Utilisation à haute résolution tomodensitométrie pour visualiser la structure tridimensionnelle et la fonction des vaisseaux sanguins des végétaux

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser la technologie de microtomographie à rayons X basée sur le synchrotron pour explorer la structure et la fonction du transport vasculaire chez les plantes. Pour ce faire, il faut d’abord préparer les échantillons à installer dans un support de mandrin ou dans le support de plante vivante, en s’assurant que la portion à balayer est aussi verticale que possible et en prenant les mesures physiologiques préliminaires nécessaires. La deuxième étape consiste à placer les échantillons préparés ou les plantes vivantes dans le clapier A LS Beamline 8.3 0.2 et à sécuriser le clapier pour le balayage. Prochain.

Une fois l’échantillon correctement positionné, le balayage est lancé. La dernière étape consiste à utiliser les ordinateurs des stations de travail pour normaliser, reconstruire et évaluer la qualité du balayage avant de transmettre les données dans un VISO pour le processus de visualisation 3D. En fin de compte, la microtomographie à rayons X est utilisée pour révéler des détails fins sur les interconnexions et l’état fonctionnel du système vasculaire conducteur d’eau chez les plantes.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la coupe en série et la microscopie optique, est que les tissus végétaux peuvent être explorés dans n’importe quelle orientation avec une résolution sans précédent. Cette méthode peut nous aider à comprendre des questions clés dans le domaine de la biologie végétale, des aspects fondamentaux du transport de l’eau dans les plantes à la sécheresse, en passant par la tolérance au gel et la façon dont les agents pathogènes se déplacent systématiquement dans les plantes hôtes. Ce protocole, tel que décrit, est conçu pour travailler à la source lumineuse avancée.

8,3 0,2. Des adaptations de la ligne de faisceau peuvent être nécessaires pour travailler dans d’autres installations synchrotron. Assurez-vous de suivre la formation sur la sécurité et les rayonnements requises pour l’utilisation de ces installations afin de commencer la préparation des échantillons pour les plantes vivantes.

Cultivez d’abord les plantes dans des pots d’environ 10 centimètres de diamètre, en veillant à ce que la tige principale ou toute autre partie de la plante à scanner soit aussi centrée que possible et orientée verticalement dans le pot. Les dimensions physiques de l’instrument HRCT Hutch limitent les plantes vivantes à environ un mètre de hauteur. Par conséquent, l’imagerie des plantes vivantes est mieux réalisée sur des semis ou des jeunes arbres.

Cultivé dans de petits pots, utilisez un support de casserole en aluminium rigide sur mesure pour monter les plantes vivantes en pot. La hauteur de la plaque supérieure doit être ajustée pour s’adapter à une gamme de hauteurs de pot. Ici, le haut de la plaque est conçu pour s’aligner avec le haut de la surface du sol et la plante dépasse du centre de la plaque en deux parties.

Une fois monté dans le support, mesurez le potentiel hydrique de la tige à l’aide d’une chambre de pression de type atterrisseur SHO ou d’un paramètre de feuille à clipser pour déterminer l’état physiologique de la plante avant le balayage. Enroulez un petit morceau de fil de cuivre autour de la tige pour servir de fiduciaire afin d’assurer un emplacement de balayage cohérent sur les plantes qui seront scannées à plusieurs reprises. Maintenant, placez un cylindre en acrylique à paroi mince sur la plante sur le dessus du support de plante en aluminium et fixez-le en place avec des vis pour stabiliser l’échantillon.

Des serviettes en plastique et du ruban adhésif supplémentaires doivent être utilisés pour minimiser davantage les vibrations et les mouvements des parties de la plante, qui peuvent causer des distorsions de l’image. Fixez le support de manique personnalisé à la platine de roulement à air et verrouillez-le en place positionné entre la source de rayons X et le capteur d’imagerie et l’équipement de caméra. Assurez-vous de positionner la tige aussi verticalement que possible et de centrer l’échantillon sur la base du mandrin magnétique pour vous assurer qu’il reste dans le champ de vision Pendant la rotation, le matériel végétal frais, généralement des tiges ou des animaux domestiques, peut être scanné après avoir été immédiatement retiré d’une plante vivante.

Si l’objectif de l’expérience est de visualiser l’ensemble du réseau de xylèmes, l’eau à l’intérieur des récipients doit d’abord être évacuée et remplacée par de l’air. Pour ce faire, montez l’échantillon dans une chambre de pression de type diffamation et poussez de l’air comprimé ou de l’azote à travers l’échantillon à basse pression pendant environ cinq minutes. Les espèces varieront dans le temps nécessaire pour évacuer le réseau de navires.

Si l’intention est d’évaluer l’étendue de la formation d’embolie dans les tissus végétaux frais, excisez les échantillons de la plante à l’aide d’une lame de rasoir fraîche en effectuant les coupes sous l’eau. Ensuite, enveloppez l’échantillon dans une couche de paraforme pour éviter la dessiccation pendant le balayage, montez l’échantillon dans un mandrin de perçage fixé à une plaque métallique vissée au centre de la platine de roulement à air, et orientez l’échantillon verticalement comme décrit précédemment afin de vous assurer que l’échantillon reste dans le champ de vision. Pour préparer des échantillons à partir de tissus ligneux séchés, commencez par couper des échantillons d’environ six centimètres de long.

