Protéines consensus dérivé du cerveau, Protocole d'extraction pour l'étude de l'homme et du protéome murin cerveau en utilisant deux 2D-DIGE et Mini 2DE Immunoblotting
10 avril 2014
Un protocole d'extraction de la protéine en utilisant un tampon commun urée / thiourée / SDS pour le tissu cérébral des souris humain et permet indentification de protéines par 2D-DIGE et leur caractérisation ultérieure par un mini 2DE immunoblot. Cette méthode permet un pour obtenir des résultats plus fiables et reproductibles à partir de biopsies humaines et des modèles expérimentaux.
L'objectif général de l'expérience suivante est d'extraire des protéines à partir de tissus cérébraux humains et de souris en vue d'une analyse protéomique. Cette extraction est réalisée à l'aide d'un tampon de lyse courant permettant d'obtenir une extraction protéique adaptée aux approches d'électrophorèse bidimensionnelle. Ensuite, l'électrophorèse bidimensionnelle par différence de fluorescence est utilisée pour séparer les protéines en vue de leur identification par spectrométrie de masse.
Cela est suivi par une électrophorèse sur gel 2D miniature avec immunotransfert afin d'identifier les modifications post-traductionnelles. Les résultats peuvent montrer l'expression protéique globale. Les modifications traductionnelles de l'hôte régulent toutes les voies de ligandisation et les produits catalytiques en fonction des différences de point isoélectrique et de masse moléculaire.
La combinaison de la 2D dash et de la 2D monolo peut nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neuroprotéomique en fournissant simultanément des informations sur les modifications d'expression. La modification post-traductionnelle et le catabolisme des produits commencent par la récolte et l'homogénéisation du tissu cérébral. Préparez le tissu à 10 % poids sur volume dans un tampon d'extraction pour le tissu cérébral humain.
Homogénéisez le tissu à l’aide d’un pipeteur en verre ; toutefois, utilisez un homogénéisateur en téflon pour les tissus de rongeur afin de désagréger l’homogénat. Soniquez à 60 hertz en appliquant 30 impulsions d’une demi-seconde. Ensuite, déterminez la concentration en protéines par un dosage de Bradford en utilisant la BSA comme étalon.
Prélevez maintenant les solutions pour la précipitation au chloroforme-méthanol dans un seau à glace. Prévoyez de recueillir environ 125 microgrammes pour des bandes IPG de 11 centimètres ou environ 1,25 milligramme pour des bandes IPG de 18 centimètres. Une fois que les solutions ont atteint quatre degrés Celsius, effectuez la précipitation entièrement sur glace.
Tout d'abord, ajoutez trois volumes de méthanol, puis un volume de chloroforme. Agitez ce mélange. Ensuite, ajoutez trois volumes d'eau froide.
Vortexez une minute ce mélange, puis centrifugez le tube d'échantillon à 12 000 g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Aspirez et jetez le surnageant. Ajoutez ensuite un volume de méthanol équivalant à trois fois le volume initial, vortexez et précipitez les protéines de la même manière.
Sécher le culot protéique recueilli sous flux d'azote avant la DIGE 2D. Résuspendre la protéine dans du tampon 2D à 2,5 milligrammes par millilitre. Ensuite, soniquer les échantillons comme précédemment, jusqu'à leur utilisation.
Les conserver à moins 80 degrés Celsius avant de commencer cette étape et après la précipitation des protéines. Il est nécessaire de déterminer une fois de plus la concentration en protéines par dosage de Bradford. Suivre la même procédure que celle indiquée précédemment avant l'étiquetage avec le colorant psy.
La qualité de l'échantillon protéique est vérifiée par électrophorèse SDS-PAGE à cette fin. Diluez 15 microgrammes de protéine dans du LDS et chauffez à 37 degrés Celsius dans un bain ou un bloc chauffant. Ensuite, faites-les migrer sur un gel de polyacrylamide et coloriez le gel avec une solution bleue de Comassie pendant au moins une heure.
Ensuite, laisser la gélatine en contact toute la nuit avec une solution d'acide acétique à 7 % et d'éthanol à 10 %. Une fois la qualité de l'échantillon protéique établie, commencer le lendemain le protocole de marquage SD. Mesurer d'abord le pH du lysat, qui doit être neutre ou basique.
