Name: Utilisation de la tomographie par Micro-calculé pour lévaluation des tumeurs du développement et de suivi de la réponse au traitement dans un modèle murin de cancer du poumon (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Découvrez l'utilisation de la micro-tomographie pour évaluer le développement tumoral et suivre la réponse au traitement dans un modèle murin de cancer du poumon. Cette méthode permet un suivi en temps réel des nodules tumoraux.

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Ce travail a été soutenu par une subvention-in-Aid de JSPS KAKENHI pour AEH (Grant Number 25461196) et la tuberculose (Numéros de Grant 23390218 et 15H04833) et National Institutes of Health HL111190 de subvention (DMO). Les auteurs tiennent à remercier Miyuki Yamamoto pour ses efforts pour aider avec le génotypage des animaux et la préparation des coupes histologiques. Nous sommes reconnaissants envers les ressources de collaboration de recherche, École de médecine, Université de Keio pour le support technique et des réactifs.

Les expérimentations animales ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle de l&#39;Université Keio. Note: Dans cette étude, nous avons utilisé le Sftpc-rtTA et Tre-FGF9-IRES-EGFP DT souris dans lesquelles adénocarcinome du poumon se développe rapidement après l&#39; induction par l&#39; alimentation chow contenant doxycycline 6,7. Cependant, toutes les procédures d&#39;évaluation peuvent être appliqués à d&#39;autres modèles murins de cancer du poumon. 1. Expérience Outline: <ol><li> Identifier l&#39;état des poumons à la ligne de base: <ol><li> Avant l&#39;induction de tumeurs, lorsque les souris DT sont 8 - 12 semaines effectuer la première analyse micro-CT (voir les sections 2 et 3 ci-dessous). Cela sert de balayage de référence du poumon, confirme l&#39;absence de nodules développé spontanément causées par un transgène qui fuit, et documenter l&#39;absence de toute pathologie pulmonaire existant avant l&#39;induction de la tumeur. </li></ol></li><li> Initier l&#39;induction de tumeurs: <ol><li> Mettez les souris DT de ch régulièreomment doxycycline chow pour induire le facteur de croissance des fibroblastes (FGF) 9 expression dans les cellules alvéolaires et d&#39;initier le développement de tumeurs. Donnez doxycycline chow (200 ppm) ad libitum. </li></ol></li><li> Confirmer le développement des nodules tumoraux dans les poumons de souris: <ol><li> Effectuer une analyse micro-CT pour identifier le développement des nodules tumoraux par rapport à l&#39;analyse pré-induction. </li></ol></li><li> Évaluer la réponse au traitement: <ol><li> Afin de tester la capacité du micro-CT pour détecter des changements dans les nodules de tumeur en réponse à un traitement, l&#39;administration du récepteur FGF (FGFR) inhibiteur AZD4547, puis effectuer des analyses de micro-CT supplémentaires au bout de 5 et 10 semaines. </li></ol></li><li> Point final d&#39;évaluation: <ol><li> Euthanasier toutes les souris de traitement et de contrôle et les tissus de processus pour l&#39;évaluation histologique (voir la section 6 ci-dessous). </li></ol></li></ol> 2. Souris Préparation pour Micro-CT Acquisition de l&#39;image: <ol><li> Allumez le scanner micro-CT et de l&#39;ordinateur. </li><li> Cliquezk sur le logiciel nommé &quot;R_m CT2&quot;, puis cliquez sur «réchauffer». </li><li> Retirez le lit de l&#39;échantillon sur lequel la souris sera placé de la chambre micro-CT. Enroulez le lit avec une pellicule de plastique. </li><li> Activez la case à induction de l&#39;anesthésie en ajoutant isoflurane au vaporisateur d&#39;anesthésie au niveau marqué. Réglez le débit isoflurane à 3 L / min. </li><li> Ouvrez le réservoir d&#39;oxygène pour démarrer le flux d&#39;oxygène dans la zone d&#39;induction et