Name: Enhanced réduit Représentation bisulfite séquençage pour lévaluation de méthylation de lADN à la résolution de paires de base (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Découvrez le séquençage bisulfite amélioré à représentation réduite pour l'analyse de la méthylation de l'ADN à résolution de paires de base. Cette méthode combine digestion enzymatique et conversion bisulfite.

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Nous remercions tous les auteurs du rapport original de l’ERRBS. Nous remercions Mame Fall pour l’assistance technique. Nous remercions le Weill Cornell Medical College Epigenomics Core pour ses services techniques et son assistance. Le travail a été soutenu par une bourse Judah Folkman de la Fondation Sass, un K08CA169055 du NCI et un AMFDP12005 ASH-R01HG006798 à FGB, NIH et R01NS076465, un financement des Irma T. Hirschl and Monique Weill-Caulier Charitable Trusts et du consortium STARR (I7-A765) à CEM, et une subvention LLS SCORE (7006-13) à AMM.

Toutes les procédures exécutées sont approuvés par l&#39;École de médecine institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité Université de l&#39;Indiana et suivent Institut national de lignes directrices de la santé. 1. Technique chirurgicale <ol><li> Maintenir une technique aseptique lors de cette procédure en utilisant des gants stériles, des instruments et un champ opératoire stérile selon les directives du NIH 25. Stériliser les outils avant de commencer la chirurgie par eux autoclavage (voir le tableau des réactifs spécifiques / Équipement pour la liste complète). Utiliser un stérilisateur à billes de verre pour stériliser les outils pendant l&#39;opération. </li></ol> 2. Anesthésie et préparation <ol><li> Anesthésier la souris dans une boîte d&#39;anesthésie avec un mélange de 0,9 L / min d&#39;oxygène et 2,5% d&#39;isoflurane utilisant un système de vaporisateur isoflurane vétérinaire. Assurez-vous que la souris ne répond pas à des changements dans la position du corps avant de le retirer de la boîte. </li><li> Appliquer une pommade ophtalmique à l&#39;mouLes yeux de soi pour les protéger du dessèchement. </li><li> Mettez le débit de gaz dans la zone du cône de nez. Placez la souris carrément sur son côté gauche sur un bloc couverte chauffée avec un tampon chirurgical et papier absorbant banc avec son nez et la bouche à l&#39;intérieur du cône. Surveiller en permanence le rythme respiratoire et le taux de la souris et ajuster les niveaux isoflurane selon les besoins (entre 2,5 à 3% d&#39;isoflurane) pour maintenir un niveau adéquat d&#39;anesthésie, et utiliser le pincement de l&#39;orteil réflexe pour confirmer la sédation totale. </li></ol> 3. Approche chirurgicale <ol><li> Aligner et concentrer le stéréoscope avec le champ opératoire. Ajuster le cône de nez et la bande vers le bas de sorte qu&#39;il est positionné le long du bord du champ visuel. </li><li> Avec la souris couché sur le côté gauche, la bande du bord de l&#39;oreille droite à le cône de nez, exposant la zone située derrière l&#39;oreille où l&#39;incision sera faite. Assurez-vous que la veine auriculaire postérieure se déplace horizontalement à travers l&#39;oreille. Notez que le placement correct de til animale et enregistrement de l&#39;oreille sont cruciales afin de trouver rapidement le nerf facial. </li><li> Mouiller la fourrure sur et derrière l&#39;oreille avec 70% d&#39;éthanol et de se raser le site chirurgical aide d&#39;un rasoir ou un scalpel lame. Prémouillage la fourrure facilite le rasage à cet endroit anatomique. </li><li> Nettoyer la peau avec une solution d&#39;iode, telles que le lavage chirurgical Betadine (7,5% de povidone-iode), suivie de 70% d&#39;éthanol. Répéter ce nettoyage deux fois plus pour désinfecter soigneusement la zone. </li><li> Pour déterminer où faire l&#39;incision, oligo la veine auriculaire postérieure de l&#39;oreille caudale vers la zone postérieure de la protubérance de l&#39;oreille. Avec des ciseaux de printemps, faire une incision de 4 mm 2 - 3 mm en arrière à la protubérance. </li><li> Disséquer par la graisse sous-cutanée et le fascia utilisant dissection. Evitez de couper direct avec les ciseaux, car les vaisseaux sanguins ou les tissus musculaires peuvent être facilement endommagés. </li><li> En cas de saignement, appliquer une pression sur le site chirurgical avec un coton-tige stérilependant au moins 30 sec. Si la perte de liquide importante se produit, injecter la souris par voie