soumis à la vaccination H-TPDC ou CSC-TPDC, et ont été activés comme indiqué. Les surnageants de culture ont ensuite été collectés pour la détection des cytokines à l’aide d’ELISA.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l’image.</a>

Évalué chez des hôtes immunocompétents syngéniques, le vaccin à base de cellules dendritiques (DC) à base de cellules souches cancéreuses (CSC) a démontré une immunité antitumorale significativement plus élevée que les vaccins DC traditionnels pulsés avec des cellules tumorales en vrac hétérogènes.

Génération d’un nouveau vaccin à cellules dendritiques utilisant des cellules souches de mélanome et de cancer malpighien

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer l'immunité anti-tumorale d'un vaccin à base de cellules dendritiques (DC) dérivées de cellules souches cancéreuses (CSC) chez un hôte immunocompétent. Cela est réalisé en isolant d'abord les CSC ALDH positives et à activité élevée de l'aldehyde déhydrogénase (ALDH) à partir de cellules tumorales hétérogènes. Dans une deuxième étape, les DC dérivées de CSC sont isolées, puis pulsed avec un lysat pour former le vaccin.Ensuite, le lysat de CSC ou le vaccin DC à impulsions ou le vaccin TP DC est administré à des hôtes immunocompétents syngéniques normaux. Puis, dans la dernière étape, l'efficacité anti-tumorale protectrice du vaccin C-S-C-T-P-D-C est évaluée. Enfin, un ELI SA peut être réalisé pour évaluer l'immunité anti-CSC induite par le vaccin C-S-C-T-P-D-C via les lymphocytes T et les anticorps de l'hôte.Ce projet réunit deux des domaines les plus prometteurs de la recherche sur le cancer : celui des cellules souches cancéreuses et celui de l'immunothérapie antitumorale. Notre laboratoire a été parmi les premiers à découvrir des cellules souches cancéreuses dans les tumeurs solides. Il s'agit des cellules initiatrices du cancer, responsables de sa croissance ainsi que de ses métastases.Ce que vous allez découvrir aujourd'hui est une nouvelle approche utilisant l'immunothérapie pour cibler spécifiquement ces cellules souches cancéreuses. Nous utilisons un marqueur particulier appelé aldehyde déshydrogénase, qui peut être détecté par le test Alde fluoro. Vous verrez les docteurs Lin Liu et Huon Tau travailler aux côtés du Dr Chow Lee.Nous espérons qu'en ciblant ces cellules souches cancéreuses, nous améliorerons le pronostic des patients atteints de nombreux types de cancer. Commencez par suspendre les cellules tumorales d'intérêt dans du tampon de dosage alor à une concentration de un fois 10 à la puissance six cellules par millilitre. Ensuite, transférez tout sauf trois millilitres des cellules tumorales dans chacun des tubes d'échantillon et étiquetez quatre tubes de contrôle en polystyrène de 12 par 75 millimètres comme suit : non coloré alor, ALOR plus DEAB et sept A A D. Distribuez un millilitre de la suspension cellulaire dans les tubes non coloré et sept A A D, et deux millilitres dans le tube alde floor.Ensuite, ajoutez cinq microlitres de DEAB dans le tube ALOR plus DEAB. Placez les tubes sur de la glace, puis mélangez 10 microlitres de substrat alor activé dans le tube alor. Transférez immédiatement un millilitre de la solution de substrat dans le tube ALOR plus DEAB, puis ajoutez deux microlitres de substrat alor activé par million de cellules dans chacun des tubes d'échantillon.Incuber tous les tubes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis ajouter cinq microlitres de sept A a D au tube sept A a D et un microlitre de sept A a D par 1 million de cellules dans chaque tube d'échantillon. Maintenir ces tubes à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Centrifuger tous les tubes pendant cinq minutes à 250 fois G à température ambiante et remettre en suspension les culots dans du tampon d'essai Alde Fluor pour le tri cellulaire activé par fluorescence.Pour définir les portes de tri, utilisez les cellules alde Fluor plus DEAB comme témoin négatif et les cellules marquées par sept A a D comme témoin de viabilité. Sur la base de ces témoins, établissez une porte permettant de distinguer les cellules A LDH positives pour alor, D cinq élevé et SCC sept. Utilisez ensuite cette porte pour trier les cellules échantillons en populations A LDH positives pour alor, D cinq élevé et SCC sept.Pour générer les cellules dendritiques, commencez par isoler les os du fémur et du tibia d'une souris C57 black six et d'une souris C3H. Stérilisez les os dans de l'éthanol à 75 % pendant une minute à température ambiante, puis rincez-les dans du HBSS. Ensuite, coupez les extrémités des os et utilisez une seringue de 10 millilitres équipée d'une aiguille de calibre 21 pour rincer la moelle osseuse dans une boîte de Pétri. Aspirez et redistribuez les cellules plusieurs fois afin d'obtenir une suspension monocellulaire, puis centrifugez les cellules.Incuber le culot dans cinq millilitres de tampon de lyse des globules rouges pendant une minute dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Après avoir dénombré les cellules, ajuster le volume à un fois 10 puissance six cellules par millilitre dans un milieu de culture supplémenté en G-M-C-S-F et en IL-4. Puis cultiver les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % CO2, en renouvelant le milieu et les cytokines après