Génération d’un nouveau vaccin à cellules dendritiques utilisant des cellules souches de mélanome et de cancer malpighien

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer l'immunité anti-tumorale d'un vaccin à base de cellules dendritiques (DC) dérivées de cellules souches cancéreuses (CSC) chez un hôte immunocompétent. Cela est réalisé en isolant d'abord les CSC ALDH positives et à activité élevée de l'aldehyde déhydrogénase (ALDH) à partir de cellules tumorales hétérogènes. Dans une deuxième étape, les DC dérivées de CSC sont isolées, puis pulsed avec un lysat pour former le vaccin.

Ensuite, le lysat de CSC ou le vaccin DC à impulsions ou le vaccin TP DC est administré à des hôtes immunocompétents syngéniques normaux. Puis, dans la dernière étape, l'efficacité anti-tumorale protectrice du vaccin C-S-C-T-P-D-C est évaluée. Enfin, un ELI SA peut être réalisé pour évaluer l'immunité anti-CSC induite par le vaccin C-S-C-T-P-D-C via les lymphocytes T et les anticorps de l'hôte.

Ce projet réunit deux des domaines les plus prometteurs de la recherche sur le cancer : celui des cellules souches cancéreuses et celui de l'immunothérapie antitumorale. Notre laboratoire a été parmi les premiers à découvrir des cellules souches cancéreuses dans les tumeurs solides. Il s'agit des cellules initiatrices du cancer, responsables de sa croissance ainsi que de ses métastases.

Ce que vous allez découvrir aujourd'hui est une nouvelle approche utilisant l'immunothérapie pour cibler spécifiquement ces cellules souches cancéreuses. Nous utilisons un marqueur particulier appelé aldehyde déshydrogénase, qui peut être détecté par le test Alde fluoro. Vous verrez les docteurs Lin Liu et Huon Tau travailler aux côtés du Dr Chow Lee.

Nous espérons qu'en ciblant ces cellules souches cancéreuses, nous améliorerons le pronostic des patients atteints de nombreux types de cancer. Commencez par suspendre les cellules tumorales d'intérêt dans du tampon de dosage alor à une concentration de un fois 10 à la puissance six cellules par millilitre. Ensuite, transférez tout sauf trois millilitres des cellules tumorales dans chacun des tubes d'échantillon et étiquetez quatre tubes de contrôle en polystyrène de 12 par 75 millimètres comme suit : non coloré alor, ALOR plus DEAB et sept A A D. Distribuez un millilitre de la suspension cellulaire dans les tubes non coloré et sept A A D, et deux millilitres dans le tube alde floor.

Ensuite, ajoutez cinq microlitres de DEAB dans le tube ALOR plus DEAB. Placez les tubes sur de la glace, puis mélangez 10 microlitres de substrat alor activé dans le tube alor. Transférez immédiatement un millilitre de la solution de substrat dans le tube ALOR plus DEAB, puis ajoutez deux microlitres de substrat alor activé par million de cellules dans chacun des tubes d'échantillon.

Incuber tous les tubes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis ajouter cinq microlitres de sept A a D au tube sept A a D et un microlitre de sept A a D par 1 million de cellules dans chaque tube d'échantillon. Maintenir ces tubes à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Centrifuger tous les tubes pendant cinq minutes à 250 fois G à température ambiante et remettre en suspension les culots dans du tampon d'essai Alde Fluor pour le tri cellulaire activé par fluorescence.

Pour définir les portes de tri, utilisez les cellules alde Fluor plus DEAB comme témoin négatif et les cellules marquées par sept A a D comme témoin de viabilité. Sur la base de ces témoins, établissez une porte permettant de distinguer les cellules A LDH positives pour alor, D cinq élevé et SCC sept. Utilisez ensuite cette porte pour trier les cellules échantillons en populations A LDH positives pour alor, D cinq élevé et SCC sept.

Pour générer les cellules dendritiques, commencez par isoler les os du fémur et du tibia d'une souris C57 black six et d'une souris C3H. Stérilisez les os dans de l'éthanol à 75 % pendant une minute à température ambiante, puis rincez-les dans du HBSS. Ensuite, coupez les extrémités des os et utilisez une seringue de 10 millilitres équipée d'une aiguille de calibre 21 pour rincer la moelle osseuse dans une boîte de Pétri. Aspirez et redistribuez les cellules plusieurs fois afin d'obtenir une suspension monocellulaire, puis centrifugez les cellules.

Incuber le culot dans cinq millilitres de tampon de lyse des globules rouges pendant une minute dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Après avoir dénombré les cellules, ajuster le volume à un fois 10 puissance six cellules par millilitre dans un milieu de culture supplémenté en G-M-C-S-F et en IL-4. Puis cultiver les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % CO2, en renouvelant le milieu et les cytokines après trois jours.

Le cinquième jour, récoltez les cellules dendritiques immatures. Après avoir centrifugé les cellules, resuspendez les culots dans cinq millilitres de milieu de culture, puis déposez lentement la suspension cellulaire sur un milieu d'isolement fraîchement préparé. Après une nouvelle centrifugation, récupérez les cellules dendritiques situées entre la couche de milieu de culture et celle de milieu d'isolement.