intraperitoneale avec 0,5 ml de solution saline stérile à 0,9% en utilisant une aiguille G 25 ou 27. </li><li> Utilisez plusieurs sites clés, le nerf spinal, canal de l&#39;oreille, et antérieure digastrique (décrit ci-dessous), pour localiser le nerf facial. Disséquer autour de ces sites jusqu&#39;à ce que les branches du nerf facial sont visualisés. Le nerf apparaît comme une structure solide blanc importante quand il se est révélé et une couche de fascia adhère à des structures sous-jacentes. <ol><li> Trouver le nerf spinal, qui se déplace de la partie caudale du crâne pour innerver le muscle trapèze, une fois que la graisse sous-cutanée et le fascia ont été disséqués. Le nerf facial est profonde du nerf spinal. </li><li> Trouvez le conduit auditif cartilagineux qui ressemble blanc nacré et peut être vu rostrale du nerf facial. </li><li> Trouver le ventre musculaire du muscle digastrique antérieure qui se trouve sur le dessus et caudal du nerf facial. </li></ol></li><li> Lorsque les principales branches du nerf facial sont visualisées, les tracer le dos pour trouver leur origine du foramen stylomastoïdien. En utilisant une pince fine pointe de Dumont # 5/45 pour maintenir le site chirurgical ouvert, avancer les conseils printemps ciseaux suivants le chemin de nerf, puis déplacez la pince le dos pour garder la zone nouvellement ouverte avancée. </li><li> Visualisez le tronc du nerf facial avec le zygomatique, buccale et branches mandibulaires marginaux à ce point. REMARQUE: La branche temporelle sera trouvé plus près des foramen. Les branches nerveuses mandibulaires marginaux dans ses parties supérieure et inférieure de plus près à la mâchoire, ainsi ces branches nerveuses ne seront pas visibles à ce niveau. <ol><li> Si l&#39;exécution d&#39;une transection du nerf, de stabiliser le nerf doucement avec les pinces fines de pointe et de couper le nerf avec les ciseaux à ressort. Éviter d&#39;appliquer trop de traction du nerf avec la pince pour empêcher avulsing le nerf partir du tronc cérébral. Pousserles souches de distance les uns des autres, ou couper et enlever une partie du nerf distale pour se assurer qu&#39;aucun reconnexion peut se produire. </li><li> Si l&#39;exécution d&#39;une lésion par écrasement, utiliser Dumont # 5/45 pince pour comprimer le nerf pendant 30 secondes en utilisant une pression constante pour rompre tous les axones, puis répétez cette cohue à un second angle perpendiculaire à la première place à l&#39;écrasement. Eviter d&#39;appliquer des quantités variables de pression pendant la cohue de 30 secondes, sinon la blessure ne sera pas uniforme entre les animaux. </li></ol></li></ol> 4. clôture et récupération <ol><li> Repositionner la graisse et les muscles sur les structures sous-jacentes. </li><li> Rapprocher les bords de l&#39;incision et de fermer la plaie en utilisant un clip de la plaie de 7,5 mm. Sutures ou de la colle est aussi acceptable pour la fermeture des plaies. Analgésiques post-opératoires peuvent être fournis à ce moment. </li><li> Retirer le ruban de l&#39;oreille de la souris. Éteignez le flux de l&#39;isoflurane et laissez la souris pour respirer l&#39;oxygène pur pendant 30 sec à 1 min. Place la souris dans une cage vide sans litière pour remettre de l&#39;anesthésie. </li><li> Lorsque la souris est récupéré, examiner son comportement pour des signes de confirmation de la paralysie faciale. Les moustaches seront paralysés et inclinés vers la joue, le nez sera dévié, et l&#39;œil ne clignote pas en réponse à une bouffée d&#39;air. </li><li> Animaux Maison conjointement après la chirurgie si elles sont des femmes. Évitez héberge des souris conjointement parce qu&#39;ils sont plus agressifs et ont tendance à retirer de force les clips de la plaie de leur compagnon de cage, ce qui conduit à l&#39;infection. Fournir analgésiques post-opératoires en ce moment, si nécessaire. </li><li> Surveiller les souris une fois par jour pendant plusieurs jours après l&#39;opération afin de se assurer qu&#39;aucune infection ou d&#39;autres complications se produisent après l&#39;opération. Retirer des agrafes 7-10 jours après la chirurgie se ils ne sont pas tombés sur leur propre. </li><li> Appliquer pommade ophtalmique lubrifiante à l&#39;œil touchée par jour pour prévenir les complications de la cornée, soit jusqu&#39;à ce que le réflexe de clignement des yeux est rerecouverts ou jusqu&#39;à l&#39;euthanasie. </li></ol>

Les auteurs ne ont aucun conflit d&#39;intérêt à divulguer.