trois jours.Le cinquième jour, récoltez les cellules dendritiques immatures. Après avoir centrifugé les cellules, resuspendez les culots dans cinq millilitres de milieu de culture, puis déposez lentement la suspension cellulaire sur un milieu d'isolement fraîchement préparé. Après une nouvelle centrifugation, récupérez les cellules dendritiques situées entre la couche de milieu de culture et celle de milieu d'isolement.Ensuite, après avoir dénombré les cellules, ajuster le volume à une concentration de un fois dix puissance six cellules par millilitre dans le milieu de culture, supplémenté en G-M-C-S-F et en IL-4. Préparer ensuite les lysats tumoraux en soumettant les cellules triées à quatre cycles successifs de congélation-décongélation rapides, suivis d'une centrifugation afin de recueillir la fraction membranaire des lysats. Incuber alors les DC avec le lysat provenant des cellules A LDH élevées triées et autologues. Pour préparer les CSC TPC.Pour préparer le vaccin H-T-P-D-C, injecter sous-cutanément aux animaux récipients expérimentaux une fois dix puissance six cellules pulsed, suspendues dans 100 microlitres de PBS, dans le flanc gauche de chaque souris. Après la vaccination, administrer par voie intraveineuse une fois dix puissance cinq cellules tumorales D5 hétérogènes dans 100 microlitres de PBS afin de provoquer un défi chez les souris récipients C57BL/6. Pour le modèle SCC7, injecter sous-cutanément les souris récipients C3H avec une fois dix puissance six cellules tumorales SCC7 non triées dans 100 microlitres de PBS, du côté opposé au vaccin à base de DC.Créer une suspension de cellules uniques à partir des rates des souris réceptrices C3H. Ensuite, activer les cellules T et B spléniques à l'aide d'anticorps monoclonaux anti-CD3 et anti-CD28 immobilisés dans un milieu de culture supplémenté avec le stimulus approprié. Après quatre jours, recueillir les surnageants, puis enrober des plaques Eliza avec des anticorps dirigés contre l'interféron gamma, le G-M-C-S-F ou l'IgG à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le jour suivant, bloquer la liaison non spécifique sur la plaque, ajouter les étalons et les surnageants fraîchement recueillis, puis incuber les plaques à température ambiante. Après lavage, ajouter l'anticorps de détection marqué à la peroxydase pendant une heure, puis ajouter le substrat TMB.Enfin, mesurez l'absorbance sur un lecteur de plaque ELISA à 450 nanomètres dans les 30 minutes suivant l'arrêt de la réaction. Alor a été utilisé comme marqueur pour isoler les cellules souches dans plusieurs malignités, y compris les deux populations enrichies en cellules souches cancéreuses D cinq et SCC sept, comme le montrent spécifiquement ces diagrammes de dispersion : les cellules positives pour Alor représentent environ 0,5 % et 5,2 % des lignées cellulaires tumorales cultivées D cinq et SCC sept, respectivement. On a également déterminé que les cellules tumorales fraîchement récoltées contiennent 2,5 % et 4,2 % de cellules positives pour Alor provenant respectivement de tumeurs D cinq et SCC sept établies in vivo.Des cellules tumorales traitées avec un inhibiteur spécifique A de la D-E-A-B-A LDH ont été utilisées comme témoin négatif. L'immunogénicité des cellules souches cancéreuses a été évaluée en examinant l'immunité anti-tumorale protectrice induite par les TPC des CSC à l'aide du modèle de vaccination précédemment démontré. Comme indiqué dans ce tableau, les souris traitées avec les TPC H ont développé moins de métastases pulmonaires que les souris traitées au PBS seul.Importamment, les souris traitées avec les PC de CSCT présentaient encore moins de métastases pulmonaires que les animaux traités avec le H-T-P-D-C ou le PBS seul. Dans le modèle SCC sept, des animaux C3 H normaux ont été vaccinés comme vient d'être démontré, par comparaison avec le groupe témoin. Les H TPC ont induit une immunité anti-tumorale modeste, tandis que les CSC TPC ont induit une inhibition significative de la croissance tumorale. Ces résultats indiquent que les CSC pourraient être utilisées comme source d'antigènes plus efficace pour le chargement des DC que les cellules tumorales traditionnelles non triées, afin d'induire une immunité protectrice contre le défi des cellules tumorales.Pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à l'immunité anti-tumorale protectrice induite par les CSC, les cytes provenant d'animaux vaccinés avec des DC ont été activés et leur production de cytokines a été mesurée par EISA ; comme vient de l'être démontré, une production de cytokines significativement plus élevée a été observée dans les cytes prélevés chez les animaux vaccinés avec les TPC de CSC D cinq ou les PC de CSC SCC sept, par rapport à ceux prélevés chez les animaux vaccinés avec les TPC H D cinq ou les HTC H SCC sept. Aujourd'hui, vous avez vu comment utiliser le test Alor pour isoler les cellules souches cancéreuses.Ces cellules souches cancéreuses peuvent ensuite être utilisées pour développer des immunothérapies utilisant des cellules dendritiques. Nous espérons que ces immunothérapies, utilisées seules ou en association avec des traitements existants, amélioreront le pronostic des patients atteints de nombreux types de cancer.

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