Enhanced réduit Représentation bisulfite séquençage pour l'évaluation de méthylation de l'ADN à la résolution de paires de base

L’objectif global de cette procédure est de générer des banques de séquençage pour une résolution de paires de bases D-N-A-C-P-G, une analyse de méthylation basée sur la digestion d’enzymes de restriction combinée à la conversion de la cytosine par sulfite. Ceci est accompli en effectuant d’abord une digestion d’enzyme de restriction MSP d’ADN de haute qualité, suivie d’une réparation finale, d’une traînée et d’une ligature des adaptateurs méthylés. L’étape suivante consiste à effectuer par conversion de sulfite sur des fragments de taille sélectionnée après par conversion de sulfite.

Les fragments sont amplifiés par PCR. La dernière étape consiste à effectuer le contrôle de la qualité et le séquençage, suivis de la visualisation et de l’analyse des données. En fin de compte, la représentation réduite améliorée du séquençage du bi sulfite détecte la résolution quantitative de la paire de bases des modèles de méthylation de la cytidine au niveau des loci génomiques riches en CG.

Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes de méthylation de l’ADN, telles que les microréseaux, est qu’elle peut utiliser de petites quantités de matériaux d’entrée pour générer des données de méthylation D-N-A-C-P-G à haute couverture à une résolution de paire de bases et à des sites biologiquement pertinents. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous nous sommes intéressés à explorer les modèles épigénétiques au-delà des régions couvertes par les tests traditionnels. Nous souhaitions développer cette technique pour passer des microréseaux à la génération de données de méthylation de l’ADN à résolution de paires de bases qui pourraient être intégrées aux données générées par d’autres techniques de nouvelle génération.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’épigénétique. Par exemple, le modèle épigénétique et l’hétérogénéité des échantillons biologiques par rapport aux témoins normaux ou à d’autres états pathologiques. En général, les personnes novices dans cette méthode la trouveront difficile en raison de la longueur de la procédure, des nombreuses exigences spécifiques et des caractéristiques de séquençage uniques des bibliothèques générées par Mamie fall.

Un spécialiste de la recherche dans notre laboratoire aidera à démontrer la procédure pour commencer ce protocole. Tout d’abord, préparez des aliquotes purifiées d’échantillons d’ADN génomique qui ont subi une digestion de l’enzyme MSP à une restriction, une réaction de réparation de l’extrémité émoussée et un ajout unique d’un nucléotide aux trois extrémités principales. À ce stade, les produits d’ADN seront prêts pour les ligatures d’adaptateur afin de commencer à transférer 10 microlitres de l’échantillon A-A-L-D-N-A dans un tube PCR de 0,2 millilitre, et de placer le tube sur de la glace.

De plus, placez une aliquote des molécules adaptatrices sur de la glace. Ensuite, préparez le mélange de réactifs de ligature sur de la glace. Ajoutez à la fois le réactif de ligature et les molécules adaptatrices à l’échantillon d’ADN et pipetez de haut en bas plusieurs fois pour mélanger.

Placez un tube PCR dans un thermocycleur et laissez la réaction de ligature se poursuivre pendant la nuit à 16 degrés Celsius le lendemain. Purifier les produits de ligature à l’aide d’une bille magnétique ou d’un kit d’extraction d’ADN en phase solide basé sur une colonne de silice. À la dernière étape du processus de purification.

Éluez l’ADN en ajoutant 30 microlitres d’eau exempte d’ADN. Le produit d’ADN purifié peut être stocké à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit nécessaire pour les échantillons, qui ont commencé avec l’ADN total de 25 nanogrammes ou plus. Utilisez un appareil automatisé d’extraction de gel tel que le PI et la préparation pour sélectionner des produits ligaturés dont la longueur est comprise entre 150 paires de bases et 400 paires de bases.