Les données de résolution rendements paires de bases protocole présenté de méthylation de la cytosine à des régions génomiques biologiquement pertinents. Le protocole comme écrit est optimisé pour 50 ng de produit de départ, cependant, il peut être adapté pour traiter une gamme de matériel d&#39;entrée (5 ng ou plus) 26. Cela nécessitera des ajustements de certaines des étapes de protocole comme on le voit dans le tableau 6. Les bibliothèques de ERRBS se prêtent à un séquençage d&#39;extrémité et couplé en outre une couverture génomique peut également être réalisé par séquençage lectures plus de 51 cycles. Séquençage multiplexé offrira un protocole à moindre coût par échantillon, cependant, cela se traduira par une couverture réduite par site CpG représenté dans les données (Figure 5 et le Tableau 8), et ne cédera pas une profondeur suffisante de la couverture d&#39;effectuer des analyses qui nécessitent une couverture élevée par CpG place (par exemple comme décrit par Landan et al. 33). Enfin, ce protocole (ou tout Protoco base bisulfite-l) ne peut pas distinguer entre méthyl-cytosine et hydroxyméthyle-cytosine 46,47. Toutefois, les données générées peuvent être intégrés à d&#39;autres résultats protocole 48,49 pour délimiter les différentes modifications, et d&#39;autres modifications de cytosine récemment rapporté 50, devraient-ils être d&#39;intérêt. Bibliothèques de haute qualité apparaîtra comme le montre la figure 3A-C, et une fois mis en commun pour le séquençage donne une trace comme le montre la figure 3G (trace rouge) représentant contributions molaires égales des deux fractions de la bibliothèque. Bibliothèque échec de préparation peut résulter de ne importe quelle étape pendant la procédure. Si l&#39;ADN dégradé est traitée elle se traduira dans les bibliothèques qui ne sont pas enrichis en fragments Mspl et donc de la faible couverture CpG en utilisant les paramètres de séquençage décrites dans ce protocole. Si une enzyme est non fonctionnelle ou exclu par inadvertance de l&#39;une des réactions, le protocole donné la bibliothèque attendu. Si le rea de ligaturection est inefficace, les adaptateurs sont à une concentration plus élevée que prévu, et / ou la concentration des amorces utilisé est un réactif limitant pour les étapes finales d&#39;amplification, l&#39;échec de la bibliothèque peut se produire. Adaptateurs excès (considéré comme un des pics à ~ 150 pb dans les résultats de bioanalyse; Figure 3D-F) à la bibliothèque sera également interférer avec le séquençage due au regroupement aveugle de la bibliothèque et adaptateurs excès. Si une telle bibliothèque peut séquencer apparemment normalement, une partie importante du lit sera séquences simplement l&#39;adaptateur. Si des adaptateurs en excès sont observées dans une bibliothèque, il est préférable de répéter la préparation bibliothèque si le matériel est disponible en utilisant du matériel d&#39;entrée optimal à l&#39;adaptateur rapports quantitatifs. Enfin, pour assurer une amplification par PCR efficace des bibliothèques, les fractions bibliothèque inférieurs et supérieurs sont maintenus comme des échantillons distincts dans l&#39;ensemble de la conversion au bisulfite et PCR étapes d&#39;enrichissement. Ne pas le faire donne l&#39;efficacité différentielle de l&#39;amplification au cours de la PCR réaction de fractions supérieures et inférieures (comme on le voit sur ​​la figure 3G trace bleue) et le potentiel de la représentation inégale des loci génomiques respectif couverte dans chaque fraction bibliothèque au cours du séquençage. L&#39;utilisateur peut choisir d&#39;inclure une étape de PCR quantitative immédiatement après la conversion au bisulfite de titrage en outre des cycles de PCR optimales nécessaires pour amplifier les bibliothèques générées. ERRBS protocole de préparation de la bibliothèque comporte plusieurs étapes clés dans lesquels les réactifs spécifiques sont recommandées. Lors de l&#39;étape de fin de réparation, l&#39;utilisation d&#39;un mélange de dNTP à quatre nucleotides permet fin de réparation de tous produits qui ne contiennent pas le surplomb CG, tels que ceux résultant de MspI activité enzymatique en étoile et des fragments d&#39;ADN cisaillé présents dans l&#39;échantillon d&#39;ADN d&#39;origine. Il en résulte une meilleure représentation CpG dans les résultats. A l&#39;étape de ligature, il est essentiel d&#39;utiliser une ligase forte concentration (2.000.000 unités / ml) et méthylés adaptateurs pour se assurer que la Reacti de ligationOn est efficace et que la conversion au bisulfite ne influence pas les séquences d&#39;adaptation essentielles pour l&#39;alignement de données précises. A l&#39;étape PCR, en utilisant une polymérase capable d&#39;amplifier des fragments d&#39;ADN riches en GC traité au bisulfite est nécessaire pour une grande spécificité. Enfin, pour assurer l&#39;élimination des adaptateurs et les amorces en excès, SPRI cordon purification (par exemple: Agencourt AMPure XP) est recommandé plutôt que de tests basés sur des colonnes pour ligature et isolements de produits PCR. Afin de générer des données de haute qualité, il est important pour assurer une conversion au bisulfite efficace. Le contrôle présenté offre à l&#39;utilisateur la possibilité de déterminer l&#39;efficacité de conversion avant le séquençage. En variante, un ADN non humain tel que lambda ADN peut être utilisé en tant que contrôle interne (spike-in). En raison des différences entre les espèces, ce type de commande peut être directement inclus dans le séquençage en aval (par exemple, tel qu&#39;il est utilisé par Yu, et al. 34). Cependant, si le pic i-ins utilisé, il ne peut être utilisé pour déterminer l&#39;efficacité de conversion avant le séquençage bibliothèque amplifiée à moins unique et séquence avant le séquençage