régler le débit à 1 L / min. </li><li> Placez la souris dans la zone d&#39;anesthésie à induction et confirmer qu&#39;il est profondément anesthésié par l&#39;absence de mouvement spontané et en réponse à une pincée de la peau (une pincée douce d&#39;un petit pli de la peau, ce qui ne provoque pas de dommages aux tissus ou rupture de la peau). </li><li> Appliquer un lubrifiant oculaire pour prévenir la sécheresse de la cornée pendant l&#39;anesthésie. </li><li> Ouvrir la chambre de micro-CT et placer la souris avec la face dorsale sur le lit d&#39;échantillon. Maintenir la tête de la souris et tirer le corps vers le bas depuis les membres inférieurs en order pour étirer et redresser le corps symétriquement. </li><li> Éteignez le flux d&#39;anesthésie à la boîte à induction et allumez-le vers le tube qui se connecte à la chambre micro-CT. </li><li> Placer le tube d&#39;anesthésie dans le nez de la souris pour administrer un anesthésique continu. </li><li> Afin de fixer la souris en position; envelopper la souris et le lit de l&#39;échantillon avec une pellicule de plastique. Note: Il est essentiel de garder la souris sous anesthésie profonde et enveloppé dans le lit de l&#39;échantillon parce que tout léger mouvement ou une torsion de son corps lors de l&#39;analyse se traduira par des images floues et des difficultés d&#39;interprétation. </li><li> Fermez la chambre micro-CT. </li><li> Réglez le système de micro-CT à 90 kV et 160 uA et le temps de balayage à 4,5 min. Définissez la plage d&#39;image à 24 × 19 mm et la taille de voxel à 50 x 50 x 50 um. Utilisez le mode synchrone pour les battements de coeur. </li><li> Créez un nouveau dossier dans la &quot;base de données&quot; afin d&#39;enregistrer de nouvelles images dans ce dossier. </li><li> Démarrez le scan. </li><li> Après l&#39;achèvement de l&#39;analyse, déplacez la souris dans une cage vide et observer jusqu&#39;à ce qu&#39;elle reprenne conscience. Ne pas le mettre avec d&#39;autres souris jusqu&#39;à ce qu&#39;il ait complètement récupéré des effets de l&#39;anesthésie. </li></ol> 3. Pré-induction Micro-CT Visualisation et analyse des images: <ol><li> Pour visualiser les images micro-CT, télécharger le logiciel ImageJ gratuitement sur ​​le site Web suivant: <a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a> . Remarque: Tous les fichiers de données micro-CT est une pile d&#39;environ 500 fichiers TIF (.tif). D&#39;autres logiciels de visionnement d&#39;images peut également être utilisé. </li><li> Ouvrez les micro-CT fichiers série d&#39;images et de faire défiler toutes les images de chaque souris à partir du cou à l&#39;abdomen ou vice versa. </li><li> Utilisation des contrôles de souris de type sauvage naïfs, d&#39; identifier la densité des différentes zones et structures anatomiques normales dans la poitrine basée sur la connaissance de l&#39; anatomie de la souris (voir la figure 1A). <ol><li> Maintenez le curseur avec lasouris d&#39;ordinateur et défiler vers le haut, à partir des viscères abdominaux et le diaphragme blanchâtre, à travers la poitrine et à la nuque. </li><li> Identifier les points de repère osseux thoracique cage (sternum à l&#39;avant, vertèbres dans le dos et les côtes sur les côtés). </li><li> Identifier le cœur sur le devant de la poitrine et les principaux vaisseaux sanguins près du coeur et dans le médiastin. </li><li> Observez la lumière de la trachée (comme un petit cercle noir au niveau du cou et de la poitrine), qui bifurque en droit et des bronches principales gauche puis continuer à se ramifier dans les bronches plus petites et plus petites. A noter que chaque bronche est étroitement associée à deux ou trois vaisseaux sanguins (figure 1A). </li></ol></li><li> Commencez examiner les scans de souris DT induite par l&#39;ONU