Assurez-vous d’exclure les colorants de visualisation de l’ADN tels que le bromure d’Ethereum ou le cyber green de la cassette agros, car ils peuvent modifier les propriétés de migration de l’ADN des fragments liés à l’adaptateur fourchu. Les protocoles standard de sélection de taille basés sur le gel agros peuvent également être utilisés pour cette étape du protocole afin de mettre en place l’électrophorèse de l’ADN sur une cassette aros sans colorant à 2 %. Créez un nouveau protocole dans la console Pippin Prep et sélectionnez l’option 2 % DF marker L comme cassette de votre choix.

Activez ensuite l’option Utiliser les normes internes et vérifiez que le numéro de voie de référence correspond aux numéros de voie pour isoler les fragments d’ADN allant de 150 paires de bases à 400 paires de bases. Sélectionnez l’option de plage comme mode de collecte et entrez les paramètres de limite suivants : 135 pour le début de la paire de base, 410 pour la fin de la paire de base et 240 pour les pattes de la paire de base. Cela indique à l’appareil d’aligner le champ électrophorétique sur l’orifice de sortie d’électro-élution.

Lorsque des fragments d’ADN dans cette plage se déplacent près du voisinage de la sortie. Après avoir enregistré le fichier de protocole, préparez la cassette de gel et les puits de chargement d’échantillons de l’instrument en suivant les procédures d’utilisation standard de Pippen Prep lors de la configuration de l’instrument. Préparez les échantillons d’ADN pour l’électrophorèse en ajoutant 10 microlitres du marqueur d’ADN à une aliquote de 30 microlitres d’un échantillon post-ligature donné pour charger les mélanges sur la cassette de gel.

Tout d’abord, retirez 40 microlitres de tampon d’électrophorèse de chaque échantillon. Ensuite, remplacez le volume en pipetant chaque mélange de marqueurs d’échantillon de 40 microlitres dans des puits individuels. De retour sur la console, chargez le protocole enregistré et appuyez sur start pour commencer l’électrophorèse.

Lorsque le programme atteint la paire de base de 240, l’étape de pause collecte manuellement 40 microlitres de l’ouit de chaque port de sortie avec une pipette. Étiquetez ces fractions comme la fraction de bibliothèque inférieure. Après avoir collecté les fractions de bibliothèque inférieures, lavez immédiatement les orifices de sortie en ajoutant 40 microlitres de tampon d’électrophorèse frais.

Pipeter le tampon de haut en bas au moins trois fois, puis aspirer le filet. Répétez ce lavage deux fois de plus pour éliminer toutes les traces d’espèces d’ADN de courte longueur des sorties. Ajoutez maintenant 40 microlitres de tampon d’électrophorèse à l’échantillon.

Fermez bien les ports elucian et appuyez sur le bouton d’exécution pour reprendre le processus elucian. À la fin du programme Ellucian à la paire de bases 410, collectez les 40 microlitres d’Inuit à tous les points de sortie et étiquetez ces fractions comme la fraction supérieure de la bibliothèque. À ce stade, les deux fractions de bibliothèque sont purifiées en gel et déjà pour la conversion au bisulfite.

À l’aide d’un kit disponible dans le commerce, effectuez le test de conversion du bisulfite sur les deux fractions de banque. À la dernière étape du processus de conversion, éluez les échantillons d’ADN dans 40 microlitres d’eau libre d’ADN. Après la conversion du bisulfite, les fragments de la banque d’ADN résultants subiront une amplification PCR d’enrichissement à l’aide d’amorces qui s’hybrident aux extrémités adaptatrices de chaque molécule d’ADN.

Pour préparer d’abord la PCR d’enrichissement, ajoutez 160 microlitres du mélange maître PCR à chaque aliquote de 40 microlitres d’un échantillon converti par sulfure. Divisez ensuite le mélange de 200 microlitres obtenu en quatre aliquotes de 50 microlitres. Dans des tubes PCR séparés.

Placez les tubes dans un thermocycleur et amplifiez la matrice d’ADN convertie. Après l’enrichissement, tirez les quatre produits post-PCR dans un seul tube de 1,5 millilitre et purifiez l’ADN avec un kit de nettoyage PCR commercial. Si un kit d’extraction en phase solide à billes magnétiques est utilisé pour purifier les produits PCR, modifiez les procédures opératoires standard en mélangeant d’abord les produits PCR combinés de la bibliothèque inférieure avec 1,7 fois leur volume total en billes.