bibliothèque de façon indépendante. Les taux de conversion déterminés sont basés sur l&#39;état de méthylation des sites CpG non. Cela peut ne pas être approprié pour une utilisation dans le contexte de forte méthylation de la cytosine dans le contexte non CpG (par exemple des cellules souches embryonnaires) et des échantillons parallèles ou d&#39;autres moyens d&#39;évaluation de l&#39;efficacité de conversion peuvent être utilisés à cette fin. Il ya quelques mises en garde à l&#39;adresse qui sont uniques à l&#39;enchaînement des bibliothèques ERRBS. Les trois premières bases des fractions de la bibliothèque séquencés sont presque uniformément non aléatoire en raison du site de coupe de reconnaissance MspI (C ^ CGG; voir la figure 4B, C). Il en résulte le risque de perte de données importantes en raison de la faible qualité lectures résultant d&#39;une mauvaise localisation de cluster en dépit de la densité de cluster haute apparente au cours du séquençage. Pour surmonter cet obstacle,inclure une bibliothèque de grande complexité dans une voie indépendante (contrôle PhiX ou un autre type de bibliothèque) comme une voie de contrôle dédié. Bibliothèques de haute complexité ont des extrémités contenant une représentation équilibrée des A, C, T et G dans les quatre premières bases séquencées. Voies de contrôle appropriés comprennent les bibliothèques telles que l&#39;ARN-Seq, ChIP-seq, le séquençage du génome entier, ou un contrôle offert par le fabricant de la machine de séquençage (par exemple v3 contrôle PhiX). Lorsque désignée comme une voie de commande pour la course respective de séquençage, il peut servir de base pour la génération de la matrice qui est utilisée au cours des quatre premières bases de séquençage pour détecter des positions de la grappe. La qualité supérieure lectures capturé augmentera la couverture moyenne par site CpG de 5,2 (n = 4). Alternativement, cette difficulté technique peut également être surmonté en utilisant une approche de séquençage sombre comme décrit précédemment 23. Autres critères de séquençage suivent des procédures normalisées d&#39;exploitation par les protocoles du fabricant. Enfin, la couverture par CpG chosen pour l&#39;analyse des données sera guidé par l&#39;utilisateur et en partie par les questions biologiques d&#39;intérêt. 10x seuil de couverture offre une approche d&#39;analyse de couverture élevé, mais ce seuil peut être abaissé devrait-il être d&#39;intérêt. Une discussion complète de l&#39;analyse de données ERRBS est au-delà du champ d&#39;application de cet article, cependant, différemment cytosines méthylés et régions peuvent être déterminées en utilisant des outils open source 31,51-53. Considérations et des approches d&#39;analyse supplémentaires ont été bien décrit 54,55, et le lecteur est encouragé à rechercher la littérature pour les outils les plus appropriés pour l&#39;analyse prévue. Comparé à d&#39;autres méthodes publiées, ERRBS propose un protocole de quatre jours qui, lorsqu&#39;il est effectué alors que les rendements décrits taux élevés de reproductibilité. Il a été validé par rapport à l&#39;étalon-or MassARRAY EpiTYPER 26, est rentable pour des données de haute couverture, et est adaptable pour différents matériaux d&#39;entrée(montants favorables pour le traitement de l&#39;échantillon clinique et d&#39;autres types cellulaires de basse fréquence) et des approches de séquençage. Il offre une résolution paires de bases à des loci biologiquement pertinente et peut être utilisé dans les analyses d&#39;intégration avec d&#39;autres techniques de profilage du génome entier facteur de transcription contraignant, remodelage de la chromatine, marques épigénétiques et d&#39;autres modifications cytosine d&#39;intérêt. L&#39;utilisation des données ERRBS dans de telles études peut contribuer à une approche moléculaire complète et permettre grande dimension analyses dans l&#39;étude de modèles biologiques et la maladie humaine.

Méthylation de l&#39;ADN à la cytosine (5-méthylcytosine) est une marque épigénétique critique dans les cellules de mammifères pour une variété de processus biologiques, y compris mais non limité à l&#39;empreinte, l&#39;inactivation du chromosome X, le développement, et la régulation de l&#39;expression génique 1-8. L&#39;étude des modèles de méthylation d&#39;ADN dans les troubles malignes et d&#39;autres a déterminé les habitudes spécifiques de maladies et contribué à la compréhension de la pathogenèse de la maladie et de découvertes de biomarqueurs potentiels 9-17. Il existe de nombreux protocoles qui interrogent l&#39;épigénome de statut de méthylation d&#39;ADN. Ceux-ci peuvent être divisées en base d&#39;affinité, sur la base-enzyme de restriction, et des essais à base de conversion-bisulfite qui utilisent des puces à ADN ou les plates-formes en aval séquençage. En outre, il ya quelques protocoles qui comblent ces catégories générales, y compris, mais sans s&#39;y limiter, l&#39;analyse combinée de restriction bisulfite 18 et réduit Représentation bisulfite séquençage (ORR 19). </p&gt; RRBS a été initialement décrit par Meissner et al. 19,20. Le protocole introduit une étape d&#39;enrichir régions génomiques riches en GC suivie par séquençage bisulfite, qui a abouti à des données quantitatives de la résolution paires de bases qui est rentable 21,22. Les régions riches en GC sont ciblés par le MspI (C ^ CGG) enzyme de restriction, et la cytosine méthylation est résolu par conversion au bisulfite de cytosines (désamination des cytosines non modifiés à l&#39;uracile), suivie de la réaction en chaîne par polymérase (PCR). RRBS couvert la majorité des promoteurs de gènes et îlots CpG dans une fraction du séquençage requis pour un génome entier; cependant RRBS avaient une couverture limitée des rives de CpG et d&#39;autres régions