Name: Modulations environnementaux du mésencéphale Nombre de dopamine neurones chez la souris adulte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Découvrez les manipulations environnementales pour étudier la plasticité cérébrale chez la souris adulte. Cette méthode permet d'observer les changements des neurones dopaminergiques du mésencéphale et d'évaluer l'impact de l'enrichissement sur le comportement.

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Cette étude a été financée par le Conseil national de la santé et de la recherche médicale d’Australie (NHMRC) 1022839. AJH est un futur boursier (FT100100835) du Conseil australien de la recherche (ARC). Le Florey Institute of Neuroscience and Mental Health remercie le gouvernement de Victoria pour son soutien dans le cadre de la subvention de soutien à l’infrastructure opérationnelle.

NOTE: Toutes les procédures expérimentales sur les animaux ont été approuvés par l&#39;Institut Florey du comité d&#39;éthique de la santé animale Neuroscience &amp; mentale et conformes aux Conseil de recherches médicales national de santé et de l&#39;Australie a publié un code de pratique pour le soin et l&#39;utilisation des animaux à des fins scientifiques (7 e édition, 2004). 1. manipulations de l&#39;environnement <ol><li> Sexe Pairing <ol><li> Utilisez sexuellement matures (&gt; ancienne 8 semaines), mâle appariés pour l&#39;âge et les souris femelles. NOTE: Nous utilisons généralement souris C57BL / 6, mais avons eu les mêmes résultats en utilisant des souris Swiss dans ce protocole. Nous utilisons généralement n = 8 hommes et n = 8 femelles pour chaque expérience, divisé en n = 2 paires de mâles-mâle (n = 4 hommes), n = 2 femelle-femelle paires (n = 4 femmes), et n = 4 paires hommes-femmes (n = 4 mâles et 4 femelles n =). </li><li> À l&#39;arrivée dans le centre de détention des animaux, groupe-maison, les souris par sexe pour&gt; 3 jours pour se acclimater. Ici et throughout l&#39;appariement entre les sexes, garder stimuli environnementaux extérieurs (par exemple la température ambiante, la lumière: cycle d&#39;obscurité, de la nourriture, de l&#39;eau, la manipulation et le nettoyage) constante ou distribuer également à toutes les souris. </li><li> Affecter aléatoirement chaque souris à une paire de mâle-mâle, une paire de femelle-femelle, ou une paire de mâle-femelle. Placez chaque paire dans une cage propre dans l&#39;isolement (2 souris / cage) avec accès ad libitum à la nourriture et de l&#39;eau, et il suffit de les accueillir de cette manière continue pendant 7 jours. NOTE: Routine l&#39;élevage est OK cours de cette période, mais doit être répartie également entre toutes les souris. Prenez soin d&#39;éviter appariement des congénères masculins et féminins. </li></ol></li><li> Enrichissement de l&#39;environnement <ol><li> Utilisez, mâles ou femelles souris appariés selon l&#39;âge sexuellement matures (&gt; ancienne 8 semaines). NOTE: Nous utilisons généralement n = 18 souris pour chaque expérience, répartis en groupe n = 6 / de traitement. </li><li> À l&#39;arrivée dans le centre de détention des animaux garder logé dans la norme identique hébergé en groupe (SH) (par exemple, </em&gt; Voir ci-dessous) conditions à ce stade&gt; 3 jours pour se acclimater. Ici et toute l&#39;expérience, gardez stimuli environnementaux extérieurs (par exemple la température ambiante, la lumière: cycle d&#39;obscurité, de la nourriture, de l&#39;eau, la manipulation et le nettoyage) constante ou répartir équitablement à toutes les souris. </li><li> Pour commencer l&#39;enrichissement de l&#39;environnement, d&#39;attribuer au hasard chaque souris à l&#39;un des trois groupes: SH; roue en cours d&#39;exécution (RW), ou de l&#39;environnement enrichi (EE) et placer chaque groupe de souris ainsi que dans une cage propre identiques avec un accès ad libitum à la nourriture et de l&#39;eau. REMARQUE: Ici, de plus grandes cages de rats-tenant pour tous les groupes, mesure 27 cm de large, 42 cm de long et 16 cm de profondeur ont été utilisés. <ol><li> En outre, fournir les conditions suivantes environnementales à chaque groupe: SH comprenant seulement la litière (boulettes de papier ou de la sciure) sur le sol; RW comprenant SH plus 2 roues fonctionnement; EE comprenant RW ainsi que les jouets (cordes, échelles, tunnels, et des objets tels que vides rouleaux de serviettes en papier et des morceaux de papier de soie) avec lequel explore, jeu, grimper, se cacher, et le nid. </li><li> Les loger dans cette façon continue pendant 14 jours. NOTE: Routine l&#39;élevage est OK cours de cette période, mais doit être répartie également entre toutes les souris. </li></ol></li><li> EE souris soumises à des super-enrichissement &#39;additionnel (SE) en les plaçant ensemble dans une cage plus grande contenant de nouveaux jouets pour 1 heure / jour (même heure chaque jour), 5 jours / semaine. NOTE: Voici, un 46 cm de large, 69 cm de long et 40 cm de profondeur baignoire en plastique a été utilisé. <ol><li> Maintenir la nouveauté en présentant un ensemble différent de jouets chaque session. Jouets propres qui doivent être re-présentées à des souris avec de l&#39;eau savonneuse et 80% d&#39;éthanol pour éliminer les odeurs. </li><li> Après chaque séance