Name: Induction directe de neurales humaines cellules souches à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang périphérique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Découvrez comment induire directement des cellules souches neurales à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques CD34+ du sang périphérique. Cette méthode permet de générer des neurones, astroglies et oligodendrocytes pour la recherche en neurosciences et médecine régénérative.

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

1. Enrichissement de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang total des adultes REMARQUE: Les cellules progénitrices hématopoïétiques ou les cellules CD34 + peuvent être purifiés à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) provenant de diverses sources, dont le sang de cordon, la matière de cytaphérèse et le sang total en utilisant des procédés à base de centrifugation à gradient de densité. Procédé énumérés ici utilise le sang total, par exemple. <ol><li> Isolement de PBMC de sang total: <ol><li> Ajouter 4,5 ml de milieu de séparation de lymphocytes au tube SepMate par aspiration à travers le trou central de l&#39;insert. </li><li> Diluer l&#39;échantillon de sang avec un volume égal de DPBS stériles contenant 2% de sérum humain (v / v). Par exemple, diluer 5 ml d&#39;échantillon avec 5 ml de DPBS + 2% de sérum humain. </li><li> Ajouter l&#39;échantillon dilué par pipetage vers le bas le côté du tube. Prenez soin de ne pas verser l&#39;échantillon directement dans le trou central. </li><li> Centrifuger à 1200 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Retirer délicatement le surnageant au-dessus de la couche PMBC. </li><li> Recueillir la couche PBMC (de trouble) dans un nouveau tube. </li><li> Ajouter 15 ml de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco contenant 2% de sérum humain dans le tube et centrifuger à 150 g pendant 10 min à température ambiante avec le frein hors tension. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 15 ml de DPBS contenant 2% de sérum humain. Comptez le nombre de cellules. </li><li> Centrifuger à 690 g pendant 10 min à température ambiante. Retirez tout le surnageant du tube. </li><li> Resuspendre les cellules à 1 x 10 7 cellules par ml de milieu 15 (IMDM) de Dulbecco modifié par Iscove contenant 1% d&#39;antibiotique (v / v) et 10% de sérum humain (v / v). </li><li> Incuber les cellules O / N à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur avant d&#39;isoler des cellules CD34 +. </li></ol></li><li> La sélection positive de cellules CD34 + à partir de PBMC en utilisant CD34 Multisort Kit: REMARQUE: travailler vite et d&#39;utiliser des solutions pré-refroidi à rendre les cellules froid et prévenir plafonnementdes anticorps sur la surface cellulaire et marquage des cellules non-spécifique par l&#39;instruction du kit. <ol><li> Ramassez tous PMBC dans un tube de 50 ml et de compter le nombre de cellules totales dans le milieu. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 10 min. Retirez tout le surnageant complètement. </li><li> Remettre en suspension à 10 8 cellules par 300 pi de tampon de talon (DPBS contenant 0,5% de sérum humain (v / v) et 2 mM EDTA). </li><li> Ajouter 100 pi de réactif de blocage FcR et ajouter 100 pi de MultiSortMicroBeads CD34. </li><li> Mélangez bien et incuber pendant 30 min au réfrigérateur (2-8 ° C). </li><li> Laver les cellules par addition de 2 ml de tampon de talon 10 8 cellules par centrifugation et à 300 xg pendant 10 min à température ambiante. Retirer le surnageant complètement. </li><li> Remettre en suspension à 10 8 cellules dans 