Extraction Metrics pour les systèmes de racines en trois dimensions: Volume et surface Analyse de In-sol X-ray tomodensitométrie données

L'objectif général de cette procédure est d'extraire des informations quantitatives sur les racines des plantes à partir de données de microtomographie à rayons X en conditions réelles de sol. Cette méthode d'analyse de la structure racinaire de plantes vivantes peut aider à répondre à des questions clés en biologie, telles que la manière dont les plantes réagissent à des conditions environnementales changeantes, comme la sécheresse ou l'activité microbienne, entre autres. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est non invasive, ce qui nous permet d'étudier les plantes dans leur environnement naturel, le sol.

La démonstration visuelle de cette méthode est précieuse, car la procédure comprend de nombreuses étapes, notamment l'imagerie tomographique, la reconstruction des données et l'analyse, qui peuvent être obscures sans aide visuelle. Pour commencer, placez une plante en pot sur le manipulateur d'échantillon du scanner de tomographie aux rayons X à une distance souhaitée pour obtenir l'agrandissement ciblé. Pour une plante dans un support de deux pouces de diamètre, réglez la distance entre l'échantillon et la source à environ trois pouces.

Dans le logiciel de contrôle de l'appareil, régler les paramètres de puissance des rayons X à 85 kilovolts et 190 microampères. Ensuite, régler le temps d'exposition à une seconde pour obtenir un meilleur rapport signal sur bruit. Régler le nombre de projections à 3 142 et le nombre d'images par projection à quatre pour garantir de bonnes statistiques de données.

À l’aide des paramètres de numérisation que vous venez de définir, sélectionnez l’onglet « Correction d’éclairage ». Cliquez ensuite sur « Nouveau » et donnez un nom au fichier de correction d’éclairage. Ensuite, cliquez sur « Présent » pour confirmer les nouvelles conditions.

Ensuite, cliquez sur Créer et cliquez sur OK pour utiliser deux images de référence. Puis cliquez sur Générer. Ensuite, lorsque la fenêtre contextuelle d'avertissement apparaît, retirez physiquement l'échantillon du trajet du faisceau avant de cliquer sur OK. La correction d'ombrage va maintenant s'exécuter.

Maintenant, cliquez sur l'onglet Acquisition. Nommez le fichier de données, puis sélectionnez Aucun pour le filtre aux rayons X. Assurez-vous que la case Minimiser les artefacts en anneau est cochée afin que l'échantillon soit rotatif par paliers angulaires pendant l'acquisition des images de projection.

Enfin, lancez le balayage en cliquant sur le bouton Acquire. Après avoir acquis les données brutes, chargez-les dans le logiciel de reconstruction. Comparez la première et la dernière image en cliquant sur Blink pour vous assurer que l'échantillon ne s'est pas déplacé et que les paramètres de balayage n'ont pas changé pendant l'acquisition des données.

Calculez le centre de rotation, ou COR, en sélectionnant l'onglet « Center of rotation » et en utilisant l'option de recherche automatique du COR avec une précision de « High Quality » et une sélection « Dual slice » pour le calcul du COR. Ensuite, cliquez sur « Start » pour lancer le calcul. Une fois le COR déterminé, cliquez sur l'onglet « Volume » pour sélectionner l'échantillon à reconstruire.

Utilisez les vignettes pour modifier les fenêtres de sélection de volume. Ensuite, cliquez sur Démarrer pour effectuer la reconstruction et créer le fichier de volume contenant les données 3D. Pour préparer une pile d'images pouvant être traitée par RooTrak, chargez le fichier de volume dans ImageJ en cliquant sur Fichier, Importer, Nu, puis en sélectionnant le fichier de volume.

Pour optimiser le contraste d'image entre la racine et le sol, cliquez sur l'onglet Image, puis choisissez Ajuster la luminosité/le contraste et sélectionnez Automatique. Lorsque la région d'intérêt est clairement visible, les paramètres sont considérés comme optimisés. Enregistrez les images sous forme de séquence d'images au format JPEG, BMP ou PNG en cliquant sur Enregistrer sous et en choisissant Séquence d'images.

Pour traiter les images dans RooTrak afin de segmenter la racine, sélectionnez l'onglet « Tools » et choisissez Tracker. Ensuite, double-cliquez sur la zone de saisie blanche de la boîte de dialogue pour charger une pile d'images. Une fois les images chargées, sélectionnez l'onglet « Tracker » et placez des points initiaux à l'intérieur de la racine en cliquant sur plusieurs points situés dans chacune des sections de racine pertinentes visibles sur la coupe en vue supérieure des données volumétriques.

