Name: Induisant myointimale hyperplasie Versus athérosclérose chez la souris: An Introduction de deux modèles valides (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Découvrez deux modèles murins valides pour étudier le rétrécissement aortique par hyperplasie myointimale et athérosclérose. Ces méthodes permettent d'explorer les mécanismes distincts du développement des plaques vasculaires.

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Les auteurs remercient Christiane Pahrmann pour l&#39;assistance technique. SS a reçu des fonds de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (SCHR992/3-2 et SCHR992/4-2).

Tous les travaux des animaux doit être effectué selon les directives de protection des animaux concernés. Obtenir l&#39;approbation institutionnelle pour le travail des animaux avant protocole de début. 1. Myointimale hyperplasie modèle (A) Pour le modèle de l&#39;hyperplasie intimale, acheter C57BL/6J (Stock nombre 000664, C57BL/6J) souris à l&#39;âge de 8 semaines pesant environ 25 g. Souris Maison à ces expériences dans des conditions classiques; nourrir les souris bouffe de souris standard et de fournir l&#39;eau ad libitum. <ol><li> Préparation de la souris: Présentez la souris à un état ​​d&#39;anesthésie avec de l&#39;isoflurane (2%) en utilisant une chambre d&#39;induction. <ol><li> Enlever les poils abdominale en utilisant une tondeuse à cheveux, poser la souris sur le dos et couvrir le nez et la bouche avec le masque facial pour assurer l&#39;anesthésie. </li><li> Avec Provo-iode, désinfecter la zone abdominale universellement, suivie par 80% d&#39;éthanol, en deux cycles. </li><li> Assurer l&#39;absencedes réflexes de pincement de la patte arrière pour surveiller la profondeur suffisante de l&#39;anesthésie. </li><li> Séparer la peau et les muscles le long de la ligne blanche en deux étapes pour exposer les organes abdominaux. </li><li> Disposez les intestins dans un gant de solution saline hydratée. Enroulez le gant autour des intestins pour les garder humides. </li><li> Attention déblayer le tissu adipeux bâches l&#39;aorte abdominale. Exposer la aorte jusqu&#39;à sa bifurcation, en prenant soin de ne pas blesser des navires de la branche. </li><li> Tout d&#39;abord, placer une pince de microchirurgie sur la proximale, aorte pour arrêter le flux de sang. Maintenant, appliquer une deuxième pince distale à côté de la bifurcation aortique. </li><li> Lorsque le flux de sang est interrompu, une petite incision dans l&#39;aorte à proximité de la pince proximale. </li><li> Insérer le cathéter à ballonnet, qui a été hydratée avec une solution saline à 0,9%, et de faire avancer la pince en direction distale de l&#39;aorte. </li><li> Pour lésion endothéliale, dénuder l&#39;aorte en gonflant le balloon prudemment et lentement en tirant le cathéter dans la direction proximale de la pince. </li><li> Répéter deux fois la manœuvre de la dénudation. </li><li> Retirer le cathéter et fermer l&#39;incision aortique par 10-0 prolène sutures de fonctionnement. </li><li> Ouvrez avec précaution la pince distale. En cas de saignement au site de aortotomie, fermer la pince à nouveau, localiser le saignement et placer des points interrompus supplémentaires, si nécessaire. </li><li> Si aucun saignement peut être observé, ouvrir lentement la pince proximale. </li><li> Une impulsion aortique doit être visible de manière distale à partir de l&#39;incision. Maintenant, les intestins peuvent être organisées retour in situ. </li><li> Rincer la cavité abdominale en utilisant une solution saline stérile préchauffée. </li><li> Fermer la paroi abdominale en commençant par la couche de muscles en utilisant 6-0 sutures prolène de fonctionnement. </li><li> Adapter ensuite la peau sous l&#39;utilisation de 5-0 prolène effectuer des sutures de fonctionnement. </li><li> Pendant le temps de la souris est toujours anesthésié, appliquer 4-5 mg / kg Carprofen via un Inje sous-cutanéection. </li><li> Ajouter Metamizol à l&#39;eau potable (50 mg par 100 ml Metamizol) pour le contrôle de la douleur et continuer pendant 3 jours après la chirurgie. Surveillance des animaux tout au long de la récupération. Note: La période d&#39;observation pour ce modèle est de 28 jours. </li></ol></li></ol> 2. L&#39;athérosclérose modèle (B) Pour le modèle de l&#39;athérosclérose, l&#39;achat d&#39;apolipoprotéine E déficient (ApoE - / -) chez la souris (Stock nombre 002052, B6.129P2-Apoetm1Unc / J) à l&#39;âge de 4 semaines, puis nourris pendant 4-6 mois. Souris Maison à ces expériences dans des conditions classiques; nourrir des souris haut régime occidental lipides à l&#39;arrivée (Harlan Laboratories TD.88137) et fournir de l&#39;eau ad libitum pour une durée de 4 à 6 mois. <ol><li> Préparation de la souris: <ol><li> Nourrir la ApoE - / - souris avec un régime alimentaire occidental à partir de 4 semaines d&#39;âge. Modification du régime alimentaire devrait commencer directement à l&#39;arrivée. </li><li> Maintenir une alimentation occidentale tout au long de la durée de l&#39;expérience. &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> 3. Analyse <ol><li> Modèle de l&#39;hyperplasie myo-intimale (A) La région d&#39;intérêt de ce modèle est la &quot;zone de lésion&quot;. Options pour analyse comprennent oblitération luminale, rapport I / M (rapport intima / média), épaisseur maximale de myointima, zone myointimale, coloration au trichrome de la fibrose, et coloration H &amp; E pour les cellules mononucléaires (comme illustré dans les figures 1A-1C). Selon la question scientifique comme de nombreux autres colorations rouge de picrosirius collagène, l&#39;immunohistochimie, et des procédés peuvent être appliqués à foyer commun. </li><li> modèle de l&#39;athérosclérose (B) Les régions d&#39;intérêt dans ce modèle sont la valve aortique, l&#39;arc aortique ainsi que l&#39;aorte descendante. Options pour analyse: Soudan coloration rouge pour les lipides et coloration au trichrome de la valve aortique, l&#39;arc aortique et de l&#39;aorte descendante (comme illustré à la figure 1D). Ce modèle donne également une variété d&#39;autres options de coloration commepar exemple Oil Red O pour les lipides neutres, picrosirius rouge, immunohistochimie, et les méthodes confocale. <ol><li> Soudan coloration rouge: Effectuer la coloration rouge Soudan, le tissu aortique fraîchement récoltées. <ol><li> Retirez le 6h de régime avant la récolte. </li><li> Introduire la souris à un état d&#39;anesthésie avec de l&#39;isoflurane (2%) en utilisant une chambre d&#39;induction. Assurer l&#39;absence de réflexes en pinçant la patte arrière pour surveiller la profondeur suffisante de l&#39;anesthésie. </li><li> Ouvrez le coffre; couper l&#39;apex du cœur et perfuser le ventricule gauche par l&#39;intermédiaire, d&#39;abord avec une solution saline (3 ml), suivie de 4% de PFA (3 ml) à travers la racine de l&#39;aorte à fixer l&#39;aorte. </li><li> Libérez l&#39;aorte de la racine à la bifurcation. Essayez d&#39;enlever les tissus gras autant que possible. </li><li> Coupez le coeur et la racine de l&#39;aorte, et les stocker dans 4% PFA pour l&#39;histologie. </li><li> Pour l&#39;histologie de la racine de l&#39;aorte doit être soigneusement placé dans le bloc de paraffine dans une position verticale pour permettre à la pointe de l&#39;aortic diapositives génératrices de racine qui affichent tous les trois dépliants valvulaires. </li><li> Couper une extrémité de l&#39;arbre de l&#39;aorte et le fixer sur la couche de silicone avec des épingles fines. Ouvrez l&#39;aorte longitudinalement et fixer le tissu aortique. </li><li> Rincer le tissu avec 50% d&#39;éthanol. Immerger le tissu avec une solution de coloration au Soudan III pendant environ 15 min. </li><li> Rincez légèrement avec 50% d&#39;éthanol pour éliminer l&#39;excès Soudan III. (Remarque: 50% d&#39;éthanol peut laver le colorant loin.) Rincer avec dH 2 O, et prendre des photos pour une analyse ultérieure. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Manuel, D. G., Leung, M., Nguyen, K., Tanuseputro, P., Johansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+cardiovascular+disease+in+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Burden of cardiovascular disease in Canada.</a> Can J Cardiol. 19, 997-1004 (2003).</li>
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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Bien que ces deux maladies entraînent des symptômes similaires chez le patient, les mécanismes sous-jacents de développement de la plaque et par conséquent, les approches de traitement sont très différents 2. Dans différentes formes de sténose artérielle les résultats cliniques des patients ainsi que la période de développement de la plaque dépendent du mécanisme sous-jacent. Selon les résultats cliniques chez le patient, différentes méthodes d&#39;analyse de l&#39;échantillon doi...