500 ul de tampon. </li><li> Placer la colonne MACS LS dans le champ magnétique d&#39;un séparateur MACS et préparer colonne par rinçage avec 3 ml de tampon de talon. </li><li> Appliquer suspension cellulaire sur le center de la colonne. Cellules non marquées iront à travers lequel peuvent être collectées si l&#39;on préfère. </li><li> Laver la colonne trois fois avec 3 ml de tampon de talon. </li><li> Retirer la colonne du séparateur et le placer sur un tube de 15 ml. </li><li> Ajouter 5 ml de tampon de perles sur la colonne et rincer immédiatement les cellules magnétiquement marquées en poussant le piston dans la colonne. </li><li> Ajouter 20 ul de réactif Multisort sortie pour 1 ml de suspension cellulaire. Mélangez bien et incuber pendant 10 min au réfrigérateur (2-8 ° C). </li><li> Ajouter 1-2 ml de tampon de talon pour 10 7 cellules et centrifuger les cellules à 300 xg pendant 10 min à température ambiante. Retirer le surnageant complètement. </li><li> Resuspendre les cellules dans 50 ul de tampon de talon pour 10 7 cellules. </li><li> Ajouter 30 ul de Multisort arrêt réactif par 10 7 cellules et incuber pendant 15 min au réfrigérateur. </li><li> Ajouter 5 ml de tampon de talon et centrifuger les cellules à 300 xg pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant. </li></ol></li></ol> 2. Dérivation de induite cellules souches neurales à partir de cellules CD34 + <ol><li> Cellules CD34 + la culture: REMARQUE: milieu fraîchement préparée doit être utilisée dans les 7 jours lorsqu&#39;ils sont conservés dans le réfrigérateur. Importante perte de cellules CD34 pourrait être observée après 24 h, mais la prolifération significative des cellules doit être perceptible, surtout après jour 5. Si le nombre de cellules diminue de façon continue ou il n&#39;y a pas la prolifération, il implique soit mauvaise qualité des cellules de moyennes ou CD34 et les cellules ne doit pas être utilisé pour l&#39;étape suivante. <ol><li> Remettre en suspension et la culture des cellules CD34 + à CD34 maintien milieu (milieu StemSpan SFEM contenant thrombopoïétine humaine (TPO, 100 ng / ml), fms-like tyrosine kinase 3 (Flt-3) ligand (100 ng / ml) et facteur des cellules souches (SCF, 100 ng / ml), interleukine-6 ​​(IL-6, 20 ng / ml) et d&#39;interleukine-7 (IL-7, 20 ng / ml)) dans une plaque à 24 puits (jusqu&#39;à 3 x 10 5 / puits dans 1 ml de milieu par puits) à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. </li><li> After 24 h, de recueillir les cellules flottantes et centrifuger les cellules à 110 xg à température ambiante pour se débarrasser de toutes les cellules attachées et les débris cellulaires. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de CD34 maintenir à moyen et graines fraîches dans une nouvelle plaque de 24 puits (jusqu&#39;à 1 x 10 5 / puits) à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur pour cinq jours supplémentaires. </li><li> Remplacer la moitié du milieu tous les deux jours en aspirant soigneusement la partie supérieure du surnageant, tandis que les cellules CD34 + sont flottantes sur le fond des puits (figure 1A). </li></ol></li><li> Virus Sendai transfection: <ol><li> Au jour 5, recueillir les cellules CD34 et centrifuger les cellules à 170 xg pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans du milieu frais à 1 x 10 5 / puits dans une plaque à 24 puits dans 1 ml de milieu. </li><li> Décongeler un kit de reprogrammation cytotune-iPS Sendai immergeant d&#39;abord par les fonds des tubes dans un bain d&#39;eau à 37 C ° pendant 10 secondes puis dégeler complètement unt RT. Centrifuger brièvement les tubes et les mettre sur la glace. Préparer le