Protéines consensus dérivé du cerveau, Protocole d'extraction pour l'étude de l'homme et du protéome murin cerveau en utilisant deux 2D-DIGE et Mini 2DE Immunoblotting

L’objectif global de l’expérience suivante est d’extraire des protéines de tissus cérébraux humains et de souris pour l’analyse protéomique. Ceci est réalisé en utilisant un tampon de lyse commun pour obtenir la même extraction de protéines adaptée aux approches d’électrophorèse bidimensionnelles. Ensuite, l’électrophorèse sur gel à différence de fluorescence bidimensionnelle est utilisée pour séparer les protéines pour l’identification par spectrométrie de masse.

Ceci est suivi d’une électrophorèse miniature sur gel 2D avec immuno-blot pour identifier les modifications post-traductionnelles. Les résultats peuvent montrer l’expression globale des protéines. La traduction de l’hôte modifie tous les produits de ligamentisation et catalytiques en fonction des différences de point isoélectrique et de poids moléculaire.

La combinaison du tiret 2D et du monolo 2D peut nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuroprotéomique en fournissant simultanément des informations sur les changements d’expression. Modification postale et catabolisme dans les produits Commençons par la récolte et l’homogénéisation du tissu cérébral. Préparez le tissu à 10 % poids / volume dans le tampon d’extraction pour le tissu cérébral humain.

Homogénéisez le tissu à l’aide d’un pipeteur en verre, cependant, utilisez un homogénéisateur en téflon pour les tissus de rongeurs afin de désintégrer l’un ou l’autre homogénat. Sonicatez-le à 60 hertz en utilisant des impulsions de 30 demi-secondes. Ensuite, déterminez la concentration en protéines à l’aide d’un test Bradford en utilisant BSA comme étalon.

Rassemblez maintenant les solutions pour la précipitation du chloroforme et du méthanol dans un seau à glace. Prévoyez de collecter environ 125 microgrammes pour les bandes IPG de 11 centimètres ou environ 1,25 milligramme pour les bandes IPG de 18 centimètres. Une fois que les solutions sont à quatre degrés Celsius, effectuez les précipitations complètement sur de la glace.

Ajoutez d’abord trois volumes de méthanol, puis un de chloroforme. Secouez ce mélange. Ensuite, ajoutez trois volumes d’eau froide.

Vortex, ce mélange pendant une minute centrifuge le tube d’échantillon à 12 000 Gs pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Aspirez et jetez le surnageant. Ajoutez ensuite trois volumes de vortex de méthanol et faites tourner les protéines de la même manière.

Faites sécher la pastille de protéine collectée sous de l’azote gazeux avant la DIGE 2D. Mettez la protéine en suspension dans le tampon 2D à 2,5 milligrammes par millilitre. Ensuite, sonicez les échantillons comme fait précédemment jusqu’à ce qu’ils soient utilisés.

Conservez-les à moins 80 degrés Celsius avant de commencer cette étape et après la précipitation des protéines. Il est nécessaire de déterminer à nouveau la concentration en protéines par le test de Bradford. En suivant la même procédure que celle indiquée précédemment avant l’étiquetage du colorant psy.

La qualité de l’échantillon de protéines est vérifiée par la page FDS à cet effet. Diluez 15 microgrammes de protéines dans LDS et faites-le à 37 degrés Celsius dans un bain ou un bloc de chaleur. Ensuite, passez-les sur un gel de poly acrylamide, colorez le gel avec une solution de bleu de kumasi pendant au moins une heure.

Ensuite, conservez le gel toute la nuit dans une solution d’acide acétique à 7 %, d’éthanol à 10 %. Une fois que la qualité de l’échantillon de protéines est établie, le lendemain, la procédure d’étiquetage SD est lancée. Mesurez d’abord le pH du lysat, qui doit être basique à neutre.

Le pH optimal est de 8,6 pour les réactions ultérieures. Ensuite, configurez les réactions de conjugaison des colorants pour chaque échantillon de protéines. Mélangez 50 microgrammes avec 400 picomoles de colorant S3 et 50 microgrammes avec 400 picomoles de colorant S cinq.

Faites-le en quadriuplex pour un total de huit réactions de couplage D par échantillon. Pour chaque échantillon testé, effectuez un ensemble complémentaire de réactions de couplage DI en utilisant des protéines du contrôle, par exemple d’un cerveau malade. Ensuite, pour chaque paire de réactions, mettez en place une réaction de contrôle interne avec 400 picomoles de CY deux et une représentation uniforme de toutes les protéines totalisant 250 microgrammes.