intergéniques de pertinence biologique. Plusieurs groupes ont publié des mises à jour des protocoles ORR depuis le rapport original améliorer la méthodologie et la couverture résultante de ces régions génomiques 23-25. Représentation accrue réduit bisulfite Sequdes diffi- (ERRBS) comprend des modifications de préparation bibliothèque et un alignement des données alternatif approche 26 par rapport à RRBS. ERRBS a entraîné une augmentation du nombre de CpG représentées dans les données générées et augmentation de la couverture de toutes les régions génomiques interrogé 26. Cette méthode a été utilisée pour résoudre des modèles de méthylation d&#39;ADN dans patient humain et d&#39;autres spécimens d&#39;animaux de 26 à 30. Le protocole de ERRBS décrit offre des détails sur toutes les mesures nécessaires pour l&#39;achèvement et des données a été généré en utilisant l&#39;ADN humain représentant (échantillons ont été obtenus à partir signalés précédemment, dépersonnalisées échantillons de patients 31 et CD34 + os échantillon de moelle d&#39;un donneur humain normal). Le protocole comprend un processus de sélection du format automatisé, ce qui réduit le temps de traitement par l&#39;échantillon et permet une précision accrue dans la sélection de la taille de bibliothèque. Le protocole combine une série de techniques de biologie moléculaire établies. ADN de haut poids moléculaire est digéré avecvec une enzyme de restriction de méthylation insensible (MspI) suivi d&#39;ici la fin de réparation, A-tailing, et la ligature d&#39;adaptateurs méthylés. Choix de la taille des fragments riches en GC est suivie par conversion au bisulfite et d&#39;amplification par PCR avant le séquençage. Conversion au bisulfite a été décrit précédemment 32 et un examen détaillé de l&#39;analyse des données et des applications est au-delà de la portée de ce document, cependant recommandations et des références sont inclus pour l&#39;utilisation des lecteurs. Le protocole peut être effectuée sur quatre jours et se prête à la petite entrée (50 ng ou moins) des montants significatifs. Le protocole fournit des données décrits à forte couverture par site CpG non seulement suffisante pour site de méthylation et la région déterminations différentielles mais également pour la détection du polymorphisme épigénétique comme décrit par Landan, et al. 33.

<table><tbody><tr><td>MspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106M</td><td>100 000 unités/ml</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>Tampon de réaction pour l’enzyme MspI ; étape du protocole 1.2</td></tr><tr><td>Solution de phénol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4557</td><td>Equilibré avec 10&nbsp ; mM Tris HCl, pH&nbsp ; 8.0; voir les instructions de sécurité et de manipulation à http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Voir les instructions de sécurité et de manipulation à http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td></tr><tr><td>Glycogène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td>19-22 mg/ml</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td>3 M, pH 5,2</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof, pour la biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Tampon EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 mM Tris-Cl, pH 8,5</td></tr><tr><td>tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>préparer une solution de 1 M, pH 8,5</td></tr><tr><td>Tris- Ethylènediaminetétraacétique (TE)Sigma-Aldrich</td><td></td> <td>T9285</td><td>Diluer à 1x solution tampon selon les recommandations</td></tr> <tr><td>du fabricantTampon de réaction de ligase d’ADN T4</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td>Concentration 10x</td></tr><tr><td>Désoxynucléotide triphosphate (dNTP) Mélange</td><td>de solution New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 mM chaque nucléotide</td></tr><tr><td>T4 ADN polymérase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td>3 000 unités/ml</td></tr><tr><td>ADN polymérase I, grand fragment (Klenow) New</td><td>England Biolabs</td><td>M0210L</td><td>5 000 unités/ml</td></tr><tr><td>Polynucléotide kinase T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>10 000 unités/ml</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Utilisé pour la purification du produit ADN à l’étape du protocole 2.3</td></tr><tr><td>2'-désoxyadénosine 5'-triphosphate (dATP)</td><td>Promega</td><td>U1201</td><td>100</td></tr><tr><td>mM Fragment de Klenow (3'&rarr ; 5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td>5 000 unités/ml</td></tr><tr><td>Kit de purification PCR MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Utilisé pour la purification du produit ADN à l’étape du protocole 3.3</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202M</td><td>2 000 000 unités/ml</td></tr><tr><td>Adaptateur de méthylation Oligo Kit</td><td>Illumina</td><td>ME-100-0010</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Utilisé dans les sections de protocole qui mettent en œuvre des étapes de purification par billes magnétiques (étapes 4.3 et 8.2). Équilibrez à température ambiante avant utilisation.