17 janvier 2016
Les larves de poisson-zèbre sont adaptées pour se nourrir de zooplancton. Il est possible de tirer parti de cette caractéristique naturelle en laboratoire en grandissant d’abord en nourrissant les poissons ensemble dans le même système avec des rotifères d’eau salée vivants. Cette stratégie de « polyculture » favorise une croissance et une survie élevées avec un minimum de travail et de perturbation des larves.
L’objectif global de la méthode de polyculture de rotifères est d’exploiter la productivité naturelle et les caractéristiques biologiques des rotifères d’eau salée pour créer un environnement qui favorise une croissance rapide et la survie maximale des larves de poisson-zèbre qui se nourrissent en premier. Le principal avantage de cette technique est qu’elle réduit considérablement le temps et l’espace nécessaires pour élever avec succès un grand nombre de larves de poisson-zèbre à des fins d’expériences de recherche. Commencez l’entretien de l’élevage de rotifères en remplissant le récipient d’élevage à 90 % de sa capacité avec de l’eau douce propre et déchlorée dosée avec 10 grammes par litre de sels d’aquarium.
Assurez-vous que l’eau est bien mélangée et que tout le sel est complètement dissous. Ensuite, réglez le flux d’air dans le récipient de manière à ce qu’il maintienne une ébullition roulante. Mesurez la salinité du liquide à l’aide d’un réfractomètre.
Ensuite, échantillonnez les rotifères dans le récipient de culture, ou CV.Assurez-vous que la culture est bien mélangée. Ensuite, prélevez trois échantillons de deux à trois millilitres à l’aide d’une pipette de transfert à partir de différentes parties de la culture et combinez les échantillons dans un tube. Transférez un à deux millilitres de l’échantillon combiné dans une boîte de Pétri.
Visualisez l’échantillon sous un microscope à dissection et vérifiez la qualité de la culture. Ajoutez 100 microlitres de solution d’iode de Lugol à 50 % à l’échantillon pour immobiliser les rotifères et les compter. Prélevez immédiatement un sous-échantillon de deux millilitres à l’aide d’une pipette en plastique et versez un millilitre dans une lame de comptage Sedgewick Rafter.
À l’aide du microscope de dissection, comptez autant de surface de lame que nécessaire pour compter jusqu’à 100 rotifères intacts et le nombre total d’œufs attachés aux rotifères. Ensuite, calculez le nombre de rotifères par millilitre pour une utilisation ultérieure. Commencez la récolte en retirant l’alimentation en air et le filtre à fil dentaire.
Ouvrez lentement la vanne au bas du CV et laissez l’eau s’écouler doucement dans un collecteur de plancton avec un tamis à mailles de 53 microns. Récupérez l’eau qui s’écoule du fond du collecteur après l’avoir filtrée dans un seau ou égouttée. Ensuite, remplissez une bouteille avec 10 à 15 grammes par litre d’eau salée propre.
Retournez l’écran sur le FCV et lavez les rotifères dans le FCV avec un léger jet d’eau salée. Démarrez la minuterie de mesure programmable ou PMT pour fournir l’alimentation au FCV. Ensuite, frottez tout l’intérieur du CV avec un tampon à récurer propre.
Créez un nouveau mélange de 15 grammes par litre dans un seau de cinq gallons pour remplacer le volume d’eau perdu lors de la récolte. Remuez vigoureusement la solution jusqu’à ce que le mélange soit complètement dissous. Ensuite, ajoutez la solution au CV.Ensuite, rincez le filtre à fil dentaire avec un spray à haute pression.
Lorsque le filtre à fil dentaire est exempt de débris, retournez-le dans le CV.Ajustez les débits d’alimentation des algues délivrés dans le CV en modifiant la durée de chaque dosage. Après 24 heures, répétez le processus en commençant la récolte des rotifères restant dans le FCV. Concentrez les rotifères dans deux litres d’eau fraîche, propre et déchlorée avec cinq grammes par litre de sel.
Ceux-ci peuvent être stockés à quatre degrés Celsius comme réserve de secours, ou utilisés pour nourrir des poissons aux stades ultérieurs au-delà de ce qui est décrit dans ce protocole. Prélevez des embryons de poisson-zèbre lors d’une ponte en versant les embryons pondus à travers une passoire à thé. Et puis, rincez doucement avec de l’eau de poisson stérile d’une bouteille de lavage dans des boîtes de Pétri.
Une fois que tous les embryons sont collectés, incubez-les. Commencer la phase de polyculture lorsque plus de 90 % des larves écloses nagent activement dans la colonne d’eau. Ajoutez 500 millilitres de la culture de rotifères directement du FCV dans un réservoir d’alevinage de 3,5 litres.
Ensuite, versez doucement les larves d’une boîte de Pétri dans le réservoir de la nurserie. Assurez-vous qu’aucune larve ne reste dans le plat. Ajoutez 500 millilitres d’eau de poisson propre et conditionnée à partir d’une source d’eau dédiée dans le réservoir jusqu’à un volume final d’un litre et une salinité finale de 5 grammes par litre.
Observez le réservoir de polyculture au moins une fois par jour pour vous assurer que les rotifères et les poissons sont présents et en croissance. Vérifiez que les rotifères sont visibles dans toute la colonne d’eau. Assurez-vous que les poissons sont également visibles dans la colonne d’eau et qu’ils nagent parmi les rotifères.
Il est essentiel d’évaluer quotidiennement l’état de chaque aquarium pour s’assurer qu’ils sont vivants et qu’ils nagent avec des rotifères disponibles pour toutes les larves de poissons. Une fois que vous vous assurez que les rotifères et les poissons grandissent, commencez à faire couler normalement de l’eau dans le réservoir. Enfin, placez un grillage sur l’orifice de vidange pour vous assurer que les larves ne sont pas évacuées du réservoir.
La performance typique d’une culture de rotifères a été surveillée sur une période de 30 jours et a donné une densité moyenne de culture de 932 rotifères par millilitre. Et un maximum de 1 330 rotifères par millilitre. La population de rotifères dans un bassin de polyculture avec du poisson-zèbre a une densité moyenne de rotifères de 589,4 rotifères par millilitre.
La valeur minimale de 481 rotifères par millilitre est 10 fois meilleure que les travaux publiés précédemment. Le poisson-zèbre a montré une croissance constante chaque jour au cours de la période de cinq jours, passant d’une longueur totale moyenne de 3,9 millimètres à 5,4 millimètres. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’élever des rotifères pour les utiliser dans un système de polyculture conçu pour répondre aux besoins nutritionnels des poissons-zèbres qui se nourrissent en premier.
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La méthode de polyculture à base de rotifères utilise des rotifères d'eau salée pour améliorer la croissance et la survie des larves de zebrafish au stade du premier repas. Cette technique réduit considérablement les ressources nécessaires à l'élevage de grandes quantités de larves de zebrafish à des fins de recherche.
L'élevage efficace de zebrafish au premier stade alimentaire est essentiel pour le criblage in vivo à haut débit et la validation précoce de cibles en recherche et développement biopharmaceutique. La méthode de polyculture de rotifères permet une production évolutive et reproductible de larves de zebrafish en bonne santé, favorisant un déploiement robuste du système modèle dans les flux de travail de découverte et de préclinique. Cette approche réduit les contraintes liées aux ressources et améliore la fiabilité expérimentale dans l'ensemble des programmes utilisant le zebrafish comme système pertinent pour les maladies.
Cette méthode s'intègre à l'interface entre la phase de découverte précoce et l'identification de composés candidats, fournissant un approvisionnement fiable en larves de poisson zèbre pour les criblages en aval et les études mécanistiques.