et d&#39;identifier la présence d&#39;éventuelles anomalies. <ol><li> Exclure des souris avec des ombres anormales pré-induction pulmonaires (par exemple, des nodules, bullae emphysémateuse, etc.) à partir d&#39;autres expériences. (Figure 1C-E, G, H </strong&gt;). </li></ol></li></ol> 4. Tumeur Induction: <ol><li> Pour induire le développement de tumeurs chez les souris expérimentales qui ont montré scintigraphies pulmonaires normales, passer leur nourriture de chow chow régulier contenant doxycycline (200 ppm). </li></ol> 5. Suivi scans: <ol><li> Au bout de 10 semaines, effectuer un second balayage micro-CT de toutes les souris pour confirmer le développement de nodules tumoraux dans les poumons (voir la figure 2). </li><li> Diviser les souris en deux groupes. Administrer le AZD4547 FGFR de blocage (125 ug / kg / jour par l&#39;intermédiaire d&#39;un tube gastrique pendant 6 jours / semaine pendant 10 semaines) à un groupe et un placebo à l&#39;autre groupe témoin pendant 10 semaines. </li><li> Le suivi des changements dans les ombres nodulaires en réalisant un troisième balayage 4 - 5 semaines plus tard. </li><li> Au bout de 10 semaines de traitement, effectuer un quatrième balayage. </li><li> Euthanize toutes les souris avec inhalation de CO 2 ou avec une injection intraperitoneale de 0,1 mg / 200 ul de pentobarbital. </li><li> Àidentifier les changements dynamiques dans les nodules tumoraux après l&#39; induction et en réponse à un traitement, d&#39; identifier des positions similaires dans les images de balayage en série de la même souris à deux ou plusieurs points de temps puis vérifier l&#39;apparition / disparition de toute ombres anormales (Figure 3 ). </li><li> Pour faciliter l&#39;identification du même plan dans la même souris à différents points dans le temps, essayer d&#39;associer le plan d&#39;intérêt avec les structures anatomiques au sein du repère poitrine de la souris. <ol><li> Utilisez des monuments tels que la trachée, sa bifurcation, le droit et les bronches principal gauche, l&#39;aorte, le diaphragme et les gros vaisseaux sanguins. Note: les os thoraciques, y compris les vertèbres thoraciques, les côtes et le sternum sont moins utiles comme repères en raison de inclinaisons mineures communes dans l&#39;alignement du corps de la souris sur le lit de l&#39;échantillon, ce qui augmente la possibilité d&#39;une interprétation erronée de la position de balayage de positionnement. De même, le numéro de série d&#39;image dans le fichier d&#39;analyse est peu fiable pour IDENTIFIERg dans la même position au cours du temps en raison de la variation de la longueur du corps de souris à partir d&#39;un point de temps à l&#39;autre. Le défaut ou l&#39;inexactitude dans l&#39;identification du même plan à différents points de temps peut entraîner une fausse interprétation positive / négative des résultats. </li></ol></li></ol> 6. Souris Euthanasia and Lung Collection: <ol><li> Euthanize souris avec du CO 2 par inhalation ou par injection intrapéritonéale de 0,1 mg / 200 ul de pentobarbital. </li><li> Exposer les viscères abdominaux en coupant longitudinalement à travers la paroi abdominale. Purger la souris pour réduire le volume de sang dans les poumons par dissection de l&#39;aorte abdominale. </li><li> Entailler le diaphragme avec des ciseaux fins; cela se traduira par une perte de la pression négative dans la cavité thoracique, ainsi effondrer les poumons. Exposer les poumons et le cœur en coupant et en enlevant les parties des nervures de la paroi thoracique antérieure. Nettoyer la partie frontale du cou en coupant les tissus de la peau et doux pour exposer la Tracheune. </li><li> Coupez le cœur et la glande thymus. Insérer une pince derrière la trachée pour le séparer de l&#39;oesophage. </li><li> Cathétériser