Réglez le paramètre de suivi « smoothness » (douceur) à 0,3 et celui de la « similarity » (similarité) à 0,8. Cliquez sur le champ ci-dessous « Répertoire de sortie » pour choisir un dossier. Ensuite, cliquez sur « Sélectionner le dossier » puis sur « Démarrer ».

La fonction de suivi s'exécutera ensuite. Elle suivra la racine depuis la tranche supérieure de l'image jusqu'à la tranche inférieure. Après avoir ouvert et visualisé les données volumétriques, sélectionnez le nombre de tranches en fonction du volume de données utilisable.

Dans l'exemple présenté ici, le suivi a été arrêté à 200 tranches, ce qui correspond à une profondeur de 6,2 millimètres, où les limites des racines devenaient mal définies. Pour effectuer une analyse de volume et de surface dans ImageJ, convertir la pile d'images provenant de RooTrak en un format d'image binaire en sélectionnant Traitement, Binaire, puis Rendre binaire. Utiliser le module complémentaire ImageJ open source BoneJ pour créer le maillage triangulaire en choisissant Modules complémentaires, BoneJ, puis Isosurface.

Dans la fenêtre des options qui s'ouvre, réglez « Rééchantillonnage » et « Seuil » à six et 120, respectivement. Ensuite, cochez « Afficher la surface » et appuyez sur le bouton « OK ». Dans la visionneuse 3D qui s'ouvre, cliquez sur l'onglet « Fichier ».

Ensuite, cliquez sur Exporter les surfaces et enregistrez au format binaire STL. Enfin, ouvrez IMESHJ. Chargez le fichier STL en cliquant sur Sélectionner le fichier STL et saisissez la taille du voxel en micromètres.

Cliquez sur « Entrer la taille du voxel » et saisissez 31 microns, puis cliquez deux fois sur OK. Cliquez sur « Calculer la surface » pour obtenir la surface totale des racines de l'échantillon en millimètres carrés. Ensuite, cliquez sur « Calculer le volume » pour obtenir le volume total des racines de l'échantillon en millimètres cubes.

L'échantillon, composé de deux tiges de la graminée indigène Sporobolus heterolepis, appelée couramment prairie dropseed, et du sol d'origine qui l'entoure, est présenté ici. La taille des voxels des données reconstruites était d'environ 31 micromètres cubes. Après avoir créé une pile d'images et augmenté le contraste entre les racines et le sol, les données reconstruites ont montré que la racine et certaines composantes du sol possèdent des facteurs d'atténuation aux rayons X très similaires, ce qui entraîne une faible ou nulle différence de contraste en niveaux de gris sur les images.

Cette figure montre un point de départ représentatif qui a été sélectionné à l'intérieur d'une section racinaire pertinente visible dans la coupe supérieure des données volumétriques. En utilisant les paramètres de RooTrak décrits dans cette vidéo, RooTrak a correctement segmenté les environnons 200 coupes sélectionnées des données volumétriques, ce qui correspondait à une profondeur de 6,2 millimètres. La segmentation de la racine est également illustrée dans cette animation.

Ici, ImageJ a été utilisé pour générer une isosurface en maillage triangulaire du volume 3D à partir des données produites par RooTrak. Les paramètres par défaut utilisés ont permis d'obtenir une isosurface détaillée de manière relativement rapide. Enfin, à l'aide de IMESHJ, la surface a été calculée à 351,87 millimètres carrés et le volume calculé s'élève à 47,27 millimètres cubes.

Une fois maîtrisée, cette procédure peut être réalisée en cinq heures si elle est effectuée correctement. Lors de la mise en œuvre de cette technique, il est important de se rappeler de respecter toutes les procédures de sécurité. Il est également important de garder à l’esprit que la segmentation des racines n’est possible que s’il existe un contraste suffisant en imagerie aux rayons X entre les racines et le sol.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres échantillons présentant des structures ramifiées, comme les feuilles d'arbres, les poumons d'animaux ou humains, entre autres, peuvent être imagés et analysés afin de répondre à d'autres questions, telles que la manière dont les tissus vivants se développent ou comment ils tolèrent certaines conditions. Une fois développée, cette technique ouvre la voie aux chercheurs en sciences végétales pour explorer des caractéristiques telles que la résistance à la sécheresse chez des plantes modèles comme Brachypodium. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d'imaginer un échantillon végétal par tomographie, de visualiser sa structure racinaire et d'extraire des informations quantitatives sur la racine à partir de données de microtomographie X en trois dimensions obtenues sur des échantillons en sol.

N'oubliez pas que le travail avec des instruments à rayons X peut être dangereux, et que les procédures de sécurité pertinentes doivent être suivies lors de la mise en œuvre de cette technique.