Name: Linduction de la protéine de suppression Grâce In Utero Électroporation à Définir déficits migration neuronale dans des modèles transgéniques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Découvrez l'électroporation in utero pour analyser les déficits de migration neuronale dans des modèles de souris transgéniques. Cette méthode permet de manipuler des gènes spécifiques et d'étudier le développement cérébral.

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Nous sommes redevables à Pierre Mattar et Freda Miller pour leur aide avec l’électroporation in utero et à Noel Ghanem et Bensun Fong pour la création des diagrammes. Nous remercions Linda Jui et Jason G. MacLaurin pour leur excellente assistance technique. L’équipement a été pris en charge par le Centre de rétablissement de l’AVC.
Ce travail a été soutenu par une bourse de la HSFO et de la GGO à D.S.S. et une subvention des IRSC à R.S.S.

NOTE: Toutes les expériences ont été approuvés par l&#39;Université du comité d&#39;éthique le soin des animaux d&#39;Ottawa, en respectant les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux. Préparation 1. Pré-chirurgical et Matériaux <ol><li> Plasmide Préparation: <ol><li> Préparation des plasmides en utilisant le Qiagen Megaprep selon le protocole du fabricant. Inoculer au moins 400 ml de bouillon LB avec des bactéries transformées pour assurer un rendement élevé d&#39;ADN et incuber pendant une nuit. </li><li> Remettre en suspension dans le plasmide de 100 à 200 ul de TE jusqu&#39;à une concentration finale d&#39;au moins 5 ug / ul. ADN Aliquoter et conserver à -20 ° C. Si la concentration est trop faible, ne pas précipiter et remettre en suspension comme cela peut ajouter impuretés. Recommencer avec une nouvelle préparation. </li><li> Avant la chirurgie, diluer un seul plasmide (Cre-GFP par exemple) à 2 ug / ul dans de l&#39;eau stérile avec 1 ul de 0,1% (p / v) colorant vert Fast-10 ou par 20 pi de solution de plasmide dilué. Si GFPet le gène d&#39;intérêt sont à co-électroporation sur des plasmides séparés, injecter le plasmide GFP et le plasmide portant le gène d&#39;intérêt à un ratio de 1: 4 à maximiser la probabilité que toutes les cellules marquées à la GFP sont co-électroporation à la fois plasmides. </li></ol></li><li> Tirez tubes microcapillaires de verre (diamètre extérieur de 1 mm - ci-après dénommé aiguilles) sur un extracteur de aiguille standard, en utilisant une seule étape de traction à 62 ° C. </li><li> Autoclave un pack contenant les chirurgicale suivante: porte-aiguilles, écarteur de plaie, pinces, ciseaux pour la chirurgie, ciseaux pour aiguilles, agrafeuse, agrafes, de la gaze, des couvertures de plaies, champs opératoires (figure 1A, B; Tableau Matériaux). </li><li> Recueillir d&#39;autres outils nécessaires: électroporateur, FemtoJet Microinjecter, Tweezertrodes (5 ou 7 mm), une solution saline, suture, 5 ml seringue (Tableau Matériaux). </li></ol> 2. Préparer la souris pour la chirurgie <ol><li> Pour la gestion de la douleur, injecter un p-chronométrérégnante souris avec la buprénorphine (0,05 mg / kg de poids corporel) une heure avant la chirurgie. Appliquer ce protocole à des souris chronométrés ne importe où de jour embryonnaire 12,5 (E12.5) E17.5 à. </li><li> Utilisez microloader embouts de pipette pour sauvegarder charge tiré aiguilles avec la solution de plasmide. Ne remplissez pas tout le chemin dans la pointe de l&#39;aiguille encore car cela provoquerait l&#39;aiguille à se obstruer. </li><li> Anesthésier la souris en utilisant 2-5% de gaz isoflurane avec 1 L / min O 2. Une fois immobile, placer dans masque et appliquer une pommade pour les yeux pour éviter le dessèchement. Injecter avec 1 ml de solution saline (NaCl 0,9%) sous-cutanée dans le dos. REMARQUE: Lorsque vous travaillez avec le gaz isoflurane, utiliser un piégeur de gaz pour reprendre le gaz en excès et l&#39;empêcher de se échapper dans la pièce. </li><li> Rasez abdomen. Laver abdomen avec Chlorohexadine gommage, rincer à l&#39;eau, et appliquer une solution de préparation finale de chlorohexadine et 70% d&#39;éthanol. Couverture souris avec drap stérile ou de gaze pour couvrir la fourrure, tout en laissant exposée abdomen (figure 1C, D). </li></ol>In utero électroporation <ol><li> Faire une incision dans la peau sur l&#39;abdomen entre les tétines inférieurs. Tirez la peau loin de la couche de muscle sous-jacent en déchirant le tissu conjonctif, puis couper à travers le péritoine dans la cavité abdominale le long de la ligne blanche. Insérez l&#39;écarteur de plaie de tirer les bords de la plaie de l&#39;autre. </li><li> Enlever l&#39;utérus de la cavité abdominale et l&#39;étendre comme illustré (Figure 1E). <ol><li> Si différents chiots doivent être injectés avec différents plasmides (telles que GFP vs GFP avec le gène d&#39;intérêt), compter les petits de chaque côté et décider lesquels