SE, retourner les souris dans leur cage d&#39;EE. Poignée SH et souris RW même que les souris SE (sauf pour SE lui-même) tout au long de cette période (par exemple, retirer et restituer chaque SH et RW souris depuis et vers sa cage). </li></ol></li></ol></li></ol><ol><li> Préparation <ol><li> Utilisation des pompes osmotiques et des kits stériles de perfusion du cerveau, qui sont disponibles dans le commerce. Le jour avant l&#39;implantation, en utilisant une technique aseptique, les premiers implants en remplissant chaque pompe, tube et de raccordement de canule avec une solution stérile de médicament ou de véhicule (comme décrit dans les instructions fournies avec les pompes). Branchez-les ensemble et incuber dans une solution saline stérile nuit à 37 ° C. Incuber implants drogue et de véhicules remplis séparément pour éviter la contamination croisée. </li></ol></li><li> Surgery. REMARQUE: Selon le pays de l&#39;expérimentateur, permis ou de quotas de l&#39;expérimentation animale spéciaux sont nécessaires pour poursuivre ces types de chirurgie et expériences post-opératoires. <ol><li> Stériliser tous les équipements chirurgicaux et d&#39;employer une technique aseptique pendant. Anesthésier la souris (par exemple en utilisant 1-2% isofluorane dans l&#39;air) et le placer dans un stèrechevalement otaxic. Vérifiez la profondeur de l&#39;anesthésie pendant toute la procédure et administrer en outre anesthésique nécessaire (par exemple absence de retrait des membres de la patte nocive pincée est indicative de l&#39;anesthésie adéquate). Se assurer que les yeux sont protégés de la dessiccation par onguent lubrifiant oculaire, et que la température du corps de la souris reste normale tout au long de la procédure. </li><li> Faire une incision médiane à travers la peau à partir d&#39;entre les yeux et de finition 2 cm en arrière du bord arrière du crâne. Blunt disséquer la peau loin de l&#39;aponévrose sous-jacente à l&#39;arrière de la souris pour créer une «poche» sous-cutanée assez grand pour accueillir confortablement la pompe et tube de liaison une fois la canule est implanté (le tube de liaison ne doit pas être plié à la fin). Grattez effacer le fascia de plus de la face dorsale du crâne. </li><li> Utiliser un diamètre fraise dentaire environ 1,5 mm, descendre dans le crâne à la stéréotaxique appropriée coordonne uusqu&#39;à une couche mince, souple des restes osseux. Peel cette couche loin en utilisant une pince fine (cela évite d&#39;endommager la dure-mère sous-jacente et le cerveau avec le fraise dentaire). Assurer le crâne est nettoyé de tous les fragments de sang et d&#39;os, et qu&#39;il n&#39;y a pas de saignement plus loin. </li><li> Avec la canule détenu par un porte-canule, placer la pompe et le tube de raccordement dans la «poche» sous-cutanée recouvrant le dos de la souris. Ensuite, placez la pointe de la canule aux coordonnées stéréotaxiques appropriées et sur la surface du cerveau. Abaisser avec précaution la canule dans le cerveau, mais arrêter environ 1 mm de moins que la profondeur requise. NOTE: La profondeur restante sera négocié après l&#39;application de la première couche de l&#39;acrylique dentaire. </li><li> Vérifiez à nouveau la surface du crâne est propre et sec, puis préparer un petit volume de l&#39;acrylique dentaire et utiliser un cure-dent pour lisser sur toute la surface exposée du crâne, y compris dans le trou de trépan à travers le crâne autour èmee canule. Avant durcit l&#39;acrylique, abaisser la canule basculer la profondeur reste dans la cible. </li><li> Préparer un autre petit volume de l&#39;acrylique dentaire et cette couche sur le premier, ainsi que sur le support de plastique blanc pour la canule, de fixer la canule en place. Répéter l&#39;opération avec des couches supplémentaires de acrylique que nécessaire. </li><li> Une fois l&#39;acrylique a durci, retirer délicatement le porte-canule et de couper la languette blanche en plastique amovible de la canule en utilisant une lame de scalpel chauffé avec une flamme de butane. Enfin, suturer la peau fermée sur toute implant. </li></ol></li><li> Traitement post-opératoire des animaux <ol><li> Appliquer une pommade antiseptique pour les marges de la peau, et d&#39;administrer un anti-inflammatoire à la souris (par exemple le méloxicam, 3 mg / kg sc). Débranchez la souris de la trame, le placer sous une lampe chauffante, et observer jusqu&#39;à ce qu&#39;il reprenne conscience. Ne retournez pas une souris qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d&#39;autres animaux jusqu&#39;à guérison complète. REMARQUE: Experimental manipulations telles que le jumelage entre les sexes et à l&#39;enrichissement de l&#39;environnement peuvent être lancés ou repris le jour suivant la chirurgie au plus tôt. </li><li> Surveiller leur poids corporel, le comportement général et l&#39;apparence quotidienne. Traiter les signes d&#39;infection (gonflement, rougeur, pus) autour des incisions chirurgicales avec une pommade topique antiseptique. Traiter tous les signes de maladie, la douleur, le stress ou d&#39;inconfort (par exemple perte de poids corporel&gt; 10%, retrait social, absence de toilettage, &quot;bouffer&quot;, le dysfonctionnement de mouvement, convulsions) avec des analgésiques et / ou des antibiotiques systémiques que nécessaire. </li><li> Euthanasier les souris si&gt; 15% de perte ou de symptômes de la maladie, la douleur, le stress ou d&#39;inconfort poids sont non-recouvrables à moins 1 semaine de traitement curatif. </li></ol></li></ol> 3. tissu cérébral préparation, la transformation immunohistochimique et Stéréologie <ol><li> Perfusion <ol><li> Immédiatement après manipulations / de drogue environnementaux, préparer le cerveau pour l&#39;étude. <br/&gt; Remarque: Dans les expériences rapportées ici le nombre de neurones TH + SNc été mesurée et comparée à chacun des différents groupes de traitement. </li><li> Première administrer une surdose d&#39;anesthésique pour tuer les souris (par exemple, 100 mg / kg ip pentobarbital sodique). Une fois anesthésié, mais avant que le cœur cesse de battre, mettre la souris sur son dos et cravate ou épingler les deux pattes avant. </li><li> En utilisant un scalpel découpé la peau recouvrant le thorax incise ensuite à travers le muscle juste en dessous de la cage thoracique dans la cavité abdominale. Placez une pince sur la pointe du sternum de la cage thoracique et soulever la cage thoracique et loin de le foie exposer le diaphragme. </li><li> Couper à travers la membrane et à travers les nervures latéralement des deux côtés à l&#39;aide de grands ciseaux jusqu&#39;à la cage thoracique peut être replié sur la tête pour exposer les poumons et le cœur. Avec des ciseaux fins font une petite incision dans l&#39;oreillette droite comme un point de sortie pour le sang et les solutions perfusés, puis couper à travers la base du ventricule gauchecle et placer une canule à travers le ventricule gauche, l&#39;oreillette gauche, et dans l&#39;aorte. </li><li> Fixer la canule en place puis pomper chaude (37 ° C) héparine et 0,1 M tampon phosphate salin physiologique (PBS) à travers le système vasculaire jusqu&#39;à ce que la solution sortant de l&#39;oreillette droite est entièrement libre de sang. Ensuite, la pompe à froid (4 ° C) une solution de fixateur (tels que 4% de paraformaldehyde dans du PBS) à travers le système vasculaire jusqu&#39;à ce que l&#39;ensemble souris est bien fixé. Retirez le cerveau et dans PBS avec 30% de saccharose pendant 2-3 jours jusqu&#39;à ce que les puits de cerveau. NOTE: D&#39;autres types de préparation de tissu pourraient être appliquées en fonction de l&#39;expertise en laboratoire correspondant. </li></ol></li><li> Préparation de cryosections flottant <ol><li> Couper des sections en série à travers les régions du cerveau d&#39;intérêt et de recueillir ceux-ci dans PBS. NOTE: Nous avons réduit de 40 sections um d&#39;épaisseur en utilisant un cryostat. Autres types de sectionnement de tissu pourraient être appliquées en fonction de l&#39;expertise dans le corresponding laboratoire. </li></ol></li><li> Immunohistochimie <ol><li> Effectuer immunohistochimie standard pour des protéines d&#39;intérêt. Incuber les coupes dans 5% de sérum de chèvre normal et 0,3% de Triton X-100 dans du PBS à température ambiante pendant 30 min, puis immunoréagissent avec polyclonal de lapin anti-TH (1: 400) à 4 ° C pendant 48 heures, puis polyclonal biotinylé de chèvre anti -rabbit (1: 1000) à la température ambiante pendant 2 heures. </li><li> Ensuite, laisser incuber à l&#39;avidine-peroxydase (1: 500) à la température ambiante pendant 1 heure, puis dans de cobalt et de diamino-benzidine de nickel intensifié (0,5 mg / ml) à la température ambiante pendant 18 à 20 min; pour le dernier 5/3 min d&#39;incubation de la diamino-benzidine ajouter du peroxyde d&#39;hydrogène (0,01%) pour catalyser la précipitation chromogène. Laver les sections trois fois pendant 10 minutes chacune dans du PBS avant, après, et entre chacune des étapes ci-dessus. </li><li> Montez les sections sur des lames de microscope gélatinisées, l&#39;air de les sécher, puis Nissl tache (rouge neutre), déshydrater dans l&#39;alcool, clair (X-3B), et lamelle. </li></ol></li><li&gt; Stéréologie <ol><li> Estimer le nombre total de neurones TH + et TH- SNC (LC et VTA) et en utilisant des méthodes stéréologiques impartiales. Assurez-vous que l&#39;stereologist est aveugle au traitement reçu. Exclure glie sur la base du diamètre de soma &lt;5 um et compter que les cellules avec un noyau visible. </li><li> Identifier le SNC (et VTA et LC) par les emplacements spatiaux de cellules TH + et anatomiques Monuments / limites selon l&#39;atlas du cerveau de Paxinos et Watson 7. Comptez TH + cellules dans un cadre de comptage (55 x 55 um = 3,025 um 2) à des intervalles prédéterminés réguliers (x = 140 um, y = 140 um pour SNC; x = 100 um, y = 100 um pour VTA et LC) tout au long de chaque noyau dans chaque quatrième section. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Manipulations de l&#39;environnement La motivation derrière la conception de ces manipulations de l&#39;environnement (d&#39;appariement entre les sexes et d&#39;enrichissement de l&#39;environnement) était de déterminer si l&#39;environnement, et / ou le comportement suscité par l&#39;environnement, est associée à des changements dans le nombre de neurones dopaminergiques du mésencéphale. L&#39;accent est donc sur la fourniture d&#39;environnements et de stimuler des comportements ...