Dans les pays industrialisés cardiopathie ischémique reste une des principales causes de la mortalité 1. Les causes de sténose de l&#39;artère coronaire sont multiples et comprennent l&#39;hyperplasie myo-intimale ainsi que l&#39;athérosclérose, une revascularisation restant stratégie de traitement la plus courante 2. Les modèles de recherche qui distinguent clairement les voies mécanistiques de l&#39;hyperplasie intimale et l&#39;athérosclérose sont essentiels pour enquêter sur la pathobiologique et processus physiopathologiques en développement de la plaque artérielle. Dans cette vidéo, deux modèles différents de souris utilisées pour étudier soit le développement de l&#39;hyperplasie myo-intimale ou l&#39;athérosclérose sont introduits. Hyperplasie myo-intimale est postulé pour former via le paradigme &quot;réponse à des blessures&quot; décrit à l&#39;origine de l&#39;athérosclérose 3. La rupture mécanique de la couche endothéliale conduit à un remodelage intense renforcée par des effets paracrines. Il existe plusieurs dimodèles animaux fférents couramment utilisées pour étudier l&#39;hyperplasie myo-intimale. Certains groupes utilisent des dispositifs de métaux dans l&#39;aorte ascendante de 4 rats. Le modèle de dénudation aortique réalisée avec un cathéter à ballonnet est également communément utilisé dans des rats de laboratoire 5,6. Le modèle de l&#39;hyperplasie intimale réalisée chez des souris de laboratoire 7 met en oeuvre la ligature de l&#39;artère carotide et induit des lésions myo-intimales 8. Dans notre laboratoire, le modèle de la dénudation de l&#39;aorte abdominale - pour étudier le développement de l&#39;hyperplasie myo-intimale - ainsi que d&#39;un modèle humanisé stent resténose 9 sont couramment utilisés. Cette vidéo souligne que le choix du modèle animal expérimental adéquat est essentiel pour des études mécanistiques ou physiopathologiques de la sténose artérielle. Modèles hyperplasie myo-intimale doivent être distinguées des modèles d&#39;athérosclérose. Pour ces derniers, l&#39;apolipoprotéine E-deficient (ApoE - / -) chez la souris en combinaison avec un régime alimentaire occidental sont couramment utilisés pour induire atheroscllésions érotiques 10,11,12,13. Des exemples pour l&#39;induction de ces deux types de la maladie chez les souris myointimal sont présentés ici, avec différentes options de modèle adapté pour analyser vaisseau sténose 14.

<table><tbody><tr><td>Bouillon de thyoglycolate 3 %</td><td>Fluka</td><td>70157</td><td>poudre</td></tr><tr><td>PFA 4 %</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>#157135S</td><td>20 %</td></tr><tr><td>Solution de coloration Sudan III</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4131</td><td></td></tr><tr><td>poudre souris C57BL / 6J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>Stock # 0006664</td><td></td></tr><tr><td>souris ApoE -/-</td><td>Jackson Laboratories</td><td>Stock #002052</td><td></td></tr><tr><td>Western Diet</td><td>Harlan Laboratories</td><td>TD.88137</td><td></td></tr><tr><td>tondeuse à cheveux</td><td>WAHL</td><td>8786-451A ARCO SE</td><td></td></tr><tr><td>Forene</td><td>Abbott</td><td></td> Pince microchirurgicale <td>Isoflurane</td></tr><tr><td>Fine</td><td>Science Tools</td><td>18055-04</td><td>Micro-Serrefine - 4 mm</td></tr> pince <tr><td>applicatrice</td><td>Fine Science Tools</td><td>18056-14</td><td></td></tr><tr><td>cathéter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10-0 suture prolène</td><td>Ethicon</td><td>788G</td><td></td></tr><tr><td>6-0 suture prolène</td><td>Ethicon</td><td>8709H</td><td></td></tr><tr><td>5-0 suture prolène</td><td>Ethicon</td><td>EH7229H</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Carprofen</td></tr><tr><td>Metacam 1,5 mg/ml</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td></td><td>Metamizol</td></tr></tbody></table>

induisant myointimale hyperplasie versus athérosclérose chez la souris: an introduction de deux modèles valides

Inducing Myointimal Hyperplasia Versus Atherosclerosis in Mice: An Introduction of Two Valid Models