et combien d&#39;injecter avec chaque plasmide. Remplacer un côté de l&#39;utérus dans l&#39;abdomen de conserver les embryons tiède et lubrifié. Immédiatement humidifier l&#39;utérus exposé avec une solution saline (de préférence chauffé à la température du corps). </li><li> Si l&#39;injection de tous les petits avec le même plasmide (comme lors de l&#39;injection Cre-GFP dans des embryons transgéniques) ONLy retirer une corne de l&#39;utérus à la fois. </li></ol></li><li> Mettez une aiguille chargée dans la tête de préhension de la baguette d&#39;injection et soigneusement couper la pointe avec une paire de petits ciseaux chirurgicaux ou pinces fines. Couper l&#39;extrémité sorte que l&#39;aiguille reste le plus longtemps possible tout en permettant au fluide de passer à travers (Figure 1Ji-iv). <ol><li> Ajuster la longueur de l&#39;injection (en secondes) et la pression d&#39;injection sur le micro-injecteur de sorte qu&#39;une petite goutte encore bien visible de de 0,1 à 0,2 pi apparaît sur la pointe de l&#39;aiguille lorsque la palette de pied est pressé. Gardez le volume de cette goutte aussi cohérentes que possible entre les différentes aiguilles. REMARQUE: cette étape est cruciale pour la survie de l&#39;embryon (voir la discussion). </li><li> Utilisez les paramètres d&#39;injection suivantes pour la FemtoJet: injecter la pression (pi) = 250-300 hPa; temps d&#39;injection (ti) = 0,8-1,2 sec; pression de compensation = 10-50 hPa. Si nécessaire, ajuster ces paramètres pour accueillir la variation entre les aiguilles. </li></ol></li><li> Sélire un embryon et positionner doucement sur ​​le dos, la tête inclinée vers le haut (figure 1F). NOTE: Cela peut nécessiter de tourner ou de déplacer l&#39;embryon; attention à ne pas appliquer trop de pression et d&#39;éviter la rupture du sac amniotique lors de la manipulation de l&#39;embryon. </li><li> Une fois que l&#39;embryon est en place, recherchez le ventricule, qui présente comme une ombre en forme de croissant parallèlement à la sinus longitudinal. Touchez la pointe de l&#39;aiguille dans l&#39;utérus au-dessus du ventricule à un léger angle et de guider l&#39;aiguille à travers la paroi utérine. La quantité de pression requise dépend de la finesse de l&#39;aiguille. Poussez l&#39;aiguille à travers le cortex dans le ventricule. REMARQUE: Bien qu&#39;il y ait rarement une résistance détectable supplémentaire, la tête de l&#39;embryon est souvent repoussé légèrement puis recule que l&#39;aiguille traverse le cortex dans le ventricule. </li><li> Pomper le paddle pieds pour injecter la solution de plasmide. Continuez à pomper jusqu&#39;à ce qu&#39;un espace vert est visible et est conforme à laforme d&#39;arc du ventricule (figure 1G). Chez les jeunes embryons (E12.5 à E14.5) le colorant sera souvent diffuser dans le ventricule controlatéral. NOTE: Le nombre de pompes est fonction du diamètre de la pointe d&#39;aiguille, l&#39;âge de l&#39;embryon (taille et résultant du ventricule) et le volume d&#39;injection souhaitée. Gardez le volume injecté aussi cohérentes que possible entre les embryons. </li><li> Injecter trois ou quatre embryons. Conservez tous les embryons exposés humides avec une solution saline long de la procédure. </li><li> Retour aux premiers embryons injectés et placer les palettes de telle sorte que l&#39;électrode positive tirera le plasmide dans la région désirée du cerveau (figure 1H). Angle de l&#39;électrode négative de sorte que le chemin le plus court entre les électrodes passe directement à travers la structure ciblée pour l&#39;électroporation (figure 2). </li><li> Une fois que les palettes sont en place, appliquer le choc. Selon l&#39;âge et la taille des embryons, utiliser cinq impulsions de 35 à 50 V (voir Tmesure 1). Utilisez les paramètres d&#39;électroporation suivants: durée de l&#39;impulsion de 5 ms avec un intervalle de 950 ms d&#39;impulsion. Répéter l&#39;opération avec tous les embryons injectés. </li><li> Couper l&#39;extrémité de la nouvelle aiguille de pré-chargée comme dans l&#39;étape 3.3 comme la dernière aiguille susceptibles séché et obstrué lors de l&#39;étape 3.9. Injecter la prochaine série de trois ou quatre embryons avec soit le même plasmide ou un plasmide différent et puis appliquer le choc comme dans l&#39;étape 3.9. Lorsque tous les chiots dans un côté de l&#39;utérus sont injectés, retirez le deuxième côté de l&#39;utérus de l&#39;abdomen de la femelle et puis remplacez le côté rempli à garder au chaud. </li><li> Retour des deux côtés de l&#39;utérus à la femelle en faisant attention de garder la surface humide avec une solution saline et de ne pas appliquer trop de pression pour éviter le traumatisme des sacs amniotiques. Suturer la couche musculaire fermé en utilisant un point simple et continu. Staple la peau fermé. Si les agrafes ne sont pas disponibles, suturer la peau avec un point interrompu