Ensuite, après avoir dénombré les cellules, ajuster le volume à une concentration de un fois dix puissance six cellules par millilitre dans le milieu de culture, supplémenté en G-M-C-S-F et en IL-4. Préparer ensuite les lysats tumoraux en soumettant les cellules triées à quatre cycles successifs de congélation-décongélation rapides, suivis d'une centrifugation afin de recueillir la fraction membranaire des lysats. Incuber alors les DC avec le lysat provenant des cellules A LDH élevées triées et autologues. Pour préparer les CSC TPC.

Pour préparer le vaccin H-T-P-D-C, injecter sous-cutanément aux animaux récipients expérimentaux une fois dix puissance six cellules pulsed, suspendues dans 100 microlitres de PBS, dans le flanc gauche de chaque souris. Après la vaccination, administrer par voie intraveineuse une fois dix puissance cinq cellules tumorales D5 hétérogènes dans 100 microlitres de PBS afin de provoquer un défi chez les souris récipients C57BL/6. Pour le modèle SCC7, injecter sous-cutanément les souris récipients C3H avec une fois dix puissance six cellules tumorales SCC7 non triées dans 100 microlitres de PBS, du côté opposé au vaccin à base de DC.

Créer une suspension de cellules uniques à partir des rates des souris réceptrices C3H. Ensuite, activer les cellules T et B spléniques à l'aide d'anticorps monoclonaux anti-CD3 et anti-CD28 immobilisés dans un milieu de culture supplémenté avec le stimulus approprié. Après quatre jours, recueillir les surnageants, puis enrober des plaques Eliza avec des anticorps dirigés contre l'interféron gamma, le G-M-C-S-F ou l'IgG à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le jour suivant, bloquer la liaison non spécifique sur la plaque, ajouter les étalons et les surnageants fraîchement recueillis, puis incuber les plaques à température ambiante. Après lavage, ajouter l'anticorps de détection marqué à la peroxydase pendant une heure, puis ajouter le substrat TMB.

Enfin, mesurez l'absorbance sur un lecteur de plaque ELISA à 450 nanomètres dans les 30 minutes suivant l'arrêt de la réaction. Alor a été utilisé comme marqueur pour isoler les cellules souches dans plusieurs malignités, y compris les deux populations enrichies en cellules souches cancéreuses D cinq et SCC sept, comme le montrent spécifiquement ces diagrammes de dispersion : les cellules positives pour Alor représentent environ 0,5 % et 5,2 % des lignées cellulaires tumorales cultivées D cinq et SCC sept, respectivement. On a également déterminé que les cellules tumorales fraîchement récoltées contiennent 2,5 % et 4,2 % de cellules positives pour Alor provenant respectivement de tumeurs D cinq et SCC sept établies in vivo.

Des cellules tumorales traitées avec un inhibiteur spécifique A de la D-E-A-B-A LDH ont été utilisées comme témoin négatif. L'immunogénicité des cellules souches cancéreuses a été évaluée en examinant l'immunité anti-tumorale protectrice induite par les TPC des CSC à l'aide du modèle de vaccination précédemment démontré. Comme indiqué dans ce tableau, les souris traitées avec les TPC H ont développé moins de métastases pulmonaires que les souris traitées au PBS seul.

Importamment, les souris traitées avec les PC de CSCT présentaient encore moins de métastases pulmonaires que les animaux traités avec le H-T-P-D-C ou le PBS seul. Dans le modèle SCC sept, des animaux C3 H normaux ont été vaccinés comme vient d'être démontré, par comparaison avec le groupe témoin. Les H TPC ont induit une immunité anti-tumorale modeste, tandis que les CSC TPC ont induit une inhibition significative de la croissance tumorale. Ces résultats indiquent que les CSC pourraient être utilisées comme source d'antigènes plus efficace pour le chargement des DC que les cellules tumorales traditionnelles non triées, afin d'induire une immunité protectrice contre le défi des cellules tumorales.

Pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à l'immunité anti-tumorale protectrice induite par les CSC, les cytes provenant d'animaux vaccinés avec des DC ont été activés et leur production de cytokines a été mesurée par EISA ; comme vient de l'être démontré, une production de cytokines significativement plus élevée a été observée dans les cytes prélevés chez les animaux vaccinés avec les TPC de CSC D cinq ou les PC de CSC SCC sept, par rapport à ceux prélevés chez les animaux vaccinés avec les TPC H D cinq ou les HTC H SCC sept. Aujourd'hui, vous avez vu comment utiliser le test Alor pour isoler les cellules souches cancéreuses.

Ces cellules souches cancéreuses peuvent ensuite être utilisées pour développer des immunothérapies utilisant des cellules dendritiques. Nous espérons que ces immunothérapies, utilisées seules ou en association avec des traitements existants, amélioreront le pronostic des patients atteints de nombreux types de cancer.