mélange de virus de Sendai en mélangeant la quantité recommandée de chaque virus figurant sur le certificat d&#39;analyse (COA) pour le lot correspondant. MOI 15 est recommandé. </li><li> Ajouter virus Sendai mélange à chaque puits de cellules CD34. Mélanger les puits en agitant doucement. Incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Observer l&#39;efficacité de transfection après 24 h. Notez que des agrégats de cellules et la formation de sphère sont des indicateurs pour la transfection avec succès (Figure 1B). </li><li> Changer la moitié du milieu par le transfert attentivement la moitié supérieure du milieu à un autre puits. Se il ya des sphères de cellules dans le nouveau puits, ajouter la même quantité de milieu frais. </li><li> Changer le milieu tous les jours par l&#39;autre étape 2.2.6 répéter. </li></ol></li><li> Neural induction de cellules souches: REMARQUE: Selon les conditions cellulaires, environ 5 ou 7 jours après la transfection, les cellules adhérentes monocouches atteindront 30 -50% de confluence (figure 1C). <ol><li> Retirer le surnageant contenant des cellules et des sphères flottantes, puis ajouter 1 ml de milieu de progéniteur neural (milieu de Eagle modifié par Dulbecco: mélange nutritif F-12 (DMEM / F12), contient 1x N2 supplément, 0,1% (p / v) de sérum-albumine bovine ( BSA), 1% (v / v) d&#39;antibiotiques, 20 ng / ml de facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF), et 20 ng / ml de facteur de croissance épidermique (EGF)) dans les cellules adhérentes. </li><li> Eventuellement, dissocier les sphères de cellules par pipetage doucement et centrifuger les cellules à 170 xg pendant 10 min. Eliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu de progéniteur neural dans une nouvelle plaque à 24 puits revêtue de Matrigel par l&#39;instruction en tant que back up. </li><li> Changer le support tous les jours jusqu&#39;à ce que les cellules atteignent 60 à 80% de confluence, généralement après 1 semaine. </li><li> Jeter le surnageant et ajouter 1 ml de milieu de cellules neuronales souches de cellules (milieu sans sérum, NSC SFM). Dissocier les cellules en utilisant un grattoir à cellules suiviepar pipetage très doux. </li><li> Retirez les cellules et ensemencer tous dans un puits d&#39;une plaque à 6 puits. Ajouter un autre 1 ml de milieu de cellules souches neurales pour faire 2 ml de milieu pour chaque puits. Incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Changer le milieu tous les autres jours. </li><li> Lorsque les cellules ont atteint 60% de confluence, se dissocier et Réensemencement les cellules au ratio de 1: 3 suivant les étapes 2.3.4 et 2.3.6. </li></ol></li><li> La congélation des cellules souches neurales: <ol><li> Préparer cellules neuronales souches milieu de congélation par addition de 20% de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans le milieu de cellules souches neurales. Gardez le milieu de congélation sur la glace. </li><li> Dissocier les cellules dans une plaque à 6 puits, à l&#39;aide grattoir à cellules suivie par un léger pipetage. Compter les cellules. Centrifuger les cellules à 170 xg pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans un milieu de cellules souches neurales à 1 x 10 6 / ml. Ajouter le même volume de milieu de congélation aux cellules. </li><li> Ajouter 1 ml (5 x 10 5 cellules totales) de cellules dans un cryotube. Geler les cellules en utilisant un récipient de congélation M. Froster suivant les instructions. </li></ol></li></ol> 3. Neural différenciation cellulaire <ol><li> La différenciation des cellules neuronales: <ol><li> Lorsque les cellules souches neurales atteignent 