simple. (Figure 1I) </li><li> Alors que suturing, tourner progressivement jusqu&#39;à l&#39;isoflurane pour permettre l&#39;anesthésie de la femme enceinte pour éclaircir. NOTE: Ce sera d&#39;accélérer l&#39;excitation du barrage après la chirurgie est terminée; garder la femelle anesthésié pour une durée aussi courte que possible permettra d&#39;améliorer la survie de l&#39;embryon. Temps de la chirurgie totale, à partir de quand la femelle est d&#39;abord anesthésié, doit être d&#39;environ 30 min. </li></ol> 4. Entretien <ol><li> Placez la femelle suturé dans un incubateur ou sur un coussin chauffant pour remettre de l&#39;anesthésie. Son lit sur la literie propre et placer un gel de récupération standard dans la cage à maintenir l&#39;hydratation. Pour la gestion de la douleur après la chirurgie, donner les trois femmes doses de buprénorphine (0,05 mg / kg de poids corporel) à des intervalles de 8 h après la chirurgie, puis quatre doses supplémentaires à intervalles de 12 h. </li></ol> 5. Brains de récolte NOTE: Brains peuvent être récoltées à tout âge jusqu&#39;à l&#39;âge adulte. Ce qui suit se appliquepour la collecte cerveaux avant la naissance. Notez qu&#39;une fois chiots sont nés, l&#39;ordre dans l&#39;utérus est perdu, donc soit chaque chiot dans la litière doit être injecté avec le même plasmide, ou une autre méthode de différencier entre le contrôle et les animaux de laboratoire doit être conçu. <ol><li> Préparer froid (4 ° C), on filtre 4% de paraformaldehyde (PFA) avant l&#39;euthanasie femelle. </li><li> Euthanasier la femelle en utilisant une injection intraperitoneale d&#39;une dose létale de pentobarbital de sodium (100 mg / kg de poids corporel) et couper abdomen ouvert. Tirez sur les deux côtés de l&#39;utérus et de jeter départ comme à chiots ont d&#39;abord été injectés. <ol><li> Dans le cas où tous les chiots ont reçu le même plasmide, comme lors de l&#39;injection Cre dans une litière transgénique, afin d&#39;embryons ne est pas important, donc coupé l&#39;utérus de la femme et sa place dans PBS. </li><li> Si les chiots ont été injectés avec des plasmides différents, veillez à placer chaque chiot, en notant les petits morts, et de déterminer quels sont ceux qui ont été injectés avec le contrôle et expériplasmides Tal avant de retirer l&#39;utérus de la femelle. Soyez prudent de garder une trace des chiot appartient à quel groupe après l&#39;utérus est en PBS. </li></ol></li><li> Retirez chaque chiot individuellement, décapiter avec des ciseaux pointus ou une lame de rasoir et placez la tête dans du PBS. Dans le cas des souris transgéniques, prélever des échantillons de tissus pour le génotypage et de garder chaque tête séparée, comme dans une plaque de 12 puits. </li><li> Sous un microscope à dissection, retirez le cerveau du crâne, en faisant attention de ne pas entailler le cortex ou déchirer la ligne médiane. En utilisant un microscope à fluorescence, vérifier pour voir si cerveaux ont une GFP + patch, ce qui indique qu&#39;ils ont été électroporées avec succès. </li><li> Fixer cerveau par immersion dans PFA à 4 ° C jusqu&#39;au lendemain. REMARQUE: Vérifiez cerveaux pour l&#39;expression de la GFP avant la fixation depuis PFA désaltère souvent le signal. </li><li> Cryoprotect cerveau par immersion dans 20% de saccharose pendant au moins trois jours avant la congélation. Utiliser un gradient de saccharose de 10%, 15% et 20% (24 h dans chaque solution) to éviter d&#39;endommager les tissus en raison de la pression osmotique. Rangez cerveaux congelés à -80 ° C et couper sur un cryostat à 10-14 um sections épaisses. </li></ol> 6. Co-coloration anti-GFP REMARQUE: si la récupération de l&#39;antigène est nécessaire de co-tache avec des anticorps anti-GFP, il est important d&#39;utiliser un protocole de récupération antigène doux qui ne compromet pas le signal de la GFP. Certains protocoles de recherche d&#39;antigène sont trop dures à utiliser en conjonction avec la GFP coloration (même avec un anticorps contre GFP). Un acide citrique de base pré-traitement avant l&#39;application de l&#39;anticorps primaire est couronnée de succès pour la plupart des epitopes 24. <ol><li> Préparer une solution 0,01 M d&#39;acide citrique dans ddH 2 O. pH 6 à l&#39;aide d&#39;un pH-mètre étalonné. </li><li> La chaleur de l&#39;acide citrique dans la chambre à micro-ondes ou coloration bain d&#39;eau jusqu&#39;à ce que l&#39;acide citrique atteint 75 à 80 ° C. Mettez les diapositives dans la chambre coloration pendant 10-15 min. Maintenir la température la plus stable possible. </li><li> Laver les lames dans du PBS3x pendant 3 min à température ambiante. Appliquer l&#39;anticorps primaire et procéder à immunocoloration selon un protocole standard. </li><li> Validate excision médiée par Cre par co-marquage pour la GFP et le gène d&#39;intérêt afin de confirmer abattre (figure 3A). </li></ol>

