Évaluation de la viabilité de la graisse humaine injection dans des souris nude avec Micro-tomodensitométrie

L’objectif général de cette procédure est de décrire un modèle de souris qui utilise la micro-tomodensitométrie pour comparer la rétention de volume entre les techniques de détachement de préparation et d’administration de greffe de graisse. Ceci est accompli en traitant d’abord la lipo-aspiration humaine pour obtenir de la graisse prête pour la greffe. La deuxième étape consiste à placer des greffes de graisse dans le cuir chevelu de souris nues thymiques CD.

Ensuite, la survie du greffon de graisse est analysée chaque semaine par des souris CT, en reconstruisant les images et en quantifiant la rétention de volume. La dernière étape consiste à explaner la greffe de graisse au bout de huit semaines et à les comparer en poids et en histologie. En fin de compte, la micro-tomodensitométrie et l’histologie sont utilisées pour montrer les différences de qualité et de survie des greffes de graisse.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la pesée des greffons de graisse, est qu’elle permet de visualiser et de quantifier objectivement le volume du greffon de graisse à plusieurs moments après la greffe initiale sans avoir à sacrifier l’animal étudié. Nous avons eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons commencé à utiliser la micro-tomodensitométrie pour analyser les défauts de la calva. L’implication de cette technique est qu’elle offre un modèle chirurgical pour toutes les études évaluant la greffe de graisse, la rétention et la viabilité.

Généralement, les personnes novices dans cette méthode auront du mal car il est difficile de contenir le greffon de graisse dans la bonne position au-dessus du cuir chevelu. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle car les étapes de greffe et de reconstruction sont difficiles à apprendre car il existe de nombreuses étapes auxquelles un petit écart de technique peut modifier le résultat. À l’aide de la procédure Coleman, prélevez du tissu adipeux humain dans les régions de l’abdomen, du flanc et de la cuisse de patientes en bonne santé subissant une liposuccion élective.

Pour traiter la lipo-aspiration pour la greffe, commencez par laisser la graisse se déposer pendant 30 minutes. L’aspiration lipo se dépose généralement en trois couches avec de l’huile en haut, de la graisse au milieu et du sang en bas. Aspirez et jetez la couche d’huile supérieure suivie de la couche de sang inférieure.

Pour éliminer davantage tout liquide tumescent ou débris cellulaires restants, centrifugez la graisse pendant cinq minutes à 350 G et quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, aspirer la couche de sang inférieure et la couche d’huile supérieure se poursuivre. Pour calculer la quantité de graisse nécessaire pour la greffe comme décrit dans le protocole de texte, pour effectuer une greffe de graisse, obtenez des souris femelles homozygotes CD une souris nue.

Pour l’étude expérimentale, choisissez des souris âgées de huit à 12 semaines pour induire une anesthésie. Placez la souris dans une boîte renversante avec 2,5 % de mélange d’oxygène fluoré à raison de deux litres par minute pendant environ 10 minutes lorsque le rythme respiratoire de la souris a ralenti. Confirmez la sédation adéquate avec un pincement des orteils.

Appliquez une pommade ophtalmique lubrifiante vétérinaire sur les deux yeux de la souris et placez le nez de la souris dans un cône nasal, en délivrant un mélange d’oxygène fluoré à 2,5 % ISO à raison d’un à deux litres par minute. Ensuite, installez un champ stérile sous la souris. Ensuite, stérilisez un cuir chevelu avec 2,5 % de povidone iodée, suivi d’une solution d’éthanol à 70 %.

Répétez la stérilisation deux fois de plus. Chargez une seringue à verrouillage de leurre d’un millilitre avec un millilitre de graisse qui a été équilibrée à la température ambiante. Connectez une canule de greffe de graisse de calibre 14 de huit centimètres de long à l’extrémité de la seringue.

Amorcez le système en appuyant sur le piston de la seringue jusqu’à ce qu’il reste entre 200 et 400 microlitres de graisse dans la seringue. Tout en appuyant sur le piston de la seringue, vérifiez que la canule est complètement remplie de graisse en observant la graisse sortir du trou distal de la canule à l’aide d’une pince fine. Soulevez la peau dorsale sur la ligne médiane recouvrant l’aspect le plus dorloté du crâne.

Faites une incision de 1,5 millimètre dans la peau à l’aide de ciseaux fins. Placez une suture en nylon à six oh au milieu de la coupe qui sera ensuite utilisée pour rapprocher les bords de la plaie. Une fois la greffe effectuée, n’attachez pas la suture.