la trachée avec une canule G24 puis fixez-le en place en serrant un fil autour de la partie insérée. </li><li> Gonfler et fixer le poumon en utilisant glacée paraformaldéhyde 4% (PFA) à travers la canule trachéale en utilisant une colonne de 25 cm. Détachez la canule et serrer le fil pour éviter les fuites PFA puis couper la trachée supérieure de son attachement au larynx. </li><li> Tirez la trachée du fil de suture et de disséquer de son attachement, et continuer vers le bas pour l&#39; enlever avec le poumon en -bloc. Insérer dans un tube de 15 ml contenant 5 ml de 4% de PFA. Laissez les poumons en PFA O / N pour assurer la pénétration tissulaire complète et fixation, puis de traiter le tissu dans un bloc de paraffine 8 standard. </li><li> Couper des blocs de paraffine en 6 tranches um d&#39;épaisseur sur un microtome et coloration à l&#39; hématoxyline et à l&#39; éosine en utilisant des techniques standard. </li></ol&gt; 7. Évaluation histologique: Remarque: Bien que l&#39;utilisation d&#39;un &quot;scanner de diapositives&quot; pour l&#39;évaluation numérique histologique est décrite ici, l&#39;utilisation de microscopes réguliers et l&#39;évaluation visuelle histologique d&#39;évaluation est également possible. <ol><li> Allumez l&#39;instrument de scanner de diapositives et l&#39;ordinateur. </li><li> Cliquez sur le logiciel «scan NPD». </li><li> Sélectionnez le mode de balayage &quot;Lot de diapositives&quot; et &quot;Mode Semi-Auto&quot; pour balayer une série de diapositives. Remarque: Le bras robotisé qui ramasse les lames pendant le balayage séquentiel est très sensible à toutes les irrégularités sur les bords des lames de verre. </li><li> Palper les bords de toutes les lames de verre avant de les charger dans la machine. En cas de dépassement de la vitre de protection ou de milieu de montage séché, le nettoyer avec un cutter ou un scalpel. </li><li> Charger les lames dans une cassette de diapositives. Ouvrez la trappe de l&#39;échantillon et faites glisser la cassette en position «on»;. Ferme la porte. </li><li> Sur le logiciel informatique, donner des noms descriptifs courts à toutes les diapositives dans leur position correspondante dans la cassette puis cliquez sur le bouton &quot;OK&quot;. </li><li> Sélectionnez le mode de profil: &quot;Brightfield&quot;. </li><li> Cliquez sur &quot;Batch Démarrer&quot; pour lancer le balayage provisoire. Remarque: Une fois que la machine a terminé la numérisation de toutes les diapositives, le logiciel détecte automatiquement les zones avec des tissus sur toutes les diapositives et suggérer comme une région d&#39;intérêt. </li><li> Si nécessaire, redéfinir la zone d&#39;intérêt en maintenant le bouton gauche de la souris et en tirant la région frontalière. Remarque: La définition trop grandes surfaces des lames comme les régions d&#39;intérêt se traduira par un temps beaucoup plus long scan. </li><li> Une fois satisfait des régions d&#39;intérêt sur toutes les diapositives, cliquez sur &quot;Scan&quot; pour commencer à numériser toutes les diapositives. Remarque: Les fichiers numérisés peuvent être observés numériquement en basse et haute résolution, et les images peuvent être exportées au format JPEGfichiers. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La méthode basée sur la micro-CT décrit ici pour l&#39;identification en temps réel des anomalies pulmonaires et le suivi du développement des nodules tumoraux et la réponse au traitement dans des modèles animaux de cancer du poumon permettra aux scientifiques qui mènent des expériences liées au cancer du poumon à planifier plus expériences précises et efficaces tout en économisant du temps et des ressources. Nous avons déjà utilisé l&#39; IRM dans le même but 6. La clarté de l&#39;analyse et le seuil pour la...

