Induction directe de neurales humaines cellules souches à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang périphérique

L’objectif global de cette procédure est d’induire directement des cellules souches neurales à partir de cellules sanguines. Ceci est accompli en enrichissant d’abord des cellules progénitrices hématopoïétiques positives CD 34 à partir du sang. La deuxième étape consiste à transfecter des cellules CD 34 avec le virus Sendi contenant des facteurs transcriptionnels.

Ensuite, les cellules souches neurales sont dérivées à l’aide d’un milieu sélectif. La dernière étape consiste à différencier les cellules souches neurales induites en neurones, astroglies et oligodendrocytes. En fin de compte, la microscopie à immunofluorescence est utilisée pour caractériser les cellules résultantes.

Le principal avantage de cette technique par rapport à la méthode existante, comme la durée des neurones directement à partir du fibroblaste, ainsi que la génération IPS, est que cette méthode contourne le processus fastidieux de génération et de calcul IPS, mais fournit toujours une grande quantité de cellules neuronales qui peuvent se rapporter, se différencier aux neurones. J’ai d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque j’ai remarqué que les cellules CT 34 transfectées attachées présentaient en fait des résultats très similaires aux cellules neuroprogéniques primaires cultivées, démontrant que la procédure sera Marines, un technicien de ma vie. Après avoir isolé les cellules CD 34 des cellules mononucléées du sang périphérique conformément aux instructions du protocole textuel, commencez le processus de culture des cellules CD 34 par Resus, en suspendant les cellules CD 34 dans un milieu CD 34, puis ensemencez les cellules dans une plaque à 24 puits à trois fois 10 à la cinquième cellule par puits dans un millilitre de milieu.

Après une incubation de 24 heures dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone, collectez les cellules flottantes et centrifugez la suspension cellulaire à 110 fois G à température ambiante. Ensuite, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un nouveau milieu d’entretien CD 34. Voyez une nouvelle plaque de 24 puits à la fois 10 à la cinquième cellules par puits dans un millilitre de milieu, incubez à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq jours supplémentaires, en remplaçant la moitié du milieu tous les deux jours.

En aspirant soigneusement la moitié supérieure du surnageant tandis que les cellules CD 34 sont au fond des puits, comme indiqué ici le cinquième jour. Après le placage, prélever les cellules CD 34 et centrifuger les cellules à 170 fois G pendant 10 minutes à température ambiante, jeter le surnageant, remettre les cellules en suspension comme précédemment et ensemencer une nouvelle plaque de 24 puits à une fois 10 à la cinquième cellules par puits dans un millilitre de milieu. Ensuite, décongelez un kit de reprogrammation cyto tune IPS Sendi.

En immergeant d’abord le fond des tubes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10 secondes, puis en décongelant complètement à température ambiante. Centrifugez brièvement les tubes et mettez-les sur de la glace. Préparez le mélange de virus Sendai en mélangeant le volume recommandé de chaque virus indiqué sur le certificat d’analyse pour le lot correspondant.

Une multiplicité d’infection de 15 est recommandée. Ajoutez le mélange de virus Sendai dans chaque puits de cellules CD 34. Mélangez ensuite les puits en secouant doucement l’assiette.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone après 24 heures. Observez l’efficacité de la transduction. Notez que les agrégats de cellules et les sphères tels que ceux présentés ici sont des indicateurs de transduction réussie.

Ensuite, incubez les cellules dans l’incubateur de culture tissulaire pendant cinq à sept jours jusqu’à ce que les cellules attachées apparaissent et atteignent une confluence de 30 à 50 %, comme indiqué ici tous les deux jours. Changez la moitié du milieu en transférant soigneusement la moitié supérieure du milieu dans un autre puits. Si les sphères cellulaires sont transférées dans le nouveau, ajoutez une quantité égale de milieu frais.

Vérifiez la fluidité des cellules à l’aide du microscope inversé. Lorsque les cellules sont confluentes à 30 à 50 %, aspirez le surnageant et réservez, puis ajoutez un millilitre de milieu progéniteur neural dans chaque puits pour former une plaque de sauvegarde à l’aide des sphères de la centrifugeuse surnageante, le surnageant de réserve à 170 fois G pendant 10 minutes. Ensuite, aspirez le surnageant et mettez la pastille en suspension dans une plaque de milieu progéniteur neural dans une plaque à 24 puits recouverte de matrigel.