80% de confluence, détacher les cellules souches neurales en utilisant une spatule en caoutchouc, puis dissocier par un léger pipetage. </li><li> Compter les cellules et ajuster la concentration de 1 x 10 5 / ml dans un milieu de cellules souches neurales. </li><li> Pour la différenciation neuronale, la plaque sur les cellules poly-D-lysine / laminine couvercle glisse dans des plaques à 24 puits à 1 x 10 5 / puits. Incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Remplacer le milieu par du milieu de différenciation neuronale (DMEM / F12 contenant 1x N2 sus, 1x B27, 300 ng / ml AMPc, 0,2 mM de vitamine C, 10 cerveau ng / ml facteur neurotrophique dérivé (BDNF) et 10 ng / ml dérivé des cellules gliales facteur neurotrophique (GDNF)) after 24 h. Incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Changer milieu de différenciation neuronale deux fois par semaine pendant 2 semaines. </li></ol></li><li> La différenciation astrogliale: <ol><li> Dissocier les cellules souches neurales par pipetage. </li><li> Compter les cellules et ajuster la concentration de cellules de 5 x 10 4 cellules / ml. Ensemencer les cellules sur des plaques à 24 puits. Incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Remplacer le milieu par du DMEM / F12 avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Changer le milieu deux fois par semaine pendant deux semaines. Si les cellules atteignent la confluence avant deux semaines, Réensemencement les cellules suivantes étapes 3.2.1 et 3.2.2. </li></ol></li><li> différenciation des oligodendrocytes: <ol><li> Dissocier les cellules souches neurales par pipetage. </li><li> Compter les cellules et des semences 1 x 10 5 cellules sur des plaques à 24 puits revêtues de poly-L-ornithine dans 1 ml de oligodendrocytes differentiSupport d&#39;ation constitué de DMEM / F12 contenant du supplément N2, 10 ng / ml de dérivé des plaquettes facteur-AA de croissance (PDGF-AA), 2 ng / ml de la neurotrophine-3 (NT-3), 2 ng / ml de sonic hedgehog ( Shh), et 3 nM de triiodothyronine (T3). Incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. </li><li> Changer le milieu deux fois par semaine pendant deux semaines. </li><li> Remplacez le support avec du DMEM / F12 avec supplément 1xN2 et 3 nM de T3 et de la culture des cellules pour une semaine supplémentaire pour la protéine de base myéline (MBP) production. </li></ol></li></ol> 4. immunofluorescence <ol><li> Remplacez le support avec 4% de paraformaldehyde (PFA). Incuber pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Jeter PFA et laver avec du PBS contenant 0,1% de Triton X-100 (PBS-T) 3 fois, 5 min à chaque fois. </li><li> Perméabiliser les cellules avec du PBS contenant 0,5% de Triton X-100 pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Bloquer les cellules avec du PBS-T contenant du sérum de chèvre à 4% pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Incuber les cellules avec Antibo primaire correspondantematrices dilué dans du PBS-T contenant 0,1% de BSA pendant 2 h à RT ou O / N dans la chambre froide. </li><li> Laver les cellules à trois reprises avec du PBS-T, 5 min à chaque fois. Incuber les cellules avec des anticorps secondaires couplés à un fluorochrome en utilisant une correspondant: 400 dilution dans du PBS-T contenant 0,1% de BSA pendant 1 heure sur un agitateur dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules avec du PBS-T contenant 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Laver les cellules deux fois avec du PBS-T pendant 5 min chacun à TA. </li><li> Respecter les cellules marquées à l&#39;aide d&#39;un microscope et prendre des photos (figure 3). </li></ol>

