L'Assemblée et l'application des «Shear Anneaux»: A Novel Endothelial Modèle pour Orbital, unidirectionnel et périodique Fluid débit et contrainte de cisaillement

L'objectif général de ce modèle est de créer une méthode simple et économique pour des études de flux périodique de fluide in vitro et de contrainte de cisaillement sur les cellules endothéliales. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la physiologie des cellules endothéliales, telles que : comment le cisaillement périodique affecte-t-il la forme, la structure et le fonctionnement des cellules endothéliales ?

Le principal avantage de cette technique réside dans l'utilisation d'un dispositif de culture tissulaire facilement assemblé, qui offre des surfaces relativement grandes pour l'évaluation des réponses cellulaires. Cette procédure sera démontrée par M. Luke White, étudiant en médecine dans mon laboratoire. Commencez cette procédure en utilisant un logiciel de présentation pour créer un modèle de construction d'anneau de cisaillement comportant un profil extérieur de 150 millimètres et un diamètre interne de 100 millimètres placé au centre du cercle de 150 millimètres.

Imprimez le modèle sur une feuille de papier blanc au format A4. Travaillez sous une hotte aspirante avec une ventilation adéquate et, en portant des gants, pipetez 10 millimètres de chlorure de méthylène dans une boîte de Petri en verre de 150 millimètres. Il est essentiel que la boîte soit en verre, car le chlorure de méthylène solubilise la plupart des plastiques.

Alignez une boîte de Pétri en plastique de 150 millimètres sur le gabarit externe de cisaillement. Utilisez un outil rotatif pour percer un trou de 3 millimètres au centre d'une boîte de 100 millimètres. Retirez toutes les particules de plastique produites lors du perçage.

Tout en tenant la boîte de Pétri de 100 millimètres avec une main gantée, retournez-la et trempez le bord supérieur de la boîte dans la flaque de chlorure de méthylène pendant environ trois secondes. Laissez le chlorure de méthylène en excès s'égoutter de la boîte de Pétri de 100 millimètres, puis transférez rapidement la boîte humide, bord vers le bas, au centre de la boîte de 150 millimètres. Alignez soigneusement la boîte de 100 millimètres sur le gabarit marqué.

Faites tourner doucement la boîte de 100 millimètres dans le sens horaire et antihoraire plusieurs fois pour assurer une bonne adhérence à la boîte de 150 millimètres. Une fois que le chlorure de méthylène est sec, retournez les boîtes de Petri nouvellement assemblées et examinez attentivement les points de contact. Si un joint étanche n’est pas complètement formé, injectez 0,5 millilitre de chlorure de méthylène à travers le trou de 3 millimètres à l’aide d’une pipette de transfert.

Prenez le plat et faites-le tourner doucement pour permettre au chlorure de méthylène d’atteindre le bord. Une fois que vous vous êtes assuré qu’un joint étanche s’est formé entre les deux boîtes de Pétri, obturez le trou dans la boîte de 100 millimètres en appliquant un cordon de 3 millimètres de scellant en caoutchouc de silicone. À l’aide d’un outil rotatif équipé d’une tête de coupe plate, découpez la partie supérieure de 3 centimètres d’un tube en polystyrène de culture tissulaire conique de 15 millimètres, en laissant au moins un centimètre de tube sous le bouchon.

Utilisez le côté plat de la tête de coupe pour polir le bord du tube coupé jusqu'à ce qu'il soit lisse et plat. Retirez tous les copeaux de plastique produits par le meulage. À l'aide d'un marqueur, reportez la silhouette du tube conique de 15 millilitres sur le couvercle de la boîte de 150 millimètres, à environ 0,5 centimètre du bord de la boîte.

Percez un trou à l'intérieur du cercle dessiné, en laissant une marge d'environ un à deux millimètres par rapport au bord du cercle. Placez le bout coupé du tube conique au-dessus du trou percé. À l'aide d'une pipette de transfert, appliquez environ un quart de millilitre, soit 250 microlitres de chlorure de méthylène sur les bords coupés du tube conique afin de fixer ce dernier au couvercle de 150 millimètres.

Enfin, fixez le couvercle de 150 millimètres sur la boîte de 150 millimètres en appliquant un filet d'agent d'étanchéité en caoutchouc silicone d'un millimètre d'épaisseur le long du bord intérieur de la boîte de Petri supérieure. Un schéma d'un anneau d'étanchéité assemblé est présenté. Le bleu représente la zone de cellules endothéliales ensemencées.