Comme précédemment, changez de milieu dans chaque plaque de cellules tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 60 à 80 % de confluence. Généralement après une semaine. Une fois que les cellules atteignent la confluence requise, aspirez le surnageant et ajoutez un millilitre de milieu de cellules souches neurales à chacune.

Ensuite, dissociez les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire, suivi d’un pipetage très doux. Ensuite, transférez les cellules d’un puits de la plaque de 24 puits dans un puits de six. Assiette de puits.

Ajoutez un autre millilitre de milieu dans le puits et, après avoir répété la procédure pour tous les puits, placez la plaque à six puits dans l’incubateur à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone. Changez le volume complet du milieu tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 60 % de confluence, après quoi dissociez et reflez les cellules dans un rapport de un à trois, comme il vient de le voir pour geler une partie des cellules souches neurales indifférenciées. Tout d’abord, préparez le milieu de congélation des cellules souches en ajoutant 20 % d’oxyde de diméthylsulf ou DMSO au milieu de cellules souches neurales et placez-le sur de la glace.

Dissociez ensuite les cellules dans la plaque à six puits. À l’aide d’un grattoir cellulaire et d’un pipetage doux. Réservez une aliquote de la suspension pour un comptage cellulaire, puis centrifugez les cellules à 170 fois G pendant 10 minutes à température ambiante pendant que les cellules tournent, comptez les cellules dans l’aliquote de suspension à l’aide d’un hémomètre, d’un cytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé et calculez le volume de milieu requis pour donner une concentration cellulaire de un fois 10 à six cellules par millilitre.

Une fois l’essorage terminé, jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un milieu de cellules souches neurales à une fois 10 à six cellules par millilitre. Ajoutez ensuite un volume égal de fluide de congélation à pipette cinq fois 10 aux cinquièmes cellules d’un millilitre dans un flacon cryogénique et congelez les cellules dans un récipient de congélation selon les instructions du fabricant. Lorsque les cellules souches neurales de la plaque à six puits atteignent 80 % de confluence, détachez-les à l’aide d’un policier en caoutchouc, puis dissociez-les par pipetage doux.

Regrouper la suspension cellulaire dans un tube stérile. Comptez les cellules à l’aide d’un hémomètre, d’un cytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé et ajustez la concentration de la suspension cellulaire à une fois 10 à la cinquième cellule par millilitre avec un milieu de cellules souches neurales. Ensuite, pipetez un millilitre de suspension cellulaire sur une lamelle recouverte de lysine poly D et de stratifié dans un puits d’une plaque de 24 puits après avoir répété la procédure pour le nombre de puits souhaité.

Incuber comme précédemment pendant 24 heures. Une fois le temps d’incubation écoulé, aspirez le milieu et remplacez-le par la différenciation neuronale. Le milieu incube pendant deux semaines à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, en changeant le milieu deux fois par semaine après deux semaines.

Les cellules souches neuronales doivent être complètement différenciées, comme indiqué ici, et prêtes pour des applications en aval telles que la coloration par immunofluorescence. Les deux premières images montrent que les cellules souches neurales expriment nid in et SOX deux. Alors que la troisième image démontre que l’OCT quatre n’est pas exprimé, le DPI est utilisé comme marqueur nucléaire et la barre d’échelle représente 200 microns.

Après avoir suivi le protocole de différenciation décrit dans la vidéo, les neurones différenciés expriment le marqueur neuronal bêta trois tubuline. Les cellules souches neurales humaines peuvent également être différenciées en cellules gliales. Lorsqu’elles sont différenciées en astrocytes, les cellules expriment le marqueur astrocytaire GFAP.

Enfin, dans cette image, les cellules ont été différenciées en oligodendrocytes et expriment le marqueur oligodendrocytes. O quatre. Une fois maîtrisée, la génération de cellules souches neurales humaines induites à partir du sang périphérique peut être effectuée en environ trois semaines.

Si elles sont effectuées correctement, les cellules souches neurologiques pourraient être des neurones différenciés davantage et la méthode n’est pas claire en raison des processus de génération IPS longs et compliqués et pourraient être une option facile pour générer des cultures neuronales spécifiques au patient après son développement. Cette technique permet aux chercheurs dans le domaine des neurosciences d’explorer la modélisation de cultures cellulaires individuelles pour divers troubles neurologiques, ce qui pourrait mieux représenter les différences génétiques dans des troubles spécifiques, en particulier à partir d’échantillons de patients individuels.