Le cancer du poumon est la principale cause de décès par cancer dans le monde 1. La recherche sur la prévention, la détection précoce et le traitement du cancer du poumon est en cours dans de nombreux centres de recherche à travers le 2,3 mondial. Plusieurs modèles animaux pour le cancer du poumon ont été mis au point, et ils se sont avérés utiles dans l&#39; étude des mécanismes de la carcinogenèse du poumon et de cellules d&#39;origine, pour déterminer la présence de cellules souches cancéreuses et , en examinant les diverses stratégies thérapeutiques 4. Les premiers modèles invoqués sur l&#39; initiation de la tumeur induite par carcinogène dans des souches de souris sensibles 5. Le développement de knock-out et des modèles de souris transgéniques dans lesquelles le cancer du poumon survient à la suite de lésions génétiques spécifiquement manipulés a considérablement amélioré notre capacité à contrôler l&#39; induction de la tumeur et miment plusieurs aspects du cancer du poumon humain 4. Cependant, un enjeu majeur dans l&#39;utilisation de modèles animaux de cancer du poumon est l&#39;absence d&#39;un procédé en temps réelidentifier avec précision et surveiller l&#39;apparition et le développement de tumeurs dans les poumons de souris et de documenter toute modification ultérieure de leurs tailles, telles que leur croissance continue ou diminution de la réponse aux traitements. Cela a forcé les chercheurs à recourir à plusieurs temps, d&#39;effort, et les techniques consommatrices de ressources pour identifier les tumeurs et d&#39;évaluer leurs résultats expérimentaux. La présence de la variation inhérente entre la souris en réponse à l&#39;induction d&#39;une tumeur nécessite l&#39;utilisation d&#39;un grand nombre d&#39;animaux dans chaque groupe expérimental pour réduire la variabilité des données. L&#39;incapacité à évaluer la croissance de la tumeur ou la réponse au traitement en temps réel a forcé les chercheurs à euthanasier aveuglément des souris à de multiples points de temps dans des protocoles expérimentaux prolongés pour garantir qu&#39;ils recueilleront les bonnes données, ce qui entraîne le gaspillage des ressources à partir des échantillons recueillies à des moments qui sont soit trop tôt ou trop tard. Dans la présente étude, une méthode pour exploiter un petit animal micro-ctomographie par omputed (micro-CT) pour détecter et le suivi des tumeurs du poumon chez les souris vivant est introduit. Nous avons utilisé notre récemment décrit Sftpc-rtTA et Tre-FGF9-IRES-EGFP double transgénique (DT) des souris qui se développent rapidement adénocarcinome pulmonaire après induction par doxycycline 6,7. L&#39;utilisation de micro-CT nous permet de (entre autres choses) excluent les souris présentant des anomalies pulmonaires aberrantes avant l&#39;induction, confirmer le développement des nodules tumoraux dans les poumons après l&#39;induction, et observer les changements dans les nodules tumoraux en réponse à des traitements expérimentaux. Point final euthanasie des souris et l&#39;évaluation histologique a confirmé l&#39;exactitude de l&#39;évaluation en temps réel réalisée avec des micro-CT. Nous croyons que cette technique va ouvrir la voie à la réalisation d&#39;expériences mieux planifiées utilisant des modèles animaux de cancer du poumon, tout en économisant des ressources précieuses, de raccourcir le temps d&#39;observation et d&#39;augmenter la précision et la compréhension des résultats.