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</ol>

L’étude est financée par des fonds intra-muros des NIH.

Un protocole détaillé pour générer directement des cellules souches neurales à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques périphériques est fourni. Par rapport à des cellules de fibroblastes, du sang périphérique humain est plus accessible. En utilisant le protocole présenté, plus de 1 x 10 5 cellules progénitrices hématopoïétiques, ou des cellules positives CD34, peuvent être enrichies à partir de 10 ml de sang entier. Bien que la contamination par des plaquettes est génér...

In vitro des cultures de neurones ont été utilisés comme un outil fondamental pour l&#39;étude des maladies neurologiques. Animaux primaires (principalement les rongeurs) des cultures de neurones 1, 2 et des lignées de cellules neurales humaines dérivées de gliomes et autres tumeurs sont le plus couramment utilisé dans de telles études. Cependant, il a été reconnu qu&#39;il existe des différences significatives entre les rongeurs et les cellules humaines. Beaucoup de conclusions fondées sur les rongeurs ne peuvent pas être convertis pour les humains. En outre, avec l&#39;évolution rapide dans l&#39;analyse de l&#39;information de masse génomique et le montage de gène relativement facile et le séquençage du génome entier, la tendance est de plus en plus axé sur la découverte de gènes sujettes aux maladies et de délimiter leurs fonctions et leurs rôles dans les maladies spécifiques, ce qui rend les quelques neuronal humain lignées cellulaires ne ont limité l&#39;utilisation. Théoriquement, les cultures de neurones primaires humaines dérivées à partir d&#39;échantillons du système nerveux du patient sont le meilleur choix, mais ils sont impossibles à obtenir; meth donc alternatifSAO sont nécessaires. Au cours des dernières années, certaines approches ont été poursuivis, avec deux étant le plus distinguée. Après le développement de la technique de génération de cellules souches pluripotentes induites (CISP) en utilisant la souris et des cellules somatiques humaines 3, 4, cellules neurales pourrait être encore différencié d&#39;eux 7.5. Cependant, la génération et la caractérisation iPSC demande de main-d&#39;œuvre, les techniques, et l&#39;entrée de temps, parfois même prohibitif. Peu de temps après, une autre approche a été développée pour transformer directement des cellules neuronales à partir de cellules somatiques 8, 9. Comme les neurones qui en résultent sont non proliférative, il limite son application dans des études intensives et le criblage de médicaments, ce qui nécessite une grande quantité de cellules. Pour profiter des avantages des deux techniques, dérivation directe des souches neurales / cellules progénitrices de cellules somatiques a été explorée par plusieurs groupes de 10 à 12, qui contourne le processus fastidieux de la production et la caractérisation iPSC mais toujours dispodes un nombre décent de cellules souches neurales pour différenciation neurale tard. Nous avons précédemment montré que, suite à l&#39;introduction de facteurs de transcription Yamanaka dans des cellules progénitrices hématopoïétiques, les cellules souches neurales peuvent être générés directement en utilisant une cellule neuronale progénitrice 13 Sélection du support. Ici, nous rapportons la méthode en détail.

<table><tbody><tr><td>Milieu de séparation des lymphocytes</td><td>Lonza</td><td>17-829E</td><td>1x</td></tr><tr><td>SepMate</td><td>Stemcell Technologies</td><td>15415</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Sérum humain</td><td>Invitrogen</td><td>34005-100</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotiques</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>1 %</td></tr><tr><td>CD34 MultiSort Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-056-701</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Cellgro</td><td>46-034-Cl</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MACS LS colonne</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9650</td><td>1x</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Quality Biologicals</td><td>112-035-101</td><td>1x</td></tr><tr><td>TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Flt-3</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>Peprotech</td><td>200-07</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>IPS Sendai Kit de reprogrammation</td><td>Life Technologies</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>Racleur de cellules</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>CryoTube flacons</td><td>Thermo</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty container</td><td>Thermo</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12400-024</td><td>1x</td></tr><tr><td>supplément N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>1x</td></tr><tr><td>albumine sérique bovine</td><td>Sigma</td><td>A2934</td><td>0,1 % (p/v)</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplément</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>sérum sans sérum NSC moyen</td><td>Life Technologies</td><td>A1050901</td><td>1x</td></tr><tr><td>lamelles enrobées de poly-D-lysine/laminine</td><td>BD Bioscences</td><td>354087</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A9501</td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>Vitamine C</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td>0,2 mM</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td>1x</td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td>2 ng/ml</td></tr><tr><td>Shh</td><td>Peprotech</td><td>1314-SH/CF</td><td>2 ng/ml</td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td>3 nM</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>4 %</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Qualité Biologique</td><td>119-069-101</td><td>1x</td></tr><tr><td>sérum de chèvre</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>4 %</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Souris monoclonale anti-Nestin</td><td>Millipore</td><td>AB5922</td><td>dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>Anti-SOX2 anticorps</td><td>Cellules souches appliquées</td><td>ASA0120</td><td>Prêt à l’emploi</td></tr><tr><td>Souris anti-&bêta ; Anticorps III-tubuline</td><td>Promega</td><td>G712A</td><td>dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-GFAP de lapin</td><td>Sigma</td><td>G4546</td><td>dilution 1:100</td></tr><tr><td>Anticorps anti-O4</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1326</td><td>IgM ; 1 ng/ml</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 chèvre anti-lapin</td><td>anticorps Life techniologies</td><td>A11012</td><td>dilution 1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris</td><td>Life techniologies</td><td>A11001</td><td>dilution 1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgM</td><td>anticorps Life techniologies</td><td>A21042</td><td>dilution 1:250</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 &mu ; g/ml</td></tr></tbody></table>

induction directe de neurales humaines cellules souches à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang périphérique