Différents modèles in vivo laboratoire de rongeurs pour l&#39;induction de la sténose de l&#39;artère ont été créés pour imiter les maladies qui comprennent la formation de la plaque artérielle et de la sténose, comme on l&#39;observe par exemple dans la cardiopathie ischémique. Deux modèles de souris hautement reproductibles - à la fois entraînant sténose de l&#39;artère sous-jacents, mais chacun un chemin différent de développement - sont introduits ici. Les modèles représentent les deux causes les plus fréquentes de sténose de l&#39;artère; à savoir un modèle de souris pour chaque hyperplasie myointimale et l&#39;athérosclérose sont présentés. Provoquer l&#39;hyperplasie myo-intimale, une lésion par cathéter à ballonnet de l&#39;aorte abdominale est effectuée. Pour le développement de la plaque athéroscléreuse, l&#39;ApoE - / - modèle de souris en combinaison avec un régime alimentaire occidental gras est utilisé. Options de modèle adapté différentes pour la mesure et l&#39;évaluation des résultats sont nommées et décrites dans ce manuscrit. L&#39;introduction et la comparaison de ces deux modèles fournit information pour les scientifiques de choisir le modèle de sténose de l&#39;artère appropriée, conformément à la question scientifique posée.

La figure 1 montre les différentes options d&#39;analyse et l&#39;état de la maladie induite pour les deux modèles. Pour le modèle de l&#39;hyperplasie intimale, l&#39;analyse des sections représentatives de coloration au trichrome est affiché. A partir de ces sections transversales, de tels résultats ratios E / S, l&#39;épaisseur maximale de la plaque, l&#39;épaisseur maximale de l&#39;intima dans le lumen, l&#39;oblitération luminale en pour cent, ainsi que la zone de la plaque peuvent être mesurées e...

Cette vidéo montre deux modèles de l&#39;intima développement de la plaque dans les artères de souris et met l&#39;accent sur les différences dans l&#39;hyperplasie myo-intimale et l&#39;athérosclérose.

Induisant myointimale hyperplasie Versus athérosclérose chez la souris: An Introduction de deux modèles valides