Le pH optimal est de 8,6 pour les réactions ultérieures. Ensuite, préparez les réactions de conjuguaison des colorants pour chaque échantillon de protéine. Mélangez 50 microgrammes avec 400 picomoles de colorant S3 et 50 microgrammes avec 400 picomoles de colorant S cinq.
Effectuez cela en quadruplex, pour un total de huit réactions de couplage D par échantillon. Pour chaque échantillon testé, préparez un jeu complémentaire de réactions de couplage DI en utilisant des protéines provenant d'un témoin, comme celles d'un cerveau malade. Ensuite, pour chaque paire de réactions, mettez en place une réaction témoin interne avec 400 picomoles de CY deux et une représentation équitable de toutes les protéines, pour un total de 250 microgrammes.
Le marquage SAI est réalisé en incubant tous les mélanges réactionnels à quatre degrés Celsius à l'obscurité pendant une heure. Après l'incubation, combiner tous les jeux de trois réactions cyan différentes en volumes de 150 microlitres, puis ajouter à chaque jeu 200 microlitres de tampon 2D. Ensuite, procéder aux étapes de l'électrophorèse bidimensionnelle.
Commencez par préparer des solutions de protéines non marquées pour le gel préparatif à partir desquelles des taches protéiques seront excisées pour chaque échantillon et pour le témoin positif. Aliquotez de 300 à 350 microgrammes de protéine non marquée dans du tampon 2D et laissez-les réhydrater au contact du ruban IPG. Ensuite, chargez les rubans IPG et transférez les protéines marquées et non marquées vers une réhydratation.
Recouvrez ensuite chaque puits d'une bande réactionnelle IPG. Ajoutez une couche de paraffine liquide et laissez les bandes réhydrater passivement avec la solution protéique toute la nuit à une température ne dépassant pas 25 degrés Celsius. Le jour suivant, réalisez la focalisation isoélectrique des bandes IPG.
Ensuite, retirez l'huile et conservez les bandes IPG à moins 20 degrés Celsius afin d'équilibrer les bandes IPG. Plongez-les dans le tampon d'équilibration pendant 15 minutes. Puis transférez les bandes dans du tampon d'équilibration contenant de l'acétamide à 4,7 %IDO, en l'absence de DTT, tout en immergeant les bandes.
Utilisez un grand système de gel 2D pour couler quatre gels SDS-PAGE à 12 % par échantillon sur des plaques en verre à faible fluorescence, destinés aux protéines marquées. Coulez également un gel SDS-PAGE à 12 % sur des plaques en verre standard de 1,5 millimètre d'épaisseur pour chacune des protéines non marquées. Ce sont les gels préparatifs.
Une fois les gels refroidis, transférez les bandes sur le dessus des gels et recouvrez-les de 0,5 % d'Aros. Une fois refroidi, faites fonctionner les gels à 2,5 watts à quatre degrés Celsius toute la nuit et analysez-les le lendemain. De nombreuses réactions 2D peuvent être réalisées avec des échantillons protéiques utilisés pour les gels préparatifs. Prélève moins de 100 microgrammes d'échantillon dans 200 microlitres de tampon 2D.
Ensuite, agiter vigoureusement les mélanges d'échantillons au vortex et effectuer une courte centrifugation. Déposer les échantillons sur des bandes IPG de 11 centimètres et les laisser réhydrater passivement toute la nuit, recouvertes d'huile minérale, le jour suivant. Réaliser la focalisation isoélectrique.
Ensuite, faire passer les bandes à travers trois bains de tampon d'équilibre pendant 15 minutes par bain. Les bandes sont alors analysées sur des gels SDS-PAGE en 2D. Déposer chaque bande sur un gel préfabriqué de poids moléculaire approprié.
Polyacrylamide pour la protéine d'intérêt. Ensuite, transférez les gels sur une membrane en nitrocellulose ou en PVDF et analysez-les à l'aide d'anticorps dans le cadre de l'élaboration de ce protocole. Trois lysses différentes.