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Cultures de neurones spécifiques de maladies humaines sont essentielles pour générer des modèles in vitro pour les maladies neurologiques humaines. Cependant, le manque d&#39;accès aux cultures de neurones adultes humaines primaires soulève des défis uniques. Les développements récents dans les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) fournit une approche alternative pour obtenir des cultures de neurones à partir de fibroblastes de la peau grâce à des patients iPSC spécifique, mais ce processus est beaucoup de travail, nécessite une expertise spéciale et de grandes quantités de ressources, et peuvent prendre plusieurs mois. Cela empêche la large application de cette technologie à l&#39;étude des maladies neurologiques. Pour surmonter certaines de ces questions, nous avons développé une méthode pour produire des cellules souches neurales directement à partir de sang périphérique humain adulte, en contournant le processus de dérivation iPSC. Des cellules progénitrices hématopoïétiques enrichies à partir du sang périphérique humain adulte ont été cultivées in vitro et transfectées avec des vecteurs du virus Sendai contenant des facteurs de transcription Sox2, octobre4.3, Klf4, et c-Myc. Les résultats de transfection dans des changements morphologiques dans les cellules qui sont ensuite sélectionnés à l&#39;aide de milieu neuronale progénitrice humaine contenant le facteur de croissance des fibroblastes (bFGF) et le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF). Les cellules résultantes sont caractérisées par l&#39;expression de marqueurs de cellules souches neurales, comme la nestine et SOX2. Ces cellules souches neurales peuvent être en outre différenciés pour les neurones, astrocytes et oligodendrocytes dans un milieu de différenciation spécifique. En utilisant des échantillons facilement accessibles du sang périphérique humain, cette méthode pourrait être utilisée pour dériver des cellules souches neurales pour une différenciation plus poussée de cellules neurales pour la modélisation in vitro de troubles neurologiques et peut progresser les études liées à la pathogenèse et le traitement de ces maladies.

<html> La qualité des cellules CD34 est critique pour le succès de neurones transduction de cellules souches. Cellules CD34 haute qualité prolifèrent au cours du premier couple de jours de culture et apparaissent comme non adhérente, les cellules homogène rondes, flottant juste au-dessus du fond des récipients de culture (figure 1A). Les résultats de l&#39;infection réussie en agrégats de cellules, qui se étend au fil du temps (figure 1B), tandis que les agrégats de cellules non spécifiq...

Une méthode a été développée afin de dériver directement des cellules souches neuronales humaines à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques enrichies de cellules du sang périphérique.

Induction directe de neurales humaines cellules souches à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang périphérique