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<li>Ferland, R. J., Cherry, T. J., Preware, P. O., Morrisey, E. E., Walsh, C. A. Characterization of Foxp2 and Foxp1 mRNA and protein in the developing and mature brain. 460 (2), 266-279 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à révéler

Deux des principaux défis dans l&#39;exécution de électroporations in utero sont 1) la prévention embryocides et 2) en diminuant la variabilité entre électroporations. Un des facteurs les plus importants dans la prévention de létalité est la qualité de l&#39;aiguille, comme aiguilles émoussées infligent plus de dommages à l&#39;embryon. Lors de la coupe de l&#39;aiguille, gardez la pointe le plus longtemps possible tout en permettant une gouttelette visible de 0,1 à 0,2 pi de fluide à apparaître à la s...

La migration radiale est un processus au cœur du développement cortical précoce. Il dépend de divers facteurs autonomes portables, tels que sortie correct mitotique et la différenciation neuronale, la polarité cellulaire, régulation de la dynamique du cytosquelette et l&#39;expression de récepteurs transmembranaires, ainsi que des facteurs autonomes non cellulaires, tels que la formation de l&#39;échafaudage gliale radial et la sécrétion d&#39;orientation migratoire molécules 1-3. Depuis la perturbation de l&#39;un de ces mécanismes peut nuire à la migration neuronale dans un modèle de souris transgénique 4-8, déterminer la cause sous-jacente d&#39;un défaut dans la migration peut être un processus complexe et difficile. In utero électroporation (IUE) peut être utilisé pour compléter et simplifier interprétation du phénotype d&#39;un modèle knock-out génétique et donc à élucider les mécanismes importants nécessaires pour la migration radiale 7,9-11. In utero électroporation (IUE) est le processus par lequel un plasmide carryi<html> ng à la fois un gène d&#39;intérêt et un rapporteur est injectée dans le ventricule du cerveau d&#39;un embryon de souris ou de rat, puis aspiré dans les cellules qui tapissent le ventricule par l&#39;utilisation d&#39;un courant électrique 14.12. Cela permet à l&#39;enquêteur d&#39;analyser l&#39;effet de haut ou le bas régulation d&#39;un gène d&#39;intérêt dans le développement ou la fonction des neurones électroporation. Après IUE, cerveaux peuvent être traitées pour l&#39;immunohistochimie 7,9-11, électrophysiologie 15 ou culture cellulaire 16,17. L&#39;avantage majeur de l&#39;IUE est qui est permet une manipulation très spécifique de l&#39;expression génique. En outre, IUE peut être utilisé pour cibler une région spécifique du cerveau en développement à travers un courant dirigé (Figure 2). IUE peut également être utilisé pour cibler un type cellulaire particulier par l&#39;injection des plasmides portant des gènes sous le contrôle de différents promoteurs ou des systèmes d&#39;activation de plasmide (tetracycline induit l&#39;expression du gène est un exemple) 10,18-21. jove_content &quot;&gt; IUE peut être utilisé en conjonction avec le système d&#39;excision à médiation par le gène Cre-Lox 7-9,11,22. Un plasmide contenant un gène codant pour la transmission pour la protéine Cre peut être une électroporation dans des embryons homozygotes pour l&#39;allèle floxé ( dans lequel les régions de gènes ou d&#39;ADN spécifique sont flanquées par deux sites loxP pour la Cre médiation par recombinaison de l&#39;ADN). Cre alors induire une recombinaison du gène d&#39;intérêt spécifiquement dans des précurseurs neuraux électroporation, la génération d&#39;un knock-out de la floxée allele.The effet de protéines knockdown sur la migration neuronale et le développement dans les neurones individuels peut alors être étudié. électroporation de Cre induit recombinaison que dans une petite population de cellules touchées, laissant l&#39;environnement soutien intact. En revanche, expression tissulaire spécifique de Cre sous le contrôle d&#39;un type spécifique de cellules promoteur, se produit tout au long de l&#39;ensemble du tissu de sorte que les deux neuroblastes en migration et le milieu environnant pourraient être affectées. Ainsi, juxtaposition de ces deux approches peut déterminer si un défaut de migration donné est due à la cellule mécanismes non autonomes ou autonomes cellulaires. Migration défectueux dans les deux systèmes expérimentaux suggèrent que les résultats de phénotype observé à partir d&#39;un mécanisme autonome de cellules; migration normale après électroporation avec Cre de migration défectueux dans un modèle Cre spécifique des tissus indique que le gène d&#39;intérêt agit par l&#39;intermédiaire d&#39;un mécanisme autonome non-cellulaire. IUE peut également être utilisé pour effectuer des expériences de sauvetage par électroporation gènes interagissent potentiels en assommer les animaux 7,9,10. Par exemple, un enquêteur pourrait tenter de sauver un phénotype de migration dans un modèle