Cartographie des interactions protéine-protéine dysfonctionnelles dans la maladie

Nos travaux cartographient directement les interactions dysfonctionnelles protéine-protéine à partir des cellules et tissus natifs, révélant comment la maladie reconfigure les réseaux cellulaires. Contrairement à la plupart des méthodes interatomiques, le dfPPI ne nécessite aucun génie génétique ni compétences des cohortes de patients, utilisant une capture multiplex par échantillon. Pour commencer, préparez un tampon d’extraction protéique contenant 20 millimolaires de Tris, 20 millimolaires de chlorure de potassium, 5 millimolaires de chlorure de magnésium et 0,01 % de Nb-40.

Ajoutez immédiatement des inhibiteurs de protéase et de phosphatase avant l’utilisation et gardez le tampon sur glace. Placez l’échantillon de tissu congelé dans un tube micro-homogénéiseur de tissus équipé d’un pilon. Ajoutez 500 à 700 microlitres du tampon de lyse natif, en ajustant le volume en fonction de la compacité tissulaire et de la facilité d’homogénéisation.

Ensuite, homogénéisez l’échantillon sur glace en déplaçant doucement le pilon de haut en bas et contre les parois abrasives jusqu’à obtenir une suspension uniforme. Incubez les lysats à 4 degrés Celsius pendant 30 minutes en plaçant le flacon sur une unité de rotation. Mélangez délicatement les échantillons pendant l’incubation en alternant la rotation.

À l’aide d’une centrifugeuse de paillas, centrifugez les échantillons à 13 000 G pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius pour éliminer les débris cellulaires. Collectez soigneusement les surnatants et transférez-les dans des tubes microcentrifugeuses transparents de 1,5 millilitre. Déterminez la concentration totale de protéines dans le surnageant à l’aide du kit de test BCA selon les instructions du fabricant.

Ensuite, prenez une aliquote de billes de polyuréthane directement à partir du stock d’isopropanol. Laissez les billes se déposer pour éliminer le solvant de stockage. Aspirez soigneusement l’isopropanol, puis ajoutez un tampon de lyse natif et resuspendez complètement les billes par pipetage doux ou inversion.

Pour laver et équilibrer les billes, faites tourner le tube en vortex puis centrifugez-le. Ensuite, aspirez le surnageant avec une conduite à vide équipée d’une pointe de pipette, en veillant à ne pas déranger la pellete. Ajoutez un tampon de liaison aux billes lavées dans un ratio égal pour créer une suspension uniforme de billes de travail.

40 microlitres de boue de billes de polyuréthane en tubes microcentrifuge de 1,5 millilitre, utilisant une pointe de pipette découpée pour une distribution fluide. Ensuite, lavez les billes trois fois avec un tampon de lyse natif en ajoutant 1 millilitre de tampon à chaque tube. Manipulez le tube pour resuspendre les biles, puis centrifugez à 10 000 G pendant 1 minute et jetez le surnageant par aspiration.

Après le lavage final, retirez la majeure partie du liquide restant des tubes, afin de garantir que la pellete de billes reste intacte. Ajoutez les extraits protéiques normalisés dans des tubes individuels de microcentrifuge de 1,5 millilitres contenant 40 microlitres de boue de billes témoins. Ajustez le volume final à 250 microlitres en ajoutant la quantité appropriée de tampon de lyse native.

Incubez les échantillons à 4 degrés Celsius pendant 30 minutes avec une rotation sur un rotateur bout sur bout fonctionnant à 10-15 tours par minute. Centrifugez les tubes à 10 000 G pendant 1 minute à 4 degrés Celsius pour faire des granules aux billes de contrôle avec des protéines agrégées ou insolubles. Prélever soigneusement le surnageant des billes de contrôle à l’aide d’une pipette de 1 millilitre et transférez-le dans des tubes neufs de 1,5 millilitres contenant 40 microlitres de boue de billes en polyuréthane lavée.