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

L'objectif général de cette procédure est d'induire directement des cellules souches neurales à partir de cellules sanguines. Cela est réalisé en premier lieu en enrichissant les cellules progénitrices hématopoïétiques positives pour le CD 34 provenant du sang. La deuxième étape consiste à transfecter les cellules CD 34 avec un virus sendaï contenant des facteurs de transcription.Ensuite, les cellules souches neurales sont obtenues à l'aide d'un milieu sélectif. La dernière étape consiste à différencier les cellules souches neurales induites en neurones, en astroglies et en oligodendrocytes. Enfin, une microscopie par immunofluorescence est utilisée pour caractériser les cellules obtenues.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la durée des neurones directement à partir de fibroblastes ou la génération de cellules IPS, est qu'elle contourne le processus fastidieux de génération et de calcul des cellules IPS, tout en fournissant néanmoins une grande quantité de cellules neuronales capables de se lier et de se différencier en neurones. J'ai eu pour la première fois l'idée de cette méthode en remarquant que les cellules CT 34 transfectées attachées présentaient en réalité une morphologie très similaire à celle des cellules progénitrices neuronales en culture primaire, démontrant ainsi que la procédure serait réalisable par Marjane, une technicienne de mon laboratoire. Après avoir isolé les cellules CD 34 à partir des cellules mononucléées du sang périphérique selon les instructions du protocole décrit, commencez le processus de culture des cellules CD 34 en les resuspendant dans un milieu spécifique pour cellules CD 34, puis semez les cellules dans une plaque de 24 puits à raison de trois fois 10 à la puissance cinq cellules par puits dans un millilitre de milieu.Après une incubation de 24 heures dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone, récupérez les cellules en suspension et centrifugez la suspension cellulaire à 110 ×g à température ambiante. Ensuite, jetez le surnageant et resuspendez les cellules dans un milieu de maintien CD34 frais. Semez dans une nouvelle plaque de 24 puits à raison d'une fois 10 à la puissance 5 cellules par puits dans un millilitre de milieu, incubez à 37 degrés Celsius dans un incubateur avec 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq jours supplémentaires, en renouvelant la moitié du milieu tous les deux jours.En aspirant soigneusement la moitié supérieure du surnageant tandis que les cellules CD 34 se trouvent au fond des puits, comme illustré ici au cinquième jour. Après la mise en culture, récupérez les cellules CD 34 et centrifugez-les à 170 × g pendant 10 minutes à température ambiante, jetez le surnageant, resuspendez les cellules comme précédemment et ensemencez une nouvelle plaque de 24 puits à raison d'une fois 10 à la puissance cinq cellules par puits dans un millilitre de milieu. Ensuite, décongelez un kit de reprogrammation cyto tune IPS Sendi.Tout d'abord, immergez les extrémités inférieures des tubes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10 secondes, puis laissez-les dégeler complètement à température ambiante. Effectuez une courte centrifugation des tubes et placez-les sur de la glace. Préparez le mélange de virus de Sendai en mélangeant le volume recommandé de chaque virus indiqué sur le certificat d'analyse du lot correspondant.Une multiplicité d'infection de 15 est recommandée. Ajouter le mélange de virus de Sendai à chaque puits de cellules CD 34. Ensuite, mélanger les puits en agitant doucement la plaque.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Observer l'efficacité de la transduction. Remarquer que les agrégats cellulaires et les sphères, tels que ceux illustrés ici, sont des indicateurs d'une transduction réussie.Ensuite, incuber les cellules dans l'incubateur de culture tissulaire pendant cinq à sept jours jusqu'à ce que des cellules adhérentes apparaissent et atteignent une confluence de 30 à 50 %, comme indiqué ici, tous les deux jours. Changer la moitié du milieu en transférant soigneusement la moitié supérieure du milieu vers un autre puits. Si des sphères cellulaires sont transférées vers le nouveau puits, ajouter une quantité équivalente de milieu frais.Vérifiez la confluence des cellules à l’aide du microscope inversé. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 30 à 50 %, aspirez le surnageant et mettez-le de côté, puis ajoutez un millilitre de milieu de progéniteurs neuronaux dans chaque puits afin de préparer une plaque de secours en utilisant les sphéroïdes présents dans le surnageant. Centrifugez le surnageant réservé à 170 × g pendant 10 minutes. Aspirez ensuite le surnageant et resuspendez le culot dans du milieu de progéniteurs neuronaux ; plaquez dans une plaque de 24 puits revêtue de matrigel.Comme précédemment, changez le milieu dans chaque plaque de cellules tous les deux jours jusqu'à ce que les cellules atteignent une confluence de 60 à 80 %. Habituellement après une semaine. Une fois que les cellules ont atteint la confluence requise, aspirez le surnageant et ajoutez un millilitre de milieu pour cellules souches neurales à chaque plaque.Ensuite, dissociez les cellules en utilisant un grattoir à cellules, suivi d'un pipetage très doux. Puis, transférez les cellules d'un puits de la plaque 24 puits vers un puits d'une plaque 6 puits.Ajoutez un autre millilitre de milieu dans le puits, puis, après avoir répété la procédure pour tous les puits, placez la plaque à six puits dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Changez le milieu entièrement tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence de 60 %, après quoi dissociez et repiquez les cellules selon un rapport de un à trois, comme vient d’être montré, afin de congeler une partie des cellules souches neurales non différenciées. Préparez d’abord le milieu de congélation des cellules souches en ajoutant 20 % de diméthylsulfoxyde ou DMSO au milieu de cellules souches neurales, puis placez-le sur de la glace.Ensuite, dissocier les cellules dans la plaque à six puits à l’aide d’un grattoir à cellules et d’une pipetage doux. Réserver un aliquot de la suspension pour un décompte cellulaire, puis centrifuger les cellules à 170 × g pendant 10 minutes à température ambiante. Pendant que les cellules tournent, dénombrer les cellules dans l’aliquot de suspension à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé, et calculer le volume de milieu nécessaire pour obtenir une concentration cellulaire de 1 × 10⁶ cellules par millilitre.Une fois la centrifugation terminée, éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans du milieu pour cellules souches neurales à raison d'un million de cellules par millilitre. Ensuite, ajouter un volume équivalent de milieu de congélation, puis transférer, à l'aide d'une pipette, cinq cent mille cellules dans un volume d'un millilitre dans un flacon cryogénique, et congeler les cellules dans un contenant de congélation selon les instructions du fabricant. Lorsque les cellules souches neurales dans la plaque à six puits atteignent une confluence de 80 %, les détacher à l'aide d'un grattoir en caoutchouc, puis les dissocier par pipetage doux.Regroupez la suspension cellulaire dans un tube stérile. Comptez les cellules à l’aide d’un hémo-cytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé, puis ajustez la concentration de la suspension cellulaire à 1 × 10⁵ cellules par millilitre avec le milieu pour cellules souches neurales. Ensuite, pipetez un millilitre de la suspension cellulaire sur un coverslip revêtu de poly-D-lysine et de laminine, dans un puits d’une plaque à 24 puits, après avoir répété la procédure pour le nombre de puits souhaité.Incuber comme précédemment pendant 24 heures. Une fois le temps d'incubation écoulé, aspirer le milieu et le remplacer par le milieu de différenciation neuronale. Incuber pendant deux semaines à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, en changeant le milieu deux fois par semaine après deux semaines.Les cellules souches neuronales doivent être complètement différenciées comme indiqué ici et prêtes pour des applications en aval telles que la coloration par immunofluorescence. Les deux premières images montrent que les cellules souches neurales expriment Nestin et SOX2. Alors que la troisième image démontre que OCT4 n'est pas exprimé, le DPI est utilisé comme marqueur nucléaire et l'échelle représente 200 microns.Après avoir suivi le protocole de différenciation décrit dans la vidéo, les neurones différenciés expriment le marqueur neuronal bêta-tubuline III. Les cellules souches neurales humaines peuvent également être différenciées en cellules gliales. Lorsqu'elles sont différenciées en astrocytes, les cellules expriment le marqueur astrocytaire GFAP.Enfin, sur cette image, les cellules ont été différenciées en oligodendrocytes et expriment le marqueur des oligodendrocytes, O quatre. Une fois maîtrisée, la génération de cellules souches neurales humaines induites à partir de sang périphérique peut être réalisée en environ trois semaines.Si elle est correctement réalisée, la méthode permettrait de différencier davantage les cellules souches neuronales en neurones et éliminerait la nécessité de recourir aux processus longs et complexes de génération de cellules IPS, offrant ainsi une option simple pour produire des cultures neuronales spécifiques à chaque patient après son développement. Cette technique ouvre une voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer la modélisation de cultures cellulaires individuelles pour divers troubles neurologiques, ce qui pourrait mieux représenter les différences génétiques liées à des affections spécifiques, en particulier à partir d'échantillons de patients individuels.

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Developmental Biology

Biologie du développement

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Induction directe de neurales humaines cellules souches à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang périphérique (Vidéo) | JoVE Journal

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