DArgic la signalisation par les neurones dans la région tegmentale ventrale (VTA) et substantia nigra pars compacta de (SNC) du mésencéphale est considéré comme important pour les comportements cognitifs, émotionnels et moteurs récompense motivés. Cependant, la signalisation de DA trop ou trop peu mésencéphale provoque de nombreux symptômes invalidants dans une variété de troubles neurologiques (par exemple la maladie de Parkinson, déficit de l&#39;attention et hyperactivité, schizophrénie et la toxicomanie). Médicaments qui augmentent ou diminuent DA signalisation soulager ces symptômes, mais ils produisent également des effets secondaires attribuables à la signalisation dérégulée et les effets hors-cible. L&#39;efficacité du médicament diminue également au fil du temps en raison des réponses compensatoires du cerveau. Le défi est donc de rétablir la signalisation DA mésencéphale normale, de façon plus ciblée et physiologique, et une approche favorisée est en augmentant ou en diminuant le nombre de neurones dopaminergiques du mésencéphale. La preuve a été accumulé pendant sevsieurs décennies que l&#39;expression des gènes et des protéines impliquées dans le métabolisme et le trafic DA et d&#39;autres catécholamines dans les cellules adultes matures est modifiable (examinés dans une). Dans le mésencéphale, le nombre de tyrosine hydroxylase immunopositif (TH +, l&#39;enzyme limitant la vitesse à Da synthèse) neurones diminue puis augmente suite à l&#39;administration de la neurotoxine 2,3, tandis que le nombre de TH immunonegative (TH) neurones montre la tendance inverse (ce est à dire des augmentations puis diminue 3). Ceci est cohérent avec la perte ensuite gain du «phénotype DA &#39;par certaines cellules. Le nombre de neurones TH TH + et CNS a également été démontré que le changement dans des directions égales mais opposées suivant divers traitements qui modifient l&#39;activité électrique de ces cellules à 4,5. Par exemple, la perfusion de la petite conductance, de potassium activé par le calcium (SK) dans le canal antagoniste apamine mésencéphale pendant 2 semaines diminue le nombre de TH + et augmente (par la même quantité) à la numbre de TH- SNc neurones 4,5. En revanche, la perfusion de l&#39;agoniste des canaux SK-1 EBIO augmente le nombre de TH + et diminue (par le même montant) le nombre de neurones TH SNc 4,5. Des changements similaires ont été observés suite à une variété de traitements ciblant SNc activité neuronale, y compris certains qui visait entrées afférentes 4. Ce règlement apparente du nombre de neurones SNc DArgic par l&#39;activité neuronale et entrée afférente soulève la possibilité que l&#39;environnement ou le comportement peuvent influer sur le nombre de neurones de SNC. En effet, des souris adultes exposés à des environnements différents ont plus ou moins mésencéphale (SNC et VTA) TH + neurones, et au moins certains de ces changements induits par l&#39;environnement sont abolis par le blocage simultané de l&#39;entrée synaptique dans le mésencéphale 6. Les objectifs de cette communication sont les suivants: (1) fournir plus de détails sur la façon de mettre en œuvre nos manipulations de l&#39;environnement et des perfusions de médicaments; et (2) fournir des données à l&#39;appui de notre affirmation selon laquelle le environnement régule le nombre de neurones dopaminergiques du mésencéphale, via l&#39;entrée afférente.