Les tampons ont été testés. Premièrement, un tampon couramment utilisé en biochimie et en biologie moléculaire. Le Tris SDS a été testé.
Le Tris SDS présentait une faible résolution par rapport à un autre tampon testé, l'UTS. Le troisième tampon a été écarté car des échantillons testables ne pouvaient pas être préparés avec celui-ci. Ensuite, les protéomes cérébraux humain et murin ont été analysés.
Des échantillons de cortex contrôle humain et des échantillons de cortex AD ont été comparés. Des protéines cérébrales de souris présentant une pathologie tau semblable à la maladie d'Alzheimer ont également été analysées à partir de l'échantillon humain. SCI deux a été examiné indépendamment, de même que S SI trois et sci cinq pour chaque D. La haute résolution du spot a facilité l'alignement.
Une analyse qualitative mini 2D a été utilisée pour étudier les modifications post-traductionnelles, et une alpha-synucléine ligamentisée dans le tissu adipeux a révélé un profil normal, mais a également été détectée sous forme de dimère marqué par un astérisque. Des flèches indiquent les emplacements où l'alpha-synucléine a été observée. La protéine précurseur de l'amyloïde ubiquitinée a également été visualisée par mini 2D.
La maladie d'Alzheimer sporadique a été comparée à la maladie d'Alzheimer familiale. Dans la forme familiale de la maladie d'Alzheimer, les concentrations de bêta-amyloïde 1 à 42 et de la variante ISO sont plus faibles, car des formes dimériques ont été observées à huit kilodaltons. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étudier le protéome afin de comparer des échantillons complexes en mesurant les modifications de l'expression des protéines.
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Aperçu
Cette étude porte sur l'extraction de protéines à partir de tissus cérébraux humains et murins à l'aide d'un tampon de lyse courant pour une analyse en protéomique. La méthode permet l'identification et la caractérisation des protéines par des techniques avancées d'électrophorèse.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Protéomique
- Neurosciences
- Biochimie
Contexte
- L'extraction de protéines est essentielle pour comprendre le fonctionnement du cerveau.
- Les techniques d'électrophorèse bidimensionnelle améliorent la séparation des protéines.
- Les modifications post-traductionnelles peuvent affecter de manière significative la fonction des protéines.
- Des méthodes fiables sont nécessaires pour obtenir des résultats reproductibles dans les biopsies et les modèles.
Objectif de l'étude
- Extraire des protéines à partir de tissus cérébraux pour analyse.
- Utiliser l'électrophorèse en gel bidimensionnelle par différence de fluorescence.
- Identifier les modifications post-traductionnelles par immunoblotting.
Méthodes utilisées
- Extraction des protéines à l'aide d'un tampon urée/thiourea/SDS.
- Électrophorèse en gel bidimensionnelle par différence de fluorescence (2D-DIGE).
- Électrophorèse sur gel bidimensionnel miniature pour immunotransfert.
- Spectrométrie de masse pour l'identification des protéines.
Résultats principaux
- Extraction réussie de protéines à partir de tissus cérébraux humains et murins.
- Identification des protéines par spectrométrie de masse.
- Caractérisation des modifications post-traductionnelles.
- Reproductibilité améliorée des résultats obtenus à partir de biopsies et de modèles.
Conclusions
- La méthode fournit des résultats fiables pour l'analyse en protéomique.
- Elle facilite l'étude de l'expression et des modifications des protéines.
- Cette approche peut être appliquée à diverses études neurologiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
Ce protocole permet une extraction standardisée de protéines à partir de tissus cérébraux humains post-mortem et murins en quantité limitée, soutenant un profilage protéomique reproductible dans les modèles de maladies neurodégénératives. En intégrant la DIGE-2D pour l'analyse quantitative de l'expression et le transfert immunologique mini 2DE pour la validation des modifications post-traductionnelles, cette méthode renforce la fiabilité de la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques en phase précoce de découverte. L'approche facilite la comparaison inter-espèces et la découverte de biomarqueurs liés aux voies de la maladie d'Alzheimer et de la démence à corps de Lewy.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce au profilage de l'expression protéique global dans des tissus cérébraux pertinents pour la maladie.