Les flèches rouges extérieures et intérieures indiquent le mouvement orbital de l'anneau de cisaillement et du milieu à l'intérieur de l'anneau de cisaillement lorsqu'il est placé sur un agitateur orbital. Préparez la stérilisation en pipetant environ 10 millimètres de PBS dans le nouvel anneau de cisaillement, par l'intermédiaire du port du tube conique de 15 millilitres. Agitez doucement pour éliminer tous les débris présents à l'intérieur de l'anneau de cisaillement.

Éliminer le PBS à l’aide d’une pipette Pasteur et d’un aspirateur sous vide. Répéter le lavage au PBS jusqu’à ce que tous les débris soient éliminés. Pour stériliser l’anneau de cisaillement, une combinaison d’un rinçage à l’éthanol à 70 % et d’une irradiation UV sera utilisée.

Dévissez le bouchon ventilé, pipetez environ 10 millilitres d'éthanol à 70 % par le port d'accès et revissez le bouchon. Tournez et retournez plusieurs fois l'anneau d'étanchéité afin de bien rincer l'intérieur de celui-ci. Sous une hotte de culture tissulaire, aspirez l'excès d'éthanol à 70 %.

Avec un flacon pulvérisateur, vaporisez soigneusement le port d'accès et le bouchon avec de l'éthanol à 70 %. Ensuite, placez l'anneau de cisaillement et le bouchon sous rayonnement UV dans la hotte de culture tissulaire jusqu'à complète dessiccation. Une fois l'anneau de cisaillement sec, revissez le bouchon.

Conserver les anneaux de cisaillement stérilisés à température ambiante jusqu'à leur utilisation dans le plaquage de culture cellulaire. Pour préparer une étude de contrainte de cisaillement, plaquez d'abord les cellules endothéliales dans les anneaux de cisaillement stérilisés en suivant le protocole standard de culture cellulaire. Laissez la culture atteindre la confluence avant de commencer les études d'écoulement.

Lorsque les cellules ont atteint la confluence, placer les anneaux de cisaillement expérimentaux sur un agitateur orbital positionné sur l'étagère inférieure de l'incubateur afin de minimiser les contraintes et les vibrations de l'étagère. Placer les anneaux de cisaillement du groupe témoin statique à l'intérieur du même incubateur. Laisser les anneaux de cisaillement sur l'agitateurs pendant la durée souhaitée d'application de la contrainte de cisaillement.

Une fois que les couches cellulaires ont été exposées au cisaillement pendant la durée souhaitée, retirez les anneaux de cisaillement de l'incubateur. Retirez le couvercle de l'anneau de cisaillement et récupérez les cellules et/ou le milieu pour l'analyse finale souhaitée. Notez qu'après ouverture des anneaux de cisaillement, les chercheurs peuvent récolter les cellules et le milieu pour analyse en utilisant plusieurs méthodes.

Des résultats représentatifs de l'aspect de monocouches de cellules endothéliales cérébrales humaines CMEC D3 dans des anneaux à cisaillement, après 48 heures d'exposition périodique à un cisaillement fluide ou à des conditions statiques, montrent que l'alignement de la culture n'est pas toujours parallèle à la direction du flux, indiquée par les flèches. Certaines réponses au cisaillement périodique sont illustrées sur des monocouches de cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes de rat. Après 72 heures de cisaillement fluide périodique dans des anneaux à cisaillement, on observe une réduction significative de la molécule d'adhésion plaquettes-cellules endothéliales par rapport au témoin de chargement bêta-actine.

Une fois maîtrisée, la technique permet de construire plusieurs anneaux de cisaillement en environ trois heures, à condition qu'elle soit correctement réalisée. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de bien aligner soigneusement le plat intérieur avec le plat extérieur, de manière à former un joint étanche entre les deux. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment construire et utiliser des anneaux de cisaillement comme méthode simple pour réaliser des études in vitro de flux périodique de fluide et de contraintes de cisaillement sur des cellules endothéliales. N'oubliez pas que le travail avec le chlorure de méthylène peut présenter des dangers, et que des précautions, telles que de travailler sous une hotte aspirante, doivent toujours être prises lors des étapes qui l'exigent.