Mélangez ensuite les produits PCR combinés de la bibliothèque supérieure avec 1,1 fois leur volume total en billes. Suivez ensuite le protocole du fabricant jusqu’aux étapes de lavage à 70 % d’éthanol où chacun des volumes de lavage doit être changé à 800 microlitres à la dernière étape du processus de purification. Éluez l’ADN avec 50 microlitres de tampon d’élution libre d’ADN.

Stocker les banques purifiées à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires à l’aide d’un test basé sur la fluorescence sélectif pour l’ADN double brin, quantifier la quantité d’ADN post-enrichissement pour chaque fraction de bibliothèque. De plus, évaluez la taille et la qualité de la bibliothèque post-enrichissement à l’aide d’un bioanalyseur. Calculez la molarité effective de l’ADN d’une fraction de banque particulière en utilisant la longueur moyenne de l’ADN exprimée en paires de bases.

Une fois la molarité connue, utilisez l’eau libre de l’ADN pour diluer chaque fraction de bibliothèque supérieure et inférieure correspondante jusqu’à une concentration finale de deux nanomolaires. Combinez les paires de bibliothèques inférieure et supérieure en un seul tube pour créer un mélange de bibliothèque de deux trous nanomolaires de 20 microlitres chacun. L’échantillon groupé est maintenant prêt pour une séquence d’exécution.

Dans les essais liés au séquençage, y compris E-R-R-B-S, la qualité et la distribution granulométrique des molécules de la bibliothèque supérieure et inférieure sont des facteurs clés pour déterminer la qualité des données de séquençage finales. Par rapport aux protocoles d’extraction manuelle de gel traditionnels, l’appareil d’extraction de gel automatisé utilisé dans le protocole E-R-R-B-S produira une distribution granulométrique cohérente et minimisera le risque de contamination croisée des échantillons. Ensuite, lors de l’envoi des molécules de la bibliothèque de sulfites converties BIS pour le séquençage, les données brutes de tous les brins d’ADN montrent que pour un brin donné, la qualité des données pour chaque position de nucléotide augmente considérablement juste après les trois premiers nucléotides.

Depuis la séquence consensus pour ces trois nucléotides définis avec CGG pour la grande majorité des molécules de la bibliothèque, les données suggèrent que le protocole E-R-R-B-S a produit une collection de bibliothèques qui contient un ensemble souhaitable de fragments génomiques principalement flanqués. Avec MSP, une synthèse de restriction se termine d’un point de vue d’oiseau. Le protocole E-R-R-B-S peut produire des données de résolution de paires de bases des sites de méthylation de la cytidine sur l’ensemble du génome.

Par exemple, le chromosome 12 est montré ici. Le protocole couvre une représentation réduite des CPG à l’échelle du génome. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer les bibliothèques E-R-R-B-S pour la génération de données de méthylation de résolution de base D-N-A-C-P-G Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre jours si elle est effectuée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de commencer avec de l’ADN de haute qualité, d’inclure toutes les étapes décrites, de valider l’efficacité de la conversion du bisulfate et de séquencer à l’aide des paramètres recommandés. N’oubliez pas que travailler avec du phényle et du chloroforme peut être extrêmement dangereux. Les précautions courantes, telles que le travail dans une hotte chimique et l’élimination appropriée des déchets, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

En suivant cette procédure. D’autres méthodes telles que le séquençage spyrologique ou l’épitype de masse peuvent être effectuées pour valider les résultats. De plus, le profilage de l’expression génique peut être effectué pour déterminer la signification biologique des modèles de méthylation de l’ADN détectés.

La capacité de générer de l’ADN avec une résolution de paires de bases et des modèles de méthylation à partir de quantités limitées de matériaux d’entrée a permis de profiler des populations cellulaires rares, ce qui n’avait jamais été possible auparavant. Il a également rendu possible le profilage de grandes cohortes d’échantillons cliniques pour l’exploration de la régulation à médiation épigénétique et de l’hétérogénéité de la maladie.