transgénique par électroporation d&#39;une cible en aval et de déterminer si le défaut de migration est corrigé dans les neurones électroporation. Ceci présente l&#39;avantage supplémentaire que un sauvetage réussi indique que la migration normale peut être restaurée en manipulant l&#39;expression des protéines dans une SPEneurone cifique, bien que le milieu environnant est encore déficiente pour le gène ciblé. Encore une fois, cette approche est plus de temps et plus rentable que de traverser ou de générer des lignées transgéniques, avec l&#39;avantage supplémentaire de déterminer si le mécanisme défectueux est une cellule autonome. IUE peut être utilisé pour suivre la migration des neurones par électroporation d&#39;un plasmide rapporteur dans assommer embryons (Figure 4C). Comme seuls les neurones qui tapissent le ventricule au moment de la chirurgie sont électroporées 17, IUE peut être utilisé pour suivre les neurones nées à un moment précis avec l&#39;avantage de la visualisation de la morphologie in vivo. Enfin, il est possible d&#39;utiliser IUE pour cibler des régions cérébrales telles que le télencéphale dorsal medial ou, de l&#39;hippocampe ou de l&#39;éminence ganglionnaire (figure 2). Cela donne chercheurs le pouvoir d&#39;enquêter fonction du gène dans une zone spécifique indépendant de complications Résultattion de protéine knockdown dans des structures voisines. protéine du rétinoblastome (PRB), p107 et p130 comprennent la famille des protéines de poche et sont des régulateurs de la sortie du cycle cellulaire bien établie. Cependant, il ya plus de preuves que ces protéines régulent également cycle cellulaire aspects indépendants du développement neuronal. Comme nous l&#39;avons montré précédemment, PRB et p107 jouent un rôle crucial à la fois tangentielle 4,23 et la migration radiale 6. Ici, nous démontrons le rôle des protéines de poche membres de la famille pRb et p107 sur la migration neuronale 6 pour illustrer l&#39;utilisation de électroporation in utero de Cre dans un modèle transgénique. En résumé, IUE fournit un moyen puissant d&#39;analyse des effets de cellules autonomes de délétion du gène (ou la surexpression). Lorsqu&#39;il est combiné avec tissu spécifique assommer modèles, IUE peut fournir des informations supplémentaires concernant les mécanismes de contrôle de la migration neuronale.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 Électroporateur à ondes carrées</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0052</td><td>Électroporateur uniquement &ndash ; achetez les câbles séparément (45-0204)</td></tr><tr><td>1250FS Pédale pour ECM 830</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0211</td><td>Une pagaie est nécessaire pour l’électroporation mains libres</td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0489 (5mm)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 45-0488 (7mm)</td><td>Électrodes de style pince en platine</td></tr><tr><td>Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td>920010504</td><td>Microinjecteur</td></tr><tr><td>Griphead 0</td><td>Eppendorf</td><td>920007414</td><td>Maintient l’aiguille</td></tr><tr><td>tirée Support capillaire universel</td><td>Eppendorf</td><td>920007392</td><td>Connecte la tête de préhension au tube d’injection</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>920007431</td><td>Relie le support capillaire au Femtojet</td></tr><tr><td>Pédale de commande</td><td>Eppendorf</td><td>920005098</td><td>Palette de pied pour l’injection mains libres</td></tr><tr><td>Embouts de microchargeur</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>pour le chargement des tubes capillaires tirés</td></tr><tr><td>Plasmid Mega Kit</td><td>Qiagen</td><td>12181</td><td>5 QIAGEN-tip 2500, Réactifs, Tampons</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td>Colorant non toxique</td></tr><tr><td>Ciseaux de Bonn extra fins</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>14084-08</td><td>Pour couper les aiguilles</td></tr><tr><td>Ciseaux à strabisme Bonn</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinces Graefe</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Écarteurs Colibri</td> droits <td>Outils pour les sciences fines</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Agrafeuse</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>12031-07</td><td>Pour clips</td></tr> <tr><td>de 7 mmCastroviejo Porte-aiguille Outils</td><td>médicaux</td><td>SNH-6737</td><td>Droit, avec serrure</td></tr><tr><td>Extracteur d’aiguille</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>Pour tirer des microcappillars</td></tr><tr><td>Microcapillaires</td><td>Drummond</td><td>1-000-800</td><td>Tubes capillaires en verre de 0,4 mm de diamètre intérieur</td></tr></tbody></table>

l'induction de la protéine de suppression grâce in utero Électroporation à définir déficits migration neuronale dans des modèles transgéniques