Le marquage SAI est réalisé en incubant tous les mélanges réactionnels à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant une heure. Après l’incubation, combinez tous les ensembles de trois réactions cyan différentes dans des volumes de 150 microlitres pour chaque ensemble de réactions à 200 microlitres de tampon 2D. Procédez ensuite aux étapes d’électrophorèse 2D.

Commencez par préparer des solutions protéiques non marquées pour le gel préparatif à partir desquelles des taches protéiques seront excisées pour chaque échantillon et pour le témoin positif. Aliquote 300 à 350 microgrammes de protéines non marquées dans un tampon 2D et leur permettre de se réhydrater au contact de la bandelette IPG. Ensuite, chargez les bandelettes IPG et transférez les protéines marquées et non marquées à une réhydratation.

Ensuite, couvrez chaque puits avec une bande réactionnelle IPG. Poursuivez avec une couche d’huile minérale et laissez les bandelettes se réhydrater passivement et passivement avec la solution protéique pendant la nuit à une température ne dépassant pas 25 degrés Celsius. Le lendemain, effectuez la mise au point isoélectrique des bandes IPG.

Ensuite, retirez l’huile et stockez les bandes IPG à moins 20 degrés Celsius pour équilibrer les bandes IPG. Immergez-les dans le tampon d’équilibrage pendant 15 minutes. Transférez ensuite les bandelettes à 4,7 % d’acétamide IDO dans le tampon d’équilibration, sans DTT pendant le bain des bandelettes.

Utilisez un grand système de gel 2D pour verser quatre gels de page SDS à 12 % par échantillon dans des plaques de verre à faible fluorescence pour les protéines marquées. Versez également un gel de page de 12 % de SDS dans des plaques de verre standard de 1,5 millimètre d’épaisseur pour chacune des protéines non étiquetées. Ce sont les gels préparatifs.

Lorsque les gels sont refroidis, transférez les bandes sur le dessus des gels et superposez les bandes avec 0,5 % Aros une fois refroidies, faites fonctionner les gels à 2,5 watts à quatre degrés Celsius pendant la nuit et analysez-les le lendemain. De nombreuses réactions 2D peuvent être réalisées avec des échantillons de protéines utilisés pour les gels préparatifs. Mesurez moins de 100 microgrammes d’échantillon dans 200 microlitres de tampon 2D.

Ensuite, agitez vigoureusement les mélanges d’échantillons et faites-leur tourner rapidement. Chargez les échantillons sur des bandes IPG de 11 centimètres et laissez-les se réhydrater passivement pendant la nuit couverts d’huile minérale le lendemain. Effectuez la mise au point isoélectrique.

Ensuite, déplacez les bandes à travers trois bains de tampon d’équilibrage pendant 15 minutes par bain. Les bandes sont ensuite exécutées sur des gels de page SDS 2D. Superposez chaque bande sur un gel préfabriqué de poids moléculaire approprié.

Poly acrylamide pour la protéine d’intérêt. Plus tard, transférez les gels dans une membrane NITROCELLULOSE PVDF et analysez-les avec des anticorps dans le développement de ce protocole. Trois lyses différentes.

Les tampons ont été testés. Tout d’abord, un tampon commun de biologie biochimique et moléculaire. Tris SDS a été testé.

Tris SDS avait une résolution médiocre par rapport à un autre tampon UTS testé. Le troisième tampon a été exclu car il n’a pas été possible de préparer des échantillons testables. Ensuite, les protéomes cérébraux humains et murins ont été étudiés.

Des échantillons de cortex de contrôle humain et des échantillons de cortex ad ont été comparés. Des protéines cérébrales de souris atteintes de la maladie d’Alzheimer comme la pathologie tau ont également été observées à partir de l’échantillon humain. SCI deux a été examiné indépendamment, tout comme S SI trois et sci cinq pour chaque D. La haute résolution du spot a facilité l’alignement.

Une mini-analyse 2D qualitative a été utilisée pour étudier les modifications post-traductionnelles et une ligamentisation alpha synucléine dans le tissu AD a montré un profil normal, mais également un dimère marqué d’un astérisque. Des flèches indiquaient l’endroit où l’alpha-synucléine a été trouvée. La protéine précurseur de l’amyloïde ubiquitinée a également été observée par mini 2D.

La publicité sporadique a été comparée à la publicité familiale. Dans la famille ad bêta-amyloïde un à 42 et la variance ISO sont plus faibles en concentration car les formes liga ont été trouvées à huit kilodaltons. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier le protéome afin de comparer des échantillons complexes en mesurant les modifications de l’expression des protéines.