Various in vivo laboratory rodent models for the induction of artery stenosis have been established to mimic diseases that include arterial plaque ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de présenter deux modèles animaux valides conduisant à un rétrécissement de l'aorte par des mécanismes différents. Le premier modèle consiste en une cathétérisation par ballonnet de l'aorte afin d'induire le développement d'une hyperplasie myointimale. Tout d'abord, l'aorte abdominale sous-rénale est exposée et clampée.Ensuite, l'aorte est ouverte par une incision transversale et un cathéter à ballonnet est introduit. L'endothélium de l'aorte est alors décapé à l'aide du cathéter gonflé et la chirurgie est terminée. Le deuxième modèle consiste en une manipulation alimentaire de souris transgéniques APOE nulles afin de provoquer la formation de plaques athéroscléreuses.Ces souris sont élevées dans des conditions standard et nourries avec un régime occidental riche en lipides pendant quatre à six mois. En fin de compte, l'analyse histologique de l'hypertrophie myo-intimale induite chirurgicalement et du modèle de restriction alimentaire montre qu'elles entraînent un rétrécissement luminal différent. Aujourd'hui, nous allons vous présenter deux modèles distincts permettant d'induire un rétrécissement luminal : le modèle murin utilisant un cathéter à ballonnet pour provoquer une lésion vasculaire, et le modèle de sclérose artérielle.En utilisant des souris transgéniques sous un régime occidental, le modèle de cathéter-ballonnet peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la sténose. Le modèle de souris mutante transgénique homozygote upper E est utilisé pour étudier la physiopathologie de l'athérosclérose. Pour le modèle d'hyperplasie intimale, obtenir des souris C57BL/6J pesant environ 25 grammes.Les maintenir dans des conditions normales avec une alimentation standard. Après avoir anesthésié la souris avec 2 % d'isoflurane, raser les poils abdominaux, administrer du carprofène par injection sous-cutanée pour l'analgésie. Ensuite, désinfecter alternativement la peau avec de la providone-iodée et de l'éthanol à 80 % en deux cycles.Recherchez maintenant l'absence de réflexes en pinçant l'orteil. Commencez la chirurgie en séparant la peau et les muscles le long de la ligne alba. Ensuite, enveloppez les intestins dans un gant humidifié avec du sérum physiologique, puis retirez attentivement le tissu adipeux recouvrant l'aorte abdominale.Exposer maintenant l'aorte infrarénale jusqu'à sa bifurcation, en prenant soin de ne pas endommager les vaisseaux collatéraux. Pincer ensuite l'aorte.Placez d'abord un clamp microchirurgical sur l'aorte infrarénale proximale afin d'interrompre le flux sanguin. Ensuite, appliquez un deuxième clamp distal près de la bifurcation aortique. Lorsque le flux sanguin est interrompu, pratiquez une petite incision dans l'aorte à proximité du clamp proximal.Insérez le cathéter vers la pince distale de l'aorte pour provoquer une lésion endothéliale. Dénudez l'aorte en gonflant soigneusement et lentement le ballonnet du cathéter, puis en tirant progressivement le cathéter en direction de la pince proximale. Répétez cette manœuvre deux fois, pour un total de trois gonflages de l'aorte.Retirez maintenant le cathéter et fermez l'incision aortique à l'aide de points continus en proline 10 au. Avec les points en place, ouvrez soigneusement le clamp distal s'il y a un saignement au site d'autotomie de l'AOR. Refermez à nouveau le clamp, localisez la source du saignement et arrêtez-la par des points séparés supplémentaires.Lorsqu'il n'y a pas de saignement, ouvrez lentement le clamp proximal. Un pouls aortique doit être visible au niveau de la partie distale par rapport à l'incision. Réorganisez maintenant les intestins en C deux.Ensuite, fermez la paroi abdominale en commençant par la couche musculaire à l'aide de six sutures continues en proline OTT. Puis, fermez la peau avec cinq sutures OTT et transférez la souris dans sa cage. Au cours des trois premiers jours postopératoires, ajoutez du métrazole à l'eau de boisson pour le contrôle de la douleur.Surveillez l'animal tout au long de sa récupération, qui dure environ 28 jours. Pour le modèle d'athérosclérose, obtenez des souris déficientes en APOE âgées de quatre semaines. Élevez ces souris dans des conditions standard avec un régime occidental riche en lipides pendant quatre à six mois.Continuer ce régime pendant toute la durée de l'expérience. Six heures avant la récolte de l'aorte, supprimer l'accès à la nourriture. Préparer ensuite la souris pour la chirurgie comme décrit dans la section précédente.Commencez la chirurgie en ouvrant la poitrine. Ensuite, sectionnez l'apex du cœur et perfusez-le sous une pression douce avec trois millilitres de paraformaldéhyde à 4 % par la racine aortique afin de fixer l'aorte. Puis, libérez l'aorte depuis sa racine jusqu'à sa bifurcation.Essayez de retirer autant que possible le tissu adipeux. Ensuite, sectionnez l'arc aortique et conservez-le dans du paraformaldéhyde à 4 %. Transférez maintenant le cœur et l'arbre aortique dans une boîte en silicone contenant du PBS. Coupez une extrémité de l'arbre aortique et fixez-la sur la couche de silicone à l'aide d'épingles fines. Ouvrez l'aorte longitudinalement et laissez le tissu aortique reposer dans du PBS à température ambiante pendant quelques minutes. Rincez ensuite le tissu une fois avec de l'éthanol à 50 % et immergez-le dans un bain de Soudan.Trois, colorer la solution pendant environ 15 minutes. Après la coloration, rincer rapidement le tissu avec de l’éthanol à 50 % pendant quelques secondes afin d’éliminer uniquement l’excès de Soudan. Un rinçage excessif éliminerait trop de colorant ; rincer immédiatement le tissu avec de l’eau distillée et procéder à l’imagerie. Pour le modèle d’hyperplasie intimale myo, des aortes de souris dénudées ont été prélevées, incluses dans la paraffine et colorées au trichrome. Les rapports Im ont été calculés à partir des coupes colorées au trichrome en mesurant l’épaisseur de l’intima et de la média.À l'aide d'une analyse informatique suivie du calcul du rapport, l'épaisseur maximale de la plaque a été mesurée comme l'épaisseur maximale de l'intima dans la lumière par arbre morpho informatique. Le pourcentage d'obstruction luminale a été calculé comme le rapport entre la nouvelle lumière interne et l'ancienne lumière. La surface de la plaque a été calculée en soustrayant la nouvelle lumière interne de l'ancienne lumière.Les mêmes analyses ont été effectuées sur des coupes transversales colorées au trichrome du modèle d'athérosclérose au niveau du valvule aortique, de l'arc aortique et de l'aorte descendante, uniquement pour le modèle d'athérosclérose. L'aorte descendante a été ouverte longitudinalement et colorée au rouge Soudan. La surface de la plaque et la surface totale de l'aorte ont été mesurées à l'aide d'un ordinateur pour l'analyse des deux modèles.D'autres méthodes, telles que l'histopathologie et la microscopie à immunofluorescence confocale, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions concernant l'oblation luminale, la morphologie et la cellularité. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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