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Deletion génétique en utilisant le système Cre-Lox dans des lignées de souris transgéniques est un outil puissant utilisé pour étudier la fonction des protéines. Cependant, à l&#39;exception des modèles Cre très spécifiques, la deletion d&#39;une protéine dans l&#39;ensemble d&#39;une population de tissus ou de cellules conduit souvent à des phénotypes complexes résultant de l&#39;interaction de plusieurs mécanismes. Déterminer si un phénotype résultats de perturbation d&#39;un mécanisme autonome de la cellule, qui est intrinsèque à la cellule en question, ou d&#39;un mécanisme autonome non-cellulaire, qui résulterait de la dépréciation de l&#39;environnement de cette cellule, peuvent être difficiles à discerner. Pour mieux comprendre la fonction des protéines dans un contexte in vivo, in utero électroporation (IUE) permet la suppression de gène dans un petit sous-ensemble de cellules dans le cortex développement ou une autre région du cerveau sélectionné. IUE peut être utilisé pour cibler des zones spécifiques du cerveau, y compris le télencéphale dorsal, télencéphale médial, hippocampe, ou éminence ganglionnaire. Ceci facilite l&#39;observation of les conséquences de cellule autonome deletion des gènes dans le contexte d&#39;un environnement sain. L&#39;objectif de ce protocole est de montrer comment IUE peut être utilisé pour analyser un défaut dans la migration radiale dans une lignée de souris transgéniques floxé, en mettant l&#39;accent sur la distinction entre les effets cellulaires autonomes autonomes et non-cellulaire de la protéine suppression. En comparant le phénotype résultant de la délétion des gènes dans l&#39;ensemble du cortex par rapport à deletion de gène à médiation par IUE dans une population de cellules limité, mieux comprendre la fonction des protéines dans le développement du cerveau peuvent être obtenus qu&#39;en utilisant soit la technique de façon isolée.

Différentes régions du cerveau peuvent être ciblées par électroporation en modifiant l'orientation des électrodes à palette au-dessus de la tête de l'embryon (Figure 2). Pour toutes les parties du prosencéphale, le plasmide est injecté dans le ventricule latéral (le rhombencéphale peut être ciblé en injectant dans le quatrième ventricule). En général, positionnez les électrodes de sorte que la ligne droite les reliant traverse la région d'intérêt, l'ADN étant attiré vers l'électrode positive. Pour cibler...

La migration des neurones est régulée par de nombreux facteurs autonomes cellulaires et non cellulaires. Ce protocole montre comment l’électroporation in utero peut être utilisée pour déterminer si un phénotype chez une souris transgénique est dû à une perturbation d’un mécanisme intrinsèque cellulaire ou à une altération de l’interaction entre le neurone et son environnement.

L'induction de la protéine de suppression Grâce In Utero Électroporation à Définir déficits migration neuronale dans des modèles transgéniques