<table><tbody><tr><td>micro-rayons X&ndash ; tomodensitométrie</td><td>Rigaku</td><td>R_mCT2</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer RS Système de pathologie numérique</td><td>Hamamatsu&nbsp ;</td><td>RS C10730</td><td></td></tr><tr><td>NDP.view2&nbsp ; Logiciel de visualisation</td><td>Hamamatsu&nbsp ;</td><td>U12388-01</td><td>http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html</td></tr><tr><td>Vaporisateur d’isoflurane - Funnel-Fill</td><td>VETEQUIP</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Chambre à induction, 2 L&nbsp ; W9.5 et fois ; D23 & fois ; H9.5</td><td>VETEQUIP</td><td>941444</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Mylan</td><td>ES2303-01</td><td></td></tr><tr><td>AZD 4547</td><td>LC Labratories</td><td>A-1088</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Kyoritsu</td><td>SOM02-YA1312</td><td></td></tr><tr><td>G24 canule&nbsp ;</td><td>Terumo</td><td>SP-FS2419</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Wako</td><td>163-20145</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>SLC Japon/PMI Nutrition International</td><td>5TP7</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ logiciel&nbsp ;</td><td>Institut national de la santé</td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Pommade vétérinaire Puralube (lubrifiant oculaire)</td><td>Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation de la tomographie par micro-calculé pour l&#39;évaluation des tumeurs du développement et de suivi de la réponse au traitement dans un modèle murin de cancer du poumon

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

Le cancer du poumon est le cancer le plus mortel au monde. Des recherches intensives sont en cours dans le monde entier pour identifier de nouvelles thérapies contre le cancer du poumon. Plusieurs modèles murins de cancer du poumon sont utilisés pour étudier le mécanisme de développement du cancer et pour expérimenter diverses stratégies thérapeutiques. Cependant, l’absence d’une technique en temps réel permettant d’identifier le développement des nodules tumoraux dans les poumons de souris et de surveiller les changements de leur taille en réponse à diverses interventions expérimentales et thérapeutiques entrave la capacité d’obtenir une description précise de l’évolution de la maladie et de sa réponse rapide aux traitements. Dans cette étude, une méthode utilisant un scanner de micro-tomodensitométrie (TDM) pour la détection du développement de tumeurs pulmonaires dans un modèle murin d’adénocarcinome pulmonaire est décrite. Ensuite, nous montrons qu’un suivi mensuel par micro-TDM peut identifier des changements dynamiques dans la tumeur pulmonaire, tels que l’apparition de nodules supplémentaires, l’augmentation de la taille des nodules précédemment détectés et la diminution de la taille ou de la résolution complète des nodules en réponse au traitement. Enfin, la précision de cette méthode d’évaluation en temps réel a été confirmée par la quantification histologique finale. Cette technique ouvre la voie à la planification et à la réalisation d’expériences plus complexes sur des modèles animaux de cancer du poumon, et elle nous permet de mieux comprendre les mécanismes de cancérogenèse et les effets des différentes modalités de traitement tout en économisant du temps et des ressources.

Identification des souris présentant des anomalies pulmonaires a été réalisée à l&#39;inclusion. Avant l&#39;induction de la tumeur, lorsque les souris étaient DT 8 - 12 semaines d&#39;âge, les poumons de toutes les souris ont été balayées avec des micro-CT. Étonnamment, environ 50% des souris ont montré des anomalies qui nous ont obligés à juger impropres à l&#39;inclusion dans l&#39;étude ultérieure. Ces anomalies étaient des ombres nodulaires-like, grande petite bullae emphysematous u...

Nous décrivons une méthode de détection du développement de nodules tumoraux dans les poumons d’un modèle murin d’adénocarcinome à l’aide de la micro-tomodensitométrie et son utilisation pour surveiller les changements de taille des nodules au fil du temps et en réponse au traitement. L’exactitude de l’évaluation a été confirmée par la quantification histologique du point final.

Utilisation de la tomographie par Micro-calculé pour l&#39;évaluation des tumeurs du développement et de suivi de la réponse au traitement dans un modèle murin de cancer du poumon

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse ...