</td></tr><tr><td>Cassettes de gel de préparation Pippin, 2 % d’agarose, sans colorant</td><td>Sage Science</td><td>CDF2010</td><td>avec normes internes</td></tr><tr><td>Certifiée Low Range Ultra Agarose</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3106</td><td></td></tr><tr><td>Tampon Tris-Borate-EDTA (TBE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>Solution de bromure d’éthidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>50 pb Échelle d’ADN</td><td>NEB</td><td>N3236S</td><td></td></tr><tr><td>100 bp Échelle d’ADN</td><td>NEB</td><td>N3231S</td><td></td></tr><tr><td>Colorant de chargement de gel, orange (6x)</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel&nbsp ; Pale&nbsp ; Non&nbsp ; 11</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Methylation</td><td>Kit Zymo Research</td><td>D5001</td><td>Utilisé dans le protocole étape 6.2</td></tr><tr><td>EZ DNA Methylation-Lightning Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>Alternative à l’étape 6.2</td></tr><tr><td>Norme universelle d’ADN humain méthylé</td><td>Zymo Research</td><td>D5011</td><td>Utilisé comme contrôle de conversion au bisulfite</td></tr><tr><td>Système de PCR haute fidélité Roche</td><td></td><td>03553426001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Kit de dosage haute sensibilité</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>Un test de quantification de l’ADN basé sur la fluorescence ; utilisé dans les étapes de protocole 1.1, 9.1 et 10.1</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’ADN haute sensibilité</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyseur</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Sage Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluoromètre</td><td>Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS</td><td>Illumina</td><td>GD-401-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SBS Kit v3-HS</td><td>Illumina</td><td>FC-401-3002</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq RNA Préparation d’échantillons</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td>Adaptateurs de codes-barres utilisés pour le multiplexage des bibliothèques ; Voir Fichier supplémentaire pour le protocole de multiplexage.</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur</td><td></td><td></td><td></td>vortex</tr><tr><td>Bloc sec Chauffe-bloc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bain d’eau</td><td></td><td></td><td></td>Système d’électrophorèse</tr><tr><td>Gel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alimentation électrique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel doc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transilluminateur</td><td></td><td></td><td></td> UV ou lumière bleue</tr></tbody></table>

enhanced réduit représentation bisulfite séquençage pour l&#39;évaluation de méthylation de l&#39;adn à la résolution de paires de base

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

cartographie du réseau de méthylation de l&#39;ADN est fortement étudié dans les tissus normaux et malades. Une variété de procédés ont été mis en place pour interroger les schémas de méthylation de cytosine dans des cellules. Représentation réduite du séquençage du génome de bisulfite ensemble a été conçu pour détecter des modèles de résolution de méthylation de cytosine quantitatives de paires de bases à des loci génomiques riche en GC. Ceci est réalisé en combinant l&#39;utilisation d&#39;une enzyme de restriction suivie de la conversion au bisulfite. Représentation accrue réduit Bisulfite Sequencing (ERRBS) augmente le locus génomique d&#39;intérêt biologique couvert et a été utilisé pour profiler méthylation de cytosine dans l&#39;ADN d&#39;humain, de souris et d&#39;autres organismes. ERRBS amorce avec une enzyme de restriction digestion de l&#39;ADN pour générer des fragments de bas poids moléculaire pour une utilisation dans la préparation bibliothèque. Ces fragments sont soumis à la construction de la bibliothèque standard pour le séquençage de prochaine génération. Conversion au bisulfite de cytosines non méthylés avant la finale amplificatià l&#39;étape permet la résolution de base quantitative des niveaux de méthylation cytosine dans des loci génomiques couverte. Le protocole peut être effectuée dans les quatre jours. Malgré une faible complexité dans les trois premières bases séquencées, bibliothèques ERRBS fournissent des données de haute qualité en utilisant une voie de commande de séquencement désigné. analyse de la cartographie et de la bio-informatique est alors effectuée et fournit des données qui peut être facilement intégré avec une variété de plates-formes de l&#39;ensemble du génome. ERRBS peut utiliser de petites quantités de matières entrantes qui rend possible de traiter des échantillons cliniques humains et applicable dans une gamme d&#39;applications de recherche. La vidéo produite démontre étapes critiques du protocole de ERRBS.

Le séquençage au bisulfite amélioré est une méthode de préparation de banques de séquençage pour l’analyse de la méthylation de l’ADN basée sur la digestion enzymatique de restriction combinée à la conversion de la cytosine au bisulfite. Ce protocole nécessite 50 ng de matériel de départ et fournit des données de résolution de paires de bases dans des régions génomiques riches en GC.

Enhanced réduit Représentation bisulfite séquençage pour l&#39;évaluation de méthylation de l&#39;ADN à la résolution de paires de base

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

L’objectif global de cette procédure est de générer des banques de séquençage pour une résolution de paires de bases D-N-A-C-P-G, une analyse de méthylation basée sur la digestion d’enzymes de restriction combinée à la conversion de la cytosine par sulfite. Ceci est accompli en effectuant d’abord une digestion d’enzyme de restriction MSP d’ADN de haute qualité, suivie d’une réparation finale, d’une traînée et d’une ligature des adaptateurs méthylés. L’étape suivante consiste à effectuer par conversion de sulfite sur des fragments de taille sélectionnée après par conversion de sulfite.Les fragments sont amplifiés par PCR. La dernière étape consiste à effectuer le contrôle de la qualité et le séquençage, suivis de la visualisation et de l’analyse des données. En fin de compte, la représentation réduite améliorée du séquençage du bi sulfite détecte la résolution quantitative de la paire de bases des modèles de méthylation de la cytidine au niveau des loci génomiques riches en CG.Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes de méthylation de l’ADN, telles que les microréseaux, est qu’elle peut utiliser de petites quantités de matériaux d’entrée pour générer des données de méthylation D-N-A-C-P-G à haute couverture à une résolution de paire de bases et à des sites biologiquement pertinents. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous nous sommes intéressés à explorer les modèles épigénétiques au-delà des régions couvertes par les tests traditionnels. Nous souhaitions développer cette technique pour passer des microréseaux à la génération de données de méthylation de l’ADN à résolution de paires de bases qui pourraient être intégrées aux données générées par d’autres techniques de nouvelle génération.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’épigénétique. Par exemple, le modèle épigénétique et l’hétérogénéité des échantillons biologiques par rapport aux témoins normaux ou à d’autres états pathologiques. En général, les personnes novices dans cette méthode la trouveront difficile en raison de la longueur de la procédure, des nombreuses exigences spécifiques et des caractéristiques de séquençage uniques des bibliothèques générées par Mamie fall.Un spécialiste de la recherche dans notre laboratoire aidera à démontrer la procédure pour commencer ce protocole. Tout d’abord, préparez des aliquotes purifiées d’échantillons d’ADN génomique qui ont subi une digestion de l’enzyme MSP à une restriction, une réaction de réparation de l’extrémité émoussée et un ajout unique d’un nucléotide aux trois extrémités principales. À ce stade, les produits d’ADN seront prêts pour les ligatures d’adaptateur afin de commencer à transférer 10 microlitres de l’échantillon A-A-L-D-N-A dans un tube PCR de 0,2 millilitre, et de placer le tube sur de la glace.De plus, placez une aliquote des molécules adaptatrices sur de la glace. Ensuite, préparez le mélange de réactifs de ligature sur de la glace. Ajoutez à la fois le réactif de ligature et les molécules adaptatrices à l’échantillon d’ADN et pipetez de haut en bas plusieurs fois pour mélanger.Placez un tube PCR dans un thermocycleur et laissez la réaction de ligature se poursuivre pendant la nuit à 16 degrés Celsius le lendemain. Purifier les produits de ligature à l’aide d’une bille magnétique ou d’un kit d’extraction d’ADN en phase solide basé sur une colonne de silice. À la dernière étape du processus de purification.Éluez l’ADN en ajoutant 30 microlitres d’eau exempte d’ADN. Le produit d’ADN purifié peut être stocké à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit nécessaire pour les échantillons, qui ont commencé avec l’ADN total de 25 nanogrammes ou plus. Utilisez un appareil automatisé d’extraction de gel tel que le PI et la préparation pour sélectionner des produits ligaturés dont la longueur est comprise entre 150 paires de bases et 400 paires de bases.Assurez-vous d’exclure les colorants de visualisation de l’ADN tels que le bromure d’Ethereum ou le cyber green de la cassette agros, car ils peuvent modifier les propriétés de migration de l’ADN des fragments liés à l’adaptateur fourchu. Les protocoles standard de sélection de taille basés sur le gel agros peuvent également être utilisés pour cette étape du protocole afin de mettre en place l’électrophorèse de l’ADN sur une cassette aros sans colorant à 2 %. Créez un nouveau protocole dans la console Pippin Prep et sélectionnez l’option 2 % DF marker L comme cassette de votre choix.Activez ensuite l’option Utiliser les normes internes et vérifiez que le numéro de voie de référence correspond aux numéros de voie pour isoler les fragments d’ADN allant de 150 paires de bases à 400 paires de bases. Sélectionnez l’option de plage comme mode de collecte et entrez les paramètres de limite suivants : 135 pour le début de la paire de base, 410 pour la fin de la paire de base et 240 pour les pattes de la paire de base. Cela indique à l’appareil d’aligner le champ électrophorétique sur l’orifice de sortie d’électro-élution.Lorsque des fragments d’ADN dans cette plage se déplacent près du voisinage de la sortie. Après avoir enregistré le fichier de protocole, préparez la cassette de gel et les puits de chargement d’échantillons de l’instrument en suivant les procédures d’utilisation standard de Pippen Prep lors de la configuration de l’instrument. Préparez les échantillons d’ADN pour l’électrophorèse en ajoutant 10 microlitres du marqueur d’ADN à une aliquote de 30 microlitres d’un échantillon post-ligature donné pour charger les mélanges sur la cassette de gel.Tout d’abord, retirez 40 microlitres de tampon d’électrophorèse de chaque échantillon. Ensuite, remplacez le volume en pipetant chaque mélange de marqueurs d’échantillon de 40 microlitres dans des puits individuels. De retour sur la console, chargez le protocole enregistré et appuyez sur start pour commencer l’électrophorèse.Lorsque le programme atteint la paire de base de 240, l’étape de pause collecte manuellement 40 microlitres de l’ouit de chaque port de sortie avec une pipette. Étiquetez ces fractions comme la fraction de bibliothèque inférieure. Après avoir collecté les fractions de bibliothèque inférieures, lavez immédiatement les orifices de sortie en ajoutant 40 microlitres de tampon d’électrophorèse frais.Pipeter le tampon de haut en bas au moins trois fois, puis aspirer le filet. Répétez ce lavage deux fois de plus pour éliminer toutes les traces d’espèces d’ADN de courte longueur des sorties. Ajoutez maintenant 40 microlitres de tampon d’électrophorèse à l’échantillon.Fermez bien les ports elucian et appuyez sur le bouton d’exécution pour reprendre le processus elucian. À la fin du programme Ellucian à la paire de bases 410, collectez les 40 microlitres d’Inuit à tous les points de sortie et étiquetez ces fractions comme la fraction supérieure de la bibliothèque. À ce stade, les deux fractions de bibliothèque sont purifiées en gel et déjà pour la conversion au bisulfite.