Ensuite, créez une poche sous-cutanée sur le crâne en insérant la canule à travers l’incision cutanée et en passant la canule d’avant en arrière dans un motif en forme d’éventail sur le crâne pour libérer toutes les attaches de tissu conjonctif à la peau sus-jacente une fois la poche créée, positionnez la canule sur la ligne médiane de la souris directement sur le crâne jusqu’à ce que la pointe se trouve à l’aspect théramos de la poche, qui doit se trouver juste derrière une ligne tracée entre les yeux. Injectez lentement la graisse de manière rétrograde, en avançant le piston tout en tirant la canule vers l’arrière. À l’aide d’une pince, rapprochez les bords de la plaie et soulevez-les pour empêcher la graisse de s’écouler de la poche.

Attachez la suture qui a été placée précédemment, en vous assurant que le premier nœud repose légèrement contre la peau. Faites trois autres nœuds carrés et coupez la suture avec une queue de trois millimètres. Retirez la souris de l’anesthésie et procédez à la récupération comme indiqué dans le protocole texte.

Avant d’effectuer le premier examen, calibrez le micro-scanner à l’aide d’un fantôme d’imagerie qui fait la distinction entre l’air, l’eau et l’intensité osseuse. Après l’étalonnage. Placez quatre souris dans le scanner en position ventrale avec deux souris en haut et deux en bas.

Placez-le sur un lit de numérisation. Précédemment construit à partir de seringues de 60 millilitres pour maintenir le corps de la souris et de seringues de 10 millilitres comme cônes nasaux. Confirmez à l’aide d’une image de dépistage que l’ensemble du crâne de la souris, du nez à la première vertèbre cervicale et du haut du crâne à la base du crâne, sera imagé.

Poursuivez l’analyse comme indiqué dans le protocole texte. Ouvrez les images reconstruites avec un logiciel d’analyse d’imagerie micro CT qui permet de créer des régions d’intérêt ou des zones d’intérêt en sélectionnant des voxels à l’aide de seuils d’intensité de pixels. Commencez par charger les images CT reconstruites en vues bidimensionnelles, coronales, axiales et sagittales.

En utilisant la tranche axiale comme guide, naviguez vers la tranche sagittale qui correspond à l’aspect le plus à gauche du greffon de graisse. Sélectionnez un seuil supérieur et inférieur pour l’intensité des pixels qui capture tous les voxels correspondant à la greffe de graisse, mais qui exclut les tissus et les os environnants. Définissez un ROI dans la vue sagittale qui correspond à la greffe de graisse.

En utilisant des seuils d’intensité de pixels préalablement définis, répétez cette procédure tous les cinq tronçons sagittaux en naviguant jusqu’à ce que l’aspect le plus à droite de la greffe soit atteint. Ensuite, interpolez les voxels sélectionnés de tous les ROI 2D en un seul enregistrement 3D combiné du volume de ROI calculé par le logiciel. Effectuez le rendu de l’isosurface 3D pour visualiser le volume final du greffon de graisse.

Lors de l’analyse ultérieure, veillez à ce que les valeurs de seuil maximale et minimale d’intensité des pixels soient identiques à celles utilisées pour l’analyse de référence après que les souris ont été analysées pendant la huitième semaine. Euthanasier les souris comme décrit dans le protocole de texte. Placez la souris dans le champ opératoire à l’aide de ciseaux de ténotomie, ouvrez soigneusement la poche et les attaches de peau et de tissu conjonctif sus-jacentes de la greffe de graisse.

À ce stade, il peut être utile d’exciser une partie de la peau dorsale sus-jacente pour faciliter l’extraction du greffon. Restez aussi près que possible du greffon lors de l’excision afin de minimiser le tissu conjonctif prélevé sur le greffon après l’excision du greffon. Mesurez la masse sur une échelle déchirée avec une précision d’au moins 0,01 gramme.

Les greffes de graisse ont progressivement diminué en volume au cours de l’étude, ce qui a permis d’obtenir une survie moyenne de 62,2 % à la huitième semaine. À la fin de l’échographie de la huitième semaine, chaque greffon de graisse a été extrait en un seul morceau. Un test de somme du rang de Coxin WIL a été utilisé pour comparer la différence entre les mesures de volume de greffe de graisse obtenues par micro-TDM ou calculées à partir de la masse physique.

Aucune différence significative n’a été observée entre ces deux méthodes. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures par séance si elle est correctement exécutée. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de se rappeler d’effectuer les chirurgies et les reconstructions de la même manière à chaque fois que vous suivez cette procédure.

D’autres méthodes telles que l’immunocoloration et Q-R-T-P-C-R peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que la façon dont la vascularisation et l’expression des gènes sont influencées par différentes méthodes de greffe. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de traiter l’aspiration lipo pour la greffe en série, la tomodensitométrie in vivo, l’évaluation de la survie des greffons et l’explication des greffons pour l’histologie du poids, et l’analyse future après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la chirurgie plastique pour explorer la greffe de graisse dans le modèle miroir.