L'objectif général de cette vidéo est d'identifier les avantages de l'utilisation de la micro-TDM pour l'évaluation du développement tumoral, de la réponse au traitement et d'autres expériences dans les modèles murins de cancer du poumon. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine du cancer du poumon lorsqu'on utilise des modèles murins, telles que le moment où les tumeurs commencent à se développer, la vitesse de croissance et la réponse aux interventions thérapeutiques. Cette technique nous permet d'identifier quels animaux doivent être exclus de notre étude, tout en détectant en temps réel les modifications de la taille de leurs tumeurs.La technique permet de gagner du temps et des efforts, et réduit nettement le nombre de souris par groupe d'étude. À partir du scanner micro-CT, accédez au contrôle informatique et ouvrez le logiciel nommé RMCT2. Ensuite, lancez le cycle de préchauffage. Préparez ensuite le lit d'échantillon du scanner pour la souris en l'enveloppant dans du plastique.Ensuite, anesthésiez la souris à l’aide d’isoflurane et confirmez qu’elle est anesthésiée à l’aide d’une pincée cutanée. Une légère pincée d’un petit pli de peau est suffisante. Ensuite, appliquez un onguent ophtalmique pour prévenir la sécheresse cornéenne.Maintenant, placez la souris, côté dorsal vers le haut, sur le lit d'échantillonnage. Tenez la tête de la souris et tirez le corps vers le bas à partir des membres inférieurs afin d'étirer et de redresser le corps de manière symétrique. Ensuite, acheminez le gaz anesthésique vers la chambre et positionnez le tube à gaz à côté du nez de l'animal pour administrer un anesthésique en continu.Ensuite, enveloppez la souris et le lit d'échantillon dans du plastique afin de maintenir la souris en place. Assurez-vous fermement que la souris est bien immobilisée, car tout mouvement ou torsion pendant le balayage produirait des images floues et inutilisables. Fermez maintenant la chambre, réglez le système sur 90 kilo-volts et 160 micro-ampères, puis fixez la durée de balayage à 4,5 minutes.Réglez la plage d'image sur 24 millimètres. Ensuite, configurez le système en mode synchrone pour les battements cardiaques. Créez maintenant un nouveau dossier dans la base de données pour les nouvelles images et démarrez l'analyse.Après avoir terminé le balayage, déplacer la souris dans une cage vide et l'observer jusqu'à ce qu'elle reprenne connaissance. Ne pas la réintroduire auprès de ses congénères tant qu'elle n'est pas complètement remise de l'anesthésie. Ouvrir les fichiers d'images micro-CT sérielles dans ImageJ. Parcourir toutes les images de chaque souris, du cou jusqu'à l'abdomen ou inversement.Maintenant, à l'aide de coupes de souris sauvages naïves, identifier la densité des différentes régions et des structures anatomiques normales dans le thorax. Remonter vers les viscères abdominaux blancs et le diaphragme, et identifier la région à travers le thorax, jusqu'au niveau du cou. Prendre note des repères osseux de la cage thoracique : le sternum, les vertèbres et les côtes.Ensuite, identifier le cœur à l'avant du thorax, ainsi que les principaux vaisseaux sanguins situés près du cœur et dans le médiastin. La lumière de la trachée apparaît comme un petit cercle sombre au niveau du cou et du haut du thorax ; elle se divise en deux bronches principales, droite et gauche, puis continue de se ramifier en bronches de plus en plus petites. Remarquer que chaque bronche est étroitement associée à deux ou trois vaisseaux sanguins.Maintenant, commencez à examiner les scans des souris DT non induites et identifiez la présence d'anomalies éventuelles. Excluez de l'expérience toute souris présentant des ombres pulmonaires anormales avant l'induction, telles que des nodules ou des bulles emphysémateuses. Pour cette expérience, utilisez des souris dont les scans pulmonaires sont normaux et qui sont capables de développer des tumeurs induites par le FGF9.Pour induire les tumeurs, administrer de la doxycycline dans leur alimentation à raison de 200 parties par million. Après 10 semaines, effectuer un deuxième scan de micro-TDM sur ces souris afin de confirmer le développement de nodules tumoraux dans leurs poumons. Puis, répartir les souris en deux groupes.Administrez l'inhibiteur de FGFR, AZD4547, à un groupe par voie gastrique. Procédez ainsi 6 jours par semaine pendant 10 semaines. Donnez au deuxième groupe un placebo.Suivez l'évolution des ombres nodulaires en réalisant un troisième scanner quatre à