À l’aide d’un kit disponible dans le commerce, effectuez le test de conversion du bisulfite sur les deux fractions de banque. À la dernière étape du processus de conversion, éluez les échantillons d’ADN dans 40 microlitres d’eau libre d’ADN. Après la conversion du bisulfite, les fragments de la banque d’ADN résultants subiront une amplification PCR d’enrichissement à l’aide d’amorces qui s’hybrident aux extrémités adaptatrices de chaque molécule d’ADN.Pour préparer d’abord la PCR d’enrichissement, ajoutez 160 microlitres du mélange maître PCR à chaque aliquote de 40 microlitres d’un échantillon converti par sulfure. Divisez ensuite le mélange de 200 microlitres obtenu en quatre aliquotes de 50 microlitres. Dans des tubes PCR séparés.Placez les tubes dans un thermocycleur et amplifiez la matrice d’ADN convertie. Après l’enrichissement, tirez les quatre produits post-PCR dans un seul tube de 1,5 millilitre et purifiez l’ADN avec un kit de nettoyage PCR commercial. Si un kit d’extraction en phase solide à billes magnétiques est utilisé pour purifier les produits PCR, modifiez les procédures opératoires standard en mélangeant d’abord les produits PCR combinés de la bibliothèque inférieure avec 1,7 fois leur volume total en billes.Mélangez ensuite les produits PCR combinés de la bibliothèque supérieure avec 1,1 fois leur volume total en billes. Suivez ensuite le protocole du fabricant jusqu’aux étapes de lavage à 70 % d’éthanol où chacun des volumes de lavage doit être changé à 800 microlitres à la dernière étape du processus de purification. Éluez l’ADN avec 50 microlitres de tampon d’élution libre d’ADN.Stocker les banques purifiées à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires à l’aide d’un test basé sur la fluorescence sélectif pour l’ADN double brin, quantifier la quantité d’ADN post-enrichissement pour chaque fraction de bibliothèque. De plus, évaluez la taille et la qualité de la bibliothèque post-enrichissement à l’aide d’un bioanalyseur. Calculez la molarité effective de l’ADN d’une fraction de banque particulière en utilisant la longueur moyenne de l’ADN exprimée en paires de bases.Une fois la molarité connue, utilisez l’eau libre de l’ADN pour diluer chaque fraction de bibliothèque supérieure et inférieure correspondante jusqu’à une concentration finale de deux nanomolaires. Combinez les paires de bibliothèques inférieure et supérieure en un seul tube pour créer un mélange de bibliothèque de deux trous nanomolaires de 20 microlitres chacun. L’échantillon groupé est maintenant prêt pour une séquence d’exécution.Dans les essais liés au séquençage, y compris E-R-R-B-S, la qualité et la distribution granulométrique des molécules de la bibliothèque supérieure et inférieure sont des facteurs clés pour déterminer la qualité des données de séquençage finales. Par rapport aux protocoles d’extraction manuelle de gel traditionnels, l’appareil d’extraction de gel automatisé utilisé dans le protocole E-R-R-B-S produira une distribution granulométrique cohérente et minimisera le risque de contamination croisée des échantillons. Ensuite, lors de l’envoi des molécules de la bibliothèque de sulfites converties BIS pour le séquençage, les données brutes de tous les brins d’ADN montrent que pour un brin donné, la qualité des données pour chaque position de nucléotide augmente considérablement juste après les trois premiers nucléotides.Depuis la séquence consensus pour ces trois nucléotides définis avec CGG pour la grande majorité des molécules de la bibliothèque, les données suggèrent que le protocole E-R-R-B-S a produit une collection de bibliothèques qui contient un ensemble souhaitable de fragments génomiques principalement flanqués. Avec MSP, une synthèse de restriction se termine d’un point de vue d’oiseau. Le protocole E-R-R-B-S peut produire des données de résolution de paires de bases des sites de méthylation de la cytidine sur l’ensemble du génome.Par exemple, le chromosome 12 est montré ici. Le protocole couvre une représentation réduite des CPG à l’échelle du génome. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer les bibliothèques E-R-R-B-S pour la génération de données de méthylation de résolution de base D-N-A-C-P-G Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre jours si elle est effectuée correctement.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de commencer avec de l’ADN de haute qualité, d’inclure toutes les étapes décrites, de valider l’efficacité de la conversion du bisulfate et de séquencer à l’aide des paramètres recommandés. N’oubliez pas que travailler avec du phényle et du chloroforme peut être extrêmement dangereux. Les précautions courantes, telles que le travail dans une hotte chimique et l’élimination appropriée des déchets, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.En suivant cette procédure. D’autres méthodes telles que le séquençage spyrologique ou l’épitype de masse peuvent être effectuées pour valider les résultats. De plus, le profilage de l’expression génique peut être effectué pour déterminer la signification biologique des modèles de méthylation de l’ADN détectés.La capacité de générer de l’ADN avec une résolution de paires de bases et des modèles de méthylation à partir de quantités limitées de matériaux d’entrée a permis de profiler des populations cellulaires rares, ce qui n’avait jamais été possible auparavant. Il a également rendu possible le profilage de grandes cohortes d’échantillons cliniques pour l’exploration de la régulation à médiation épigénétique et de l’hétérogénéité de la maladie.

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