Sélectionnez des échantillons aussi droits que possible dans la zone de balayage ciblée et d’un diamètre d’environ un centimètre. L’étape suivante consiste à déshydrater lentement l’ensemble de l’échantillon pour assurer une visualisation optimale de l’échantillon de tissu et un contraste d’image. Placez l’échantillon de tissu ligneux dans un four de séchage à basse température pour sécher lentement l’échantillon sans provoquer de fissure ou de fendillement du tissu.

Dans certaines situations, il peut être souhaitable d’avoir un marqueur fiduciaire attaché à l’échantillon. Cela garantit que la dissection et la visualisation ultérieures à l’aide de la microscopie électronique à balayage peuvent être orientées vers des points spécifiques de l’image HRCT. Pour ce faire, fixez une perle ou un fil de métal ou de verre à l’extérieur de la tige à l’aide d’un parfum.

Enfin, montez l’échantillon dans le contrôle de forage et centrez-le comme décrit ci-dessus avant le balayage. Déterminez le grossissement qui conviendra le mieux à votre application. La ligne de faisceau A LS 8.3 0.2 utilisée ici a la capacité de scanner avec des objectifs avec des grossissements de deux x cinq x et 10 x.

Réglez l’énergie des rayons X à 15 kilo-électronvolts. Les temps d’exposition dépendent généralement de l’épaisseur et de la densité de l’échantillon et varient de 100 à 1000 millisecondes. Choisissez un incrément angulaire adapté à votre application.

Les échantillons sont pivotés à 180 degrés pendant un balayage, et le nombre d’images prises pendant la rotation peut avoir un impact significatif sur la taille de l’ensemble de données, la durée de l’intervalle de balayage et la qualité de l’image finale. Les numérisations typiques sont effectuées par incréments de 0,25 degré, ce qui donne 513 images par numérisation. Des intervalles de balayage plus courts peuvent être obtenus à l’aide du réglage de tomographie continue pendant lequel l’échantillon tourne continuellement pendant que les images sont capturées pour chaque balayage, des images en fond clair et en fond noir doivent également être collectées.

Les images en fond clair sont des images sans l’échantillon dans le faisceau. Ceux-ci sont souvent collectés avant et après le balayage de l’échantillon en transférant horizontalement l’échantillon. Les champs sombres sont collectés en fermant l’obturateur à rayons X.

Cela mesure la quantité de signal que la caméra affiche sans rayons X. Une fois la numérisation terminée, transférez les images TIFF 2D brutes de l’ordinateur d’acquisition vers un serveur de fichiers, puis exportez-les vers un ordinateur à utiliser pour le traitement des données. Ensuite, les images doivent être converties en une échelle de transmission en pourcentage.

Le Beamline 8.3 0.2 dispose d’un plugin de normalisation d’arrière-plan personnalisé qui peut être téléchargé et utilisé avec les progiciels disponibles gratuitement. Image J ou Fiji chargent les images normalisées dans le progiciel octopus, puis reconstruisent un ensemble de données 3D à partir des fichiers d’images TIFF brutes 2D en utilisant les étapes de traitement désignées. Ensuite, la pile d’images peut être visualisée dans l’un des nombreux progiciels.

Ici, le progiciel aviso est utilisé, chargez les ensembles de données dans la mémoire système et affichez l’échantillon dans des orientations de coupe transversale, longitudinale ou radiale virtuelle. En raison des attributs 3D de l’ensemble de données, les tranches virtuelles de l’échantillon peuvent être pivotées dans n’importe quel plan pour s’aligner sur les régions d’intérêt. Une fois la segmentation effectuée, il est possible de quantifier les structures de l’usine cible ou les changements fonctionnels de volume, de longueur, de largeur, de présence ou d’absence d’eau, d’air, etc. Les scans Synchrotron HRCT ont été mis en œuvre avec succès sur une grande variété de tissus et d’espèces végétales à l’aide de la ligne de faisceau 8.3 0.2, et ont fourni de nouvelles informations sur la structure et la fonction du xylème végétal à une résolution sans précédent en 3D.

Les capacités de visualisation et d’exploration fournies par les reconstructions 3D, comme on le voit ici, permettent de déterminer avec précision l’emplacement et l’orientation des structures avec les réseaux de xylèmes sur des échantillons d’accise et dans des plantes vivantes. Ici, nous voyons une reconstruction 3D de la tige de séquoia soumise au stress de la sécheresse et présentant des traches remplies d’air et d’eau Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques minutes si elle est effectuée correctement En suivant cette procédure. D’autres méthodes, comme la microscopie électronique à balayage, peuvent être utilisées pour valider les structures que nous voyons à l’intérieur des plantes et établir des seuils de taille, qui sont ensuite introduits dans les programmes de traitement que nous utilisons pour l’analyse des données.