cinq semaines après le début du traitement. Ensuite, à la fin du traitement complet de 10 semaines, effectuez un quatrième scanner. Puis, identifiez les modifications dynamiques des nodules tumoraux en réponse au traitement, en comparant des positions similaires au sein des images de scanner en série aux différents points temporels.Rechercher l'apparition ou la disparition d'ombres anormales. L'orientation correcte vers la même position anatomique est essentielle pour interpréter les résultats. Utiliser des repères anatomiques facilement identifiables dans la cavité thoracique, tels que la trachée, sa bifurcation, les bronches principales droite et gauche, l'aorte et les gros vaisseaux sanguins, ainsi que le diaphragme.En raison des inclinaisons du corps, les os sont des repères moins utiles. Après avoir euthanasié une souris et accédé à son cou et à ses poumons, enlever le cœur et la glande thymique. Insérer une pince derrière la trachée pour la séparer de l'œsophage.Ensuite, canulez la trachée à l’aide d’un cathéter G24, puis fixez le cathéter en nouant un point de suture placé autour de l’extrémité inter-trachéale. Maintenant, gonflez et fixez le poumon à l’aide de PFA à 4 % glacé injecté par le cathéter sous une colonne de 25 cm. Puis, retirez le cathéter et serrez le nœud sur la trachée afin d’éviter toute fuite de PFA.Maintenant, sectionnez la partie supérieure de la trachée, y compris son insertion au niveau du larynx. En tirant doucement la trachée depuis le fil de suture, disséquez-la ainsi que les poumons de toutes leurs attaches. Ensuite, retirez l'ensemble trachée-poumons en bloc.Placer les tissus dans un tube de 15 ml contenant 5 ml de PFA à 4 % à température ambiante. Laisser les poumons dans le PFA toute la nuit pour permettre une pénétration et une fixation complètes du tissu. Ensuite, traiter le tissu selon la procédure habituelle.Lors du préscreening de souris DT âgées de 8 à 12 semaines pour cette étude, environ la moitié présentaient des anomalies pulmonaires à l'examen tomodensitométrique micro-CT, ce qui les rendait inappropriées pour inclusion. Dans le cadre de l'étude, l'induction tumorale a été activée pendant 10 semaines, suivie d'un traitement. Les souris ayant reçu l'inhibiteur de FGFR, AZD4547, pendant 10 semaines ont montré une disparition ou une réduction de la taille des nodules visibles sur les scans réalisés avant le traitement.En revanche, les souris témoins ayant reçu un placebo ont présenté soit aucune modification, soit une augmentation de la taille des nodules, et/ou l’apparition de nouveaux nodules. L’évaluation histologique finale des poumons confirme l’exactitude des observations réalisées par scanner micro-CT. Les souris jugées avoir des poumons sains présentaient en effet une histologie pulmonaire normale.Alors que les souris ayant présenté des anomalies ont montré diverses modifications histologiques, notamment des bulles et des nodules. Après 10 à 12 semaines d'induction avec la doxycycline, plusieurs nodules d'adénocarcinome, de tailles et de positions variables, ont été observés chez tous les animaux. Un traitement ultérieur de 10 à 12 semaines avec un inhibiteur de FGFR a révélé un nombre réduit de nodules et de taille plus petite.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser la micro-TDM pour évaluer le développement de tumeurs dans le poumon de souris, ainsi que pour suivre les modifications de ces tumeurs en réponse à diverses procédures expérimentales. Une fois les souris préparées, les analyses peuvent être réalisées en moins de 10 minutes par souris.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder le souris sous anesthésie profonde et solidement enroulé sur le lit d'échantillonnage afin de minimiser les mouvements pendant les examens. Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine du cancer du poumon et des cellules souches cancéreuses d'explorer l'ampleur du développement tumoral, la régression progressive et la mise en place de différentes expériences. N'oubliez pas que le travail avec les rayons X peut être dangereux.Des procédures standard de fonctionnement de la machine doivent toujours être suivies lors de l'exécution de cette procédure.

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Utilisation de la tomographie par Micro-calculé pour lévaluation des tumeurs du développement et de suivi de la réponse au traitement dans un modèle murin de cancer du poumon (Vidéo) | JoVE Journal

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