<table><tbody><tr><td>Isofluorane</td><td>Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australie</td><td>AHN3640</td><td></td></tr><tr><td>Pompe osmotique ALZET 1002</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0004317</td><td></td></tr><tr><td>ALZET Kit de perfusion cérébrale 1</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0004760</td><td></td></tr><tr><td>Porte-canule ALZET 1</td><td>DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0008860</td><td></td></tr><tr><td>Vertex Monomer Autopolymérisable (solvant acrylique dentaire)</td><td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, Pays-Bas</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vertex Self Polymering (poudre acrylique dentaire)</td><td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, Pays-Bas</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>METACAM (Meloxicam)</td><td>Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australie</td><td>L10100</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbitone</td><td>de sodium Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Australie</td><td>571177</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>chemicon-temecula, CA</td><td>S26-Litre</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck Millipore Siège social, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td><td>1.08603.1000</td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal rabbit anti-tyrosine hydroxylase</td><td>Merck Millipore Headquarters&nbsp ;, 290 Concord road, Billerica, MA 01821</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre biotinylée polyclonale anti-lapin</td><td>Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australie 2060</td><td>EO432</td><td></td></tr><tr><td>Avidin peroxydase</td><td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td><td>A3151-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Diamino-benzidine</td><td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td><td>D-5637</td><td></td></tr><tr><td>Chercheur stéréo</td><td>MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