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

L’objectif général de l’expérience suivante est d’analyser les défauts de développement et de migration neuronales dans des modèles de souris transgéniques en utilisant l’électroporation in utero de diverses régions du cerveau antérieur embryonnaire. Ceci est réalisé en injectant un plasmide portant des gènes pour Cree et une protéine rapporteure comme la GFP dans le ventricule d’un cerveau embryonnaire et en appliquant un courant électrique à la tête pour attirer ce plasmide dans la muqueuse cellulaire du ventricule. Dans un deuxième temps, les embryons sont renvoyés dans la cavité abdominale de la mère pour permettre aux embryons de continuer à se développer tandis que le pli exprime et médie l’excision de gènes spécifiquement dans les neurones électroporés.Ensuite, les embryons sont collectés et les cerveaux sont fixés pour être analysés afin de déterminer l’effet de l’excision du gène médiée par l’ERC et de l’inactivation ultérieure des protéines dans les neurones électroporés. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les lignées CRE transgéniques spécifiques aux tissus, est que l’électroporation de Cree excise le gène d’intérêt uniquement à partir d’une petite population de neurones dans une région du cerveau choisie par le chercheur, ce qui simplifie grandement les résultats et facilite l’analyse phénotypique. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle car les étapes chirurgicales peuvent être très difficiles à apprendre, et les embryons à ce stade sont très délicats et faciles à endommager par inadvertance.Avant la chirurgie, diluez un seul plasmide à deux microgrammes par microlitre dans de l’eau stérile avec un microlitre de colorant vert rapide à 0,1 % en poids par volume pour 10 ou 20 microlitres de solution plasmidique diluée. Ensuite, tirez les microtubes capillaires en verre sur une micro-pipette polaire standard à 62 degrés Celsius en un seul pas. Utilisez ensuite les pointes de pipette du micro-chargeur pour charger les aiguilles tirées avec une solution plasmidique.Ne remplissez pas complètement la pointe de l’aiguille, car cela entraînerait l’obstruction de l’aiguille. Dans cette procédure, faites une incision dans la peau au-dessus de l’abdomen entre les tets inférieurs d’une souris enceinte anesthésiée. Retirez la peau de la couche musculaire sous-jacente en déchirant le tissu conjonctif.Ensuite, coupez à travers le péritoine dans la cavité abdominale le long du coude linéaire. Insérez l’écarteur de plaie pour écarter les bords. Retirez ensuite l’utérus de la cavité abdominale et disposez-le comme indiqué.Si différents chiots doivent être injectés avec différents plasmides, comptez les chiots de chaque côté et décidez lesquels et combien injecter avec chaque plasmide, renvoyez un côté de l’utérus dans l’abdomen pour garder les embryons chauds et lubrifiés, humidifiez immédiatement l’utérus exposé avec une solution saline chaude. Ensuite, placez une aiguille chargée dans la tête de la lance d’injection. Coupez soigneusement la pointe à l’aide d’une paire de petits ciseaux chirurgicaux ou d’une pince fine de manière à ce que l’aiguille reste le plus longtemps possible tout en laissant passer le liquide.Ajustez ensuite la durée d’injection et la pression d’injection sur le micro-injecteur de manière à ce qu’une gouttelette petite mais facilement visible de 0,1 à 0,2 microlitre apparaisse sur la pointe de l’aiguille. Lorsque la pédale est enfoncée, maintenez le volume de cette gouttelette aussi constant que possible entre les différentes aiguilles. Sélectionnez maintenant un embryon et positionnez-le doucement sur le dos, la tête inclinée vers le haut.Une fois l’embryon en place, localisez le ventricule, qui se présente comme une ombre en forme de croissant parallèle au sinus sagittal. Touchez l’utérus au-dessus du ventricule légèrement incliné avec la pointe de l’aiguille et guidez l’aiguille à travers la paroi utérine. Poussez ensuite l’aiguille à travers le cortex jusqu’au ventricule.Ensuite, pompez la pédale pour injecter la solution plasmidique. Continuez à pomper jusqu’à ce qu’une zone verte soit visible et qu’elle s’adapte à la forme de l’arc du ventricule. Chez les jeunes embryons, le colorant se diffuse souvent dans le ventricule controlatéral.Injectez environ trois ou quatre embryons au total et gardez tous les embryons exposés humides avec une solution saline tout au long de la procédure. En commençant par le premier embryon injecté, placez les palettes de manière à ce que l’électrode positive attire le plasmide dans la région souhaitée du cerveau. Inclinez l’électrode négative de manière à ce que le chemin le plus court entre les électrodes passe directement à travers la structure ciblée pour l’électroporation.Une fois les palettes en place, appliquez le choc. Selon l’âge et la taille des embryons, utilisez cinq impulsions de 35 à 50 volts, une durée d’impulsion de cinq millisecondes et un intervalle d’impulsion de 950 millisecondes. Pour l’électroporation, répétez l’opération avec tous les embryons injectés.Ensuite, retournez les deux côtés de l’utérus à la souris. Veillez à garder la surface humide avec du sérum physiologique et à ne pas appliquer trop de pression pour éviter un traumatisme au saxophone amniotique. Ensuite, suturez la couche musculaire à l’aide d’un simple point continu.Agrafez ensuite la peau fermée. Préparez maintenant quatre degrés Celsius filtrés à 4 % PFA. Après avoir euthanasié l’animal par injection intrapéritonéale d’une dose létale de pentobarbital sodique, ouvrez l’abdomen.Ensuite, tirez les deux côtés de l’utérus et disposez-les comme lorsque les chiots ont été injectés pour la première fois. Si les chiots ont reçu des injections avec différents plasmides, assurez-vous de localiser chaque chiot en notant les chiots morts, et de déterminer lesquels ont été injectés avec des plasmides témoins et expérimentaux. Avant de retirer l’utérus de la femelle, retirez chaque petit de l’utérus et du sac amniotique individuellement.Décapitez avec des ciseaux tranchants ou une lame de rasoir, et placez la tête dans du PBS. Dans le cas des souris transgéniques, prélevez des échantillons de tissus pour le génotypage et gardez chaque tête séparée, comme dans une plaque à 12 puits sous une lunette de dissection, retirez le cerveau du crâne, en prenant soin de ne pas entailler le cortex ou déchirer la ligne médiane. À l’aide d’un microscope fluorescent, vérifiez si les cerveaux ont un patch positif à la GFP, indiquant qu’ils ont été électroporés avec succès.Ensuite, fixez les cerveaux dans PFA à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Maintenant, chauffez l’acide citrique là où le pH était précédemment réglé à six dans une chambre de coloration au micro-ondes ou au bain-marie jusqu’à ce qu’il atteigne 75 à 80 degrés Celsius. Ensuite, placez les lames dans la chambre de coloration pendant 10 à 15 minutes.Ensuite, lavez les lames en PB S3 fois pendant trois minutes, à chaque fois à température ambiante. Appliquez l’anticorps primaire et procédez à l’immunocoloration selon un protocole standard. Validez ensuite l’excision médiée par l’ERC par co-marquage de la GFP et du gène d’intérêt pour confirmer l’inactivation.Cette figure montre la confirmation de l’excision médiée par l’ERC par coloration pour une cible en aval du gène supprimé. Les embryons floqués RB Flocked, P 1 0 7 knockout P one 30 ont été électroporés avec le plasmide PCI double vide ou le plasmide Cree PCI deux et colorés pour la GFP et le KI 67. Un marqueur de la prolifération cellulaire.Des cellules doublement colorées ont été observées dans les neurones, électroporées avec Cree, mais pas dans les neurones. Électroporé avec psig. Deux seulement.L’excision de RB a également été confirmée par PCR avec des amorces de génotypage sur l’ADN extrait des coupes de tissus retirées des lames. La bande supérieure représente l’allèle flox F et la bande inférieure représente l’allèle de type sauvage. La flèche indique l’allèle excisé dans la face électroporée du cerveau.Seule l’excision médiée par l’ERC peut également être confirmée in vitro à l’aide de plasmides à codons d’arrêt floqués. En amont des RFP tels que NL DS Red, le RFP n’est exprimé que dans les cellules EK lorsqu’il est transfecté avec Cree GFP dans les cellules HEK 2 93, ce qui indique que l’excision a été réussie Suite à cette technique. D’autres méthodes telles que la culture cellulaire, l’immunohistochimie ou l’électrophysiologie peuvent être utilisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant le développement et la fonction des neurones individuels après l’excision du gène c.Après avoir regardé cette technique, vous pouvez voir comment l’électroporation in utero peut être utilisée pour cibler les différentes régions du cerveau, et cela peut vraiment aider à comprendre certains de ces phénotypes complexes que nous avons avec différents animaux transgéniques.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Électroporation in utero est une méthode utile pour transfecter des cellules progénitrices neuronales in vivo. Selon le placement des électrodes et la période de développement de l'électroporation, certains sous-ensembles de cellules corticales peuvent être ciblées. Cellules ciblées peuvent ensuite être analysées in vivo ou in vitro des effets de l'altération génétique.