Incubez les échantillons à 4 degrés Celsius pendant 3 heures avec une rotation sur un rotateur de bout en bout. Après centrifugation soigneusement des tubes, aspirez le surnageant et lavez les billes quatre fois, comme démontré précédemment. Retirez tout PBS résiduel du tube.

Résuspendez les billes lavées dans 80 microlitres d’urée de 2 molaires fraîchement préparée dans du bicarbonate d’ammonium de 50 millimolaires à pH 8,5 par pipettage ou par vortex bref. Ensuite, ajoutez du dithiothréitol pour obtenir une concentration finale de 1 millimolaire. Après avoir tapé le tube, incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes en secouant à 1 100 tours par minute sur un vibrateur orbital chauffé.

Ajoutez de l’iodoacétatide pour atteindre une concentration finale de 3,67 millimolaires. Incubez les tubes dans l’obscurité à température ambiante pendant 45 minutes en les secouant à 1 100 tours par minute. Ajoutez maintenant du dithiothréitol supplémentaire pour éteindre tout iodoacétate non réagi, en assurant une concentration finale de 3,67 millimolaires, puis mélangez doucement par pipetage.

Ajoutez 750 nanogrammes de protéase Lys-C de qualité spectrométrie de masse de 0,5 milligramme par millilitre à l’échantillon. Incubez le mélange à 37 degrés Celsius pendant 1 heure en secouant à 1 150 tours par minute. Ensuite, ajoutez 750 nanogrammes de tripsin de qualité séquençage de 0,5 milligramme fraîchement préparé à l’échantillon.

Incubez le mélange toute la nuit à 37 degrés Celsius en secouant à 1 150 tours par minute. Le lendemain, centrifugez l’échantillon à 1 000-5 000 G pendant 1 à 5 minutes à température ambiante. Transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette, puis jetez les billes.

Ajustez le pH de la digestion en dessous de 3 en ajoutant 50 % d’acide trifluoroacétique goutte à goutte. Vérifiez le pH à l’aide de bandes indicatrices. Les billes de PU ont capturé fortement HSP90, HSC70 et protéines chaudes du lysat haut de l’épichaperome avec un signal minimal du lysat bas de l’épichaperome, confirmant la spécificité biologique de la sonde.

Le profil de cargaison de la perle de PU montrait un signal riche et de poids moléculaire élevé dans la voie des billes de PU et un fond minimal dans la voie de billes de contrôle, confirmant ainsi une activité de sonde réussie. Les gels SDS-PAGE colorés par Coomassie ont montré une distribution constante des bandes sur quatre échantillons traités dans le gel, confirmant un enrichissement réussi des complexes protéiques issus de lysats natifs avant la spectrométrie de masse. La reproductibilité technique a été confirmée par une analyse en composantes principales, où les échantillons réplicés se regroupaient étroitement tandis que différents échantillons se séparaient proprement.

Les distributions d’intensité des ions précurseurs ont montré que la plupart des caractéristiques présentaient des coefficients de variation inférieurs à 20 % avec des valeurs médianes entre 9,7 % et 11,9 % à travers les échantillons, confirmant une détection et une récupération constantes des peptides. Le regroupement hiérarchique des abondances de protéines transformées en logarthmique a révélé une forte séparation des échantillons et a préservé la variation interéchantillon, avec des intensités protéiques allant de faible abondance à des protéines fortement enrichies. L’analyse d’enrichissement des voies a démontré une large couverture d’annotation à travers plusieurs ontologies, y compris des catégories d’ontologies génétiques et des bases de données sélectionnées, telles que Reactome, KEGG et WikiPathways.

dfPPI nous a permis de découvrir des connaissances mécanistes et thérapeutiques que d’autres approches ne peuvent tout simplement pas atteindre. Le dfPPI amène l’interomique au niveau des cohortes réelles de maladies et des conditions natives, permettant des hypothèses mécanistes et thérapeutiques précises. Nous étendons maintenant le dfPPI pour cartographier les changements au niveau des réseaux dans les maladies neurodégénératives, telles que l’Alzheimer et le Parkinson.