modulations environnementaux du mésencéphale nombre de dopamine neurones chez la souris adulte

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Des changements durables dans le cerveau ou «plasticité cérébrale» sous-tendent le comportement adaptatif et la réparation du cerveau après les maladies ou des blessures. En outre, les interactions avec notre environnement peuvent induire la plasticité du cerveau. De plus en plus, la recherche tente d&#39;identifier les environnements stimuler la plasticité cérébrale bénéfique pour traiter les troubles cérébraux et comportementaux. Deux manipulations de l&#39;environnement qui sont décrits augmenter ou diminuer le nombre de tyrosine hydroxylase immunopositif (TH +, l&#39;enzyme limitant la vitesse dans la dopamine (DA) synthèse) des neurones dans le mésencéphale de souris adulte. La première comprend appariement souris mâles et femelles de façon continue pendant 1 semaine, ce qui augmente TH mésencéphale + neurones d&#39;environ 12% chez les hommes, mais diminue TH mésencéphale + neurones d&#39;environ 12% chez les femmes. La seconde comprend les souris de logement en continu pendant deux semaines dans des «environnements enrichis» (EE) contenant roues de roulement, des jouets, des cordes, des matériaux de nidification, etc., qui increases TH mésencéphale + neurones d&#39;environ 14% chez les hommes. En outre, un protocole est décrite pour infuser simultanément des médicaments directement dans le mésencéphale au cours de ces manipulations de l&#39;environnement pour aider à identifier les mécanismes sous-jacents de l&#39;environnement induite par la plasticité du cerveau. Par exemple, EE-induction de plus TH mésencéphale + neurones est abolie par le blocage simultané de l&#39;entrée synaptique sur les neurones du mésencéphale. Ensemble, ces données indiquent que l&#39;information sur l&#39;environnement est relayé via l&#39;entrée synaptique des neurones du mésencéphale pour allumer ou éteindre l&#39;expression de gènes «DA». Ainsi, la stimulation environnementale appropriée, ou le ciblage de médicaments des mécanismes sous-jacents, peut être utile pour le traitement de troubles cérébraux et comportementaux associés à des déséquilibres dans le mésencéphale DA (par exemple la maladie de Parkinson, déficit de l&#39;attention et hyperactivité, la schizophrénie et la toxicomanie).