In utero électroporation suivie par la culture neuronale primaire pour étudier la fonction des gènes dans un sous-ensemble des neurones corticaux

Électroporation in utero permet la livraison rapide dans un gène spatialement et temporellement contrôlée manière le développement du système nerveux central (SNC). Nous décrivons ici un très adaptables dans le protocole d'électroporation in utero qui peut être utilisé pour livrer des constructions d'expression dans de multiples domaines du SNC embryonnaire, y compris le télencéphale, diencéphale et la rétine.

Livraison efficace de gènes dans les Territoires du SNC multiples à l&#39;aide In Utero L&#39;électroporation

Une méthode de transfert de gènes dans le cerveau de souris en développement est décrit en utilisant une méthode unique de chirurgie et la forme particulière des électrodes. Cette technique unique permet la transfection d'ADN plasmidique temporellement et spatialement, ce qui aidera de nombreux neuroscientifiques à étudier le développement du cerveau.

Souris dans Utero électroporation: contrôlé Transefection Gene spatio-temporelle

Ce protocole décrit en détail comment transfecter spécifiquement différentes régions du système nerveux central C57BL/6 via électroporation in utero. Ce protocole comprend des instructions détaillées pour les transfections de régions qui se développent dans le cortex, l’hippocampe, le thalamus, l’hypothalamus, le noyau septal latéral et le striatum.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, latéral Septal Nucleus- et le striatum spécifique<em&gt; In Utero</em&gt; L&#39;électroporation dans la souris C57BL / 6

Hétérotopie nodulaire périventriculaire (PNH) est la forme la plus courante de malformations du développement cortical (MCD) à l’âge adulte, mais sa base génétique reste inconnue dans des cas plus sporadiques. Nous avons récemment mis au point une stratégie pour identifier les gènes candidats nouveaux pour MCD et de confirmer directement leur rôle causal in vivo.

Une stratégie novatrice alliant CGH-Array, séquençage de l’exome-ensemble et électroporation de In Utero chez les rongeurs afin d’identifier les gènes pour les Malformations du cerveau

Ce manuscrit fournit des protocoles qui utilisent électroporation in utero (IUE) pour décrire la connectivité structurelle des neurones au niveau d'une seule cellule et l'excitabilité des neurones marqués par fluorescence. L'histologie est utilisé pour caractériser dendritique et projections axonales. enregistrement cellules entières en tranches aiguës est utilisée pour étudier l'excitabilité.

In Utero électroporation approches pour étudier l&#39;excitabilité des neurones sous - populations et connectivité unicellulaire

Cellule autonome fonction des gènes dans le cerveau peut être étudiées en induisant la perte ou gain de fonction dans des populations clairsemées de cellules. Nous décrivons ici dans l’utérus l’électroporation pour livrer une recombinase Cre en populations clairsemées de mettre au point des neurones corticaux avec floxed gènes à provoquer une perte de fonction in vivo.

Induisant la recombinaison Cre-lox dans le Cortex cérébral par l’intermédiaire de In Utero électroporation de souris

Ici, nous fournissons une méthode fiable et peu coûteuse pour générer organotypiques électroporation cerveau d’embryons de souris appropriés pour la microscopie confocale et techniques d’imagerie en direct.

Ex Utero Électroporation et culture organotypique tranche de cerveaux de souris embryonnaires pour vivre-imagerie de la migration des interneurones GABAergiques

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Double électroporation in utero pour cibler les populations cellulaires séparées temporellement et spatialement

Dans ce protocole, nous décrivons comment injecter le lentivirus à la cavité amniotique de la souris à E7.5, conduisant à une transduction uniforme de toute la plaque neurale, avec des effets néfastes minimes sur la survie ou le développement embryonnaire.

Ciblage de la plaque neurale murine par nano-injection in utero (NEPTUNE) au jour embryonnaire 7,5

Découvrez l'électroporation in utero pour analyser les déficits de migration neuronale dans des modèles de souris transgéniques. Cette méthode permet de manipuler des gènes spécifiques et d'étudier le développement cérébral.

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