- Valeur opérationnelle : Soutient la validation fonctionnelle des cibles en détectant des modifications post-traductionnelles telles que l'ubiquitination et la dimerisation de protéines associées à la maladie comme l'alpha-synucléine et la protéine précurseur de l'amyloïde.
- Valeur prédictive : Améliore le tri des projets en permettant une comparaison qualitative des modifications protéiques entre différentes conditions, facilitant ainsi la priorisation des cibles.
Développement de criblages et de tests
- Prêt de l'essai : Prépare des systèmes biologiques validés pour des flux de travail en aval en produisant des extraits protéiques compatibles avec les plateformes de DIGE-2D et de transfert immunoblot.
- Reproductibilité : Assure la standardisation des essais grâce à un tampon de lyse standardisé et à une précipitation au chloroforme-méthanol, améliorant ainsi la cohérence entre échantillons humains et murins.
- Production quantitative : Permet une évaluation fiable des composés par électrophorèse en gel différentielle avec détection fluorescente, facilitant le criblage de l'expression différentielle.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Facilite l'étude des voies moléculaires dans les maladies neurodégénératives en permettant l'analyse d'agrégats protéiques tels que l'amyloïde-bêta et l'alpha-synucléine.
- Continuité translationnelle : Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en permettant la comparaison parallèle des protéomes cérébraux humains et murins.
- Progression ajustée au risque : Éclaire les décisions de poursuite ou d'abandon en identifiant des modifications protéiques associées à la maladie ainsi que des changements d'expression dans des modèles de pathologie liée à la protéine tau.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte, allant du test d'hypothèses à l'identification de candidats, en particulier dans les programmes sur les maladies neurodégénératives nécessitant des connaissances mécanistiques et la réduction des risques associés aux cibles.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en résolvant les variations d'expression protéique et les modifications post-traductionnelles par séparation selon le point isoélectrique et le poids moléculaire.
- Screening : Fournit des résultats quantitatifs et une préparation adéquate pour les tests grâce à la DIGE-2D, permettant la comparaison de l'expression protéique entre des échantillons complexes.
- Analytique : Génère des mesures quantifiables telles que l'intensité des taches, les décalages de migration et les profils de modification, aidant les équipes à comparer différentes conditions et à hiérarchiser les cibles.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en permettant l'analyse de tissus cérébraux humains et murins dans des conditions comparables, soutenant ainsi l'alignement des biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme une capacité protéomique réutilisable plutôt que comme une technique à usage unique, applicable à plusieurs cibles et modèles de maladies.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique grâce à l'observation directe des modifications protéiques et des variations d'expression.
- Valeur opérationnelle : Favorise la standardisation et la reproductibilité par l'utilisation de tampons de lyse et de protocoles de précipitation des protéines standardisés, minimisant ainsi les variations entre laboratoires.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant une réduction précoce des risques associés aux cibles grâce à une compréhension mécanistique, réduisant ainsi le risque d'échec en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque en fournissant des données sur les biomarqueurs protéiques et les états de modification liés à la progression de la maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise en protéomique, en biochimie des protéines et en techniques d'électrophorèse, notamment la DIGE-2D et le transfert immunoblot.
- Suppose l'utilisation d'instruments tels que des systèmes d'électrophorèse, des sonicateurs, des centrifugeuses et des plateformes compatibles avec la spectrométrie de masse.
- Nécessite une standardisation interéquipes des procédures de manipulation des échantillons, de quantification protéique et d'étiquetage afin d'assurer la reproductibilité.
- Implique des adaptations à envisager lors de l'application du protocole à différentes régions cérébrales, modèles de maladie ou quantités d'échantillons.
- Comprend des limites pratiques, telles que la nécessité d'une manipulation soigneuse des échantillons pour éviter leur dégradation et la dépendance à un rendement protéique suffisant à partir de prélèvements tissulaires limités.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:05
Title
1:08
Extracting Total Protein
3:07
Quality Control and Dye Conjugation
5:28
Fluorescence Difference Gel Electrophoresis (2D-DIGE)
7:36
Mini-2DE for Quantitative Analysis
8:53
Proteomics of Human and Mouse Tissue with Alzheimer Disease
10:26
Conclusion