Les souris adultes soumis à ces manipulations de l&#39;environnement ont modifié nombre de mésencéphale (SNC et VTA), mais pas LC, neurones TH +, et EE plus perfusion mésencéphale concurrente soit picrotoxine ou bicuculline (GABA A antagonistes des récepteurs) abolit EE-induction de plus SNc TH + neurones. Ces données ont déjà été publiés dans les six. Les présentes données ont été compilées dans des expériences répétées effectuées dans le cadre de cette étude précédente, mais ne ont pas été publié...

Ce protocole décrit deux manipulations environnementales différentes et un protocole d’infusion cérébrale simultanée pour étudier les changements cérébraux induits par l’environnement sous-jacents au comportement adaptatif et à la réparation cérébrale chez les souris adultes.

Modulations environnementaux du mésencéphale Nombre de dopamine neurones chez la souris adulte

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de créer des conditions environnementales contrôlées susceptibles de stimuler la plasticité cérébrale et les modifications comportementales chez la souris. Ceci est réalisé en logeant les souris par paires mixtes mâle-femelle, comparées à des paires témoins mâle-mâle et femelle-femelle, afin d'étudier les effets d'un appariement prolongé entre sexes sur le cerveau. En alternative, les souris peuvent être logées ensemble dans des cages contenant divers objets favorisant l'exploration et le jeu, par opposition à des cages standard, afin d'évaluer les effets de l'enrichissement environnemental sur le cerveau. D'autres traitements, tels que l'administration de médicaments, peuvent être ajoutés à ces stimulations environnementales afin d'identifier les mécanismes sous-jacents aux modifications cérébrales et comportementales observées.Les résultats montrent que ces enrichissements et traitements environnementaux induisent des modifications du nombre de neurones dopaminergiques du mésencéphale, dépendantes de la transmission synaptique GABAergique au niveau du mésencéphale. L'enrichissement environnemental constitue un paradigme qui augmente la stimulation somatosensorielle, motrice et cognitive chez les souris. Grâce à cette approche, des études ont mis en évidence une neuroplasticité accrue ainsi qu'une amélioration de l'apprentissage et de la mémoire dans de nombreux modèles de maladies.Les implications de cette technique s'étendent à la compréhension des mécanismes de la plasticité cérébrale adulte induite par des influences environnementales. Cela est pertinent pour le traitement de nombreuses maladies du cerveau et de l'esprit. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous avons observé que le nombre de neurones dopaminergiques du mésencéphale variait en réponse à une perturbation de l'activité neuronale du mésencéphale induite par des entrées synaptiques.La démonstration visuelle de la pompe osmotique et de la canule d'infusion cérébrale peut être essentielle, car ces procédures peuvent être assez difficiles à apprendre. Des descriptions écrites pour l'appariement selon le sexe. Groupez dans des loges séparées des souris mâles et femelles adultes sexuellement matures appariées selon le sexe, en évitant les portées apparentées ; placez au hasard chaque souris dans un couple mâle-mâle, un couple femelle-femelle ou un couple mâle-femelle, dans une cage propre, en isolement, avec un accès libre à la nourriture et à l'eau ici et tout au long de l'appariement selon le sexe.Conserver tous les stimuli environnementaux parasites constants ou également répartis entre toutes les souris, et loger les animaux de façon continue pendant sept jours. Pour l'enrichissement environnemental, assigner aléatoirement des souris mâles ou femelles adultes appariées par âge à l'un des trois groupes : logées en conditions standard, avec une roue de course, ou en environnement enrichi, pendant au moins trois jours. Maintenir les animaux dans ces conditions.Avec accès ad libitum à la nourriture et à l'eau pendant 14 jours. Pendant l'enrichissement environnemental, la cage standard doit contenir uniquement de la litière. La roue de course doit contenir de la litière ainsi que deux roues de course, et l'enrichissement environnemental doit comporter de la litière, deux roues de course et des jouets.Soumettez les souris placées dans un environnement enrichi à un enrichissement supplémentaire en les regroupant dans une cage plus grande contenant des jouets nouveaux pendant une heure par jour. Chaque jour, à la même heure et cinq jours par semaine, réintroduisez les souris dans leur cage enrichie. Après chaque séance, maintenez le caractère nouveau des stimulations en proposant un jeu de jouets différent à chaque séance.Nettoyer tous les jouets qui seront présentés aux souris avec de l'eau savonneuse et de l'éthanol à 80 %. Pour éliminer toute odeur, déplacer les groupes habitués au logement standard et aux roues de course de la même manière et pendant une durée similaire chaque jour, mais sans ajouter les matériaux de super-enrichissement le jour précédant l'implantation. En utilisant une technique aseptique, remplir chaque pompe osmotique stérile, tube de connexion et cannule avec une solution stérile du médicament ou du véhicule, conformément aux instructions du fabricant.Ensuite, assemblez les pièces et incubez-les toute la nuit dans du sérum physiologique stérile à 37 degrés Celsius le jour de l'intervention chirurgicale. Après avoir confirmé la sédation par un pincement de la patte, appliquez une pommade ophtalmique à l'animal et placez-le en position dorsale sur un tapis chauffant. Puis, en utilisant une technique aseptique, pratiquez une incision médiane à travers la peau, en partant de deux centimètres en arrière du bord postérieur du crâne et en terminant entre les yeux, puis disséquez délicatement la peau de l'aponévrose sous-jacente le long du dos de la souris, créant ainsi une poche sous-cutanée suffisamment grande pour accueillir confortablement la pompe et le tube de raccordement.Ensuite, gratter soigneusement la fascia située au-dessus de la face dorsale du crâne et utiliser une fraise dentaire d’environ 1,5 millimètre de diamètre pour percer le crâne aux coordonnées stéréotaxiques appropriées, jusqu’à ce qu’il ne reste qu’une fine couche osseuse souple ; retirer délicatement cette couche à l’aide de pinces fines. Une fois que le crâne est débarrassé de tout sang et de tout fragment osseux et qu’il n’y a plus de saignement, utiliser un support de canule pour placer la pompe et le tube de raccordement dans la poche fraîchement créée. Placer ensuite l’extrémité de la canule aux coordonnées stéréotaxiques appropriées à la surface du cerveau, puis abaisser soigneusement le tube dans le cerveau, en s’arrêtant à un millimètre de la profondeur requise.Veillez à ce que la surface du crâne soit propre et sèche à nouveau, puis utilisez un cure-dent pour étaler de l'acrylique dentaire fraîchement préparée sur toute la surface exposée du crâne, y compris dans le trou de trépan autour de la canule, avant que l'acrylique ne durcisse. Abaissez la pointe de la canule à la profondeur restante jusqu'à la cible. Ensuite, lorsque la canule est en place, appliquez soigneusement une deuxième couche d'acrylique dentaire fraîchement préparée sur le crâne ainsi que sur le support en plastique blanc, afin de fixer la canule en position.Une fois que l'acrylique est durci, retirez soigneusement le support de la canule et utilisez une lame de scalpel chauffée pour fondre la languette en plastique de la canule. Ensuite, suturer la peau par-dessus tout l'implant. Appliquez une pommade antiseptique sur les bords de la peau et administrez un anti-inflammatoire à l'animal.Enfin, retirez la souris du cadre. Placez-la sous une lampe chauffante et surveillez l'animal jusqu'à ce qu'il soit complètement rétabli. Les souris mâles adultes appariées avec des souris femelles adultes pendant sept jours présentent environ 12 % de neurones supplémentaires positifs pour la tyrosine hydroxylase dans la région SNC du mésencéphale par rapport aux mâles appariés avec des mâles.En revanche, les femelles appariées avec des mâles présentent environ 12 % de neurones SNC positifs pour la TH en moins par rapport aux femelles appariées avec d'autres femelles. Le nombre de neurones positifs pour la TH dans la SNC et dans la région télaire ventrale est également accru chez les souris mâles adultes soumises à un appariement dans un environnement enrichi combiné à un super-enrichissement pendant 14 jours. Les animaux ayant bénéficié d'un enrichissement environnemental plus un super-enrichissement avec perfusion de véhicule montrent environ 14 % de neurones SNC positifs pour la TH en plus.Ensuite, les animaux hébergés de manière standard et infusés avec un véhicule, ainsi que les animaux soumis à un logement enrichi sur le plan environnemental combiné à un logement super-enrichi avec une infusion d'antagoniste du récepteur GABAA, n'exhibent toutefois pas cette augmentation. Lors de tentatives de manipulations environnementales, il est important de se rappeler de minimiser au maximum les perturbations pour les animaux, telles que maintenir le bruit à un niveau minimal et éviter les changements de cage. Trop souvent, lors de la mise en place d'un environnement enrichi, il est essentiel d'inclure divers matériaux de nidification et de maintenir le site de nidification constant afin de minimiser le stress pour vos animaux.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de manipuler l'environnement de souris adultes afin d'induire des modifications au niveau du cerveau et du comportement. N'oubliez pas que, lors de la manipulation des médicaments, ceux-ci peuvent être extrêmement dangereux ; portez donc toujours des vêtements de protection lors de la préparation des pompes osmotiques.

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Primaire dissocié des cultures de cellules dopaminergiques du mésencéphale permettre l'étude des caractéristiques des neurones à dopamine présynaptique. Ils peuvent être utilisés pour surveiller en temps réel des cinétiques de libération de dopamine et de la protéine / ARNm niveaux de régulation de l'exocytose de dopamine. Ici, nous vous montrons comment générer ces cultures du nouveau-né contre les rongeurs.

Primaire Dissocié cultures Mésencéphale dopamine cellulaire du nouveau-né contre les rongeurs

Un protocole pour effectuer unilatérales de 6-OHDA lésions du faisceau médian du cerveau antérieur chez la souris est décrite. Cette méthode a un faible taux de mortalité (13,3%) avec 89% des animaux qui ont survécu montrant la perte de&gt; 95% de la dopamine striatale et 90,63 ± -4,02% biais ipsiversive rotation vers le côté de la lésion.

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La dopamine est nettement réglementée dans les noyaux du mésencéphale, qui contiennent les corps cellulaires et les dendrites des neurones dopaminergiques. Nous décrivons ici une approche de dissection et manipulation d'échantillons de maximiser les résultats, et donc les conclusions et les points de vue, sur la réglementation de la dopamine dans les noyaux du mésencéphale de la substantia nigra (SN) et l'aire tegmentale ventrale (VTA) chez les rongeurs.

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Dans la maladie et le mouvement des troubles de Parkinson en général, les analyses comportementales sensibles et fiables sont essentielles pour tester de nouvelles thérapies potentielles. Ici, nous décrivons une batterie de tests sensori gérable pour les souris qui sont sensibles à des degrés divers de lésions au système nigrostriatal et utile pour les études précliniques.

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Modèles d’interaction gène-environnement pour démasquer les mécanismes de susceptibilité dans la maladie de Parkinson

Les neurones dopaminergiques jouent un rôle régulateur essentiel dans le cerveau. Leur perte est associée à la maladie de Parkinson. Dans cette vidéo, nous montrons comment générer des cultures primaires de neurones dopaminergiques centraux à partir de mésencéphale embryonnaire de souris. De telles cultures sont utiles pour étudier l’extrême vulnérabilité de ces neurones à divers stress.

Culture primaire de souris dopaminergiques neurones

Les causes de la dégénérescence des neurones dopaminergiques du mésencéphale au cours de la maladie de Parkinson ne sont pas entièrement comprises. Les systèmes de culture cellulaire constituent un outil essentiel pour l’étude des propriétés neurophysiologiques de ces neurones. Nous présentons ici un protocole optimisé, qui peut être utilisé pour la modélisation in vitro de la neurodégénérescence.

Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs

Capture de la dopamine et de chromatographie liquide à haute performance représentent expérimentale des outils d’analyse pour étudier l’homéostasie de la dopamine chez les souris en évaluant la fonction de transporteur de la dopamine et les niveaux de dopamine dans le tissu du striatum, respectivement. Nous présentons des protocoles afin de mesurer la teneur en tissu dopamine et d’évaluer les fonctionnalités du transporteur de la dopamine.

Évaluation de l’homéostasie des dopaminergiques chez les souris par l’utilisation de l’analyse de chromatographie liquide à haute performance et l’absorption de la Dopamine

Cet ouvrage présente un protocole étape par étape pour l’estimation non biaisée stéréologique des numéros des neurones dopaminergiques dans la substantia nigra de souris à l’aide d’équipement de microscopie standard (c'est-à-dire, un microscope optique, une table objet motorisé (x, y, z avion) et le logiciel du domaine public pour l’analyse d’image numérique.

Stéréologique Estimation du nombre de neurones dopaminergiques dans la Substantia Nigra de souris à l’aide de l’optique fractionnateur et l’équipement de microscopie Standard

Nous avons développé un modèle de stress accéléré de défaite sociale pour les souris adolescentes C57BL/6, qui fonctionne à la fois chez les mâles et les femelles et permet une exposition pendant des périodes discrètes à l’adolescence. L’exposition à ce modèle induit un évitement social, mais seulement chez un sous-ensemble de souris mâles et femelles vaincues.

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Découvrez les manipulations environnementales pour étudier la plasticité cérébrale chez la souris adulte. Cette méthode permet d'observer les changements des neurones dopaminergiques du mésencéphale et d'évaluer l'impact de l'enrichissement sur le comportement.

Modulations environnementaux du mésencéphale Nombre de dopamine neurones chez la souris adulte

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