Déclenchement Stress cellulaire et la mort Utilisation conventionnelle UV Laser Microscopie confocale

L’objectif global de cette approche d’ablation cellulaire est de stresser ou de tuer sélectivement des cellules individuelles en culture cellulaire ou chez des animaux vivants. Cette méthode permet aux chercheurs d’étudier le devenir d’une seule cellule mourante et la réponse des cellules, telles que la microglie et les astrocytes, au site d’ablation environnant. Le principal avantage de cette technique est le ciblage précis des cellules individuelles, et cela peut être réalisé avec un microscope confocal ordinaire équipé d’un laser de 405 nanomètres.

Nous utilisons le poisson-zèbre comme système modèle pour étudier les maladies neurodégénératives telles que la maladie du motoneurone ou la démence frontotemporale. La visualisation de la mort d’un motoneurone et des conséquences qui en découlent offre une excellente occasion de mieux comprendre les processus dynamiques impliqués dans la maladie. Notre approche pour infliger un stress cellulaire de manière dose-dépendante permet une caractérisation détaillée des interactions cellulaires.

Par exemple, clairance de la microglie après la mort nuéronale. Bien que cette méthode donne un aperçu des mécanismes pathologiques d’un organisme vivant, elle peut également être appliquée de la même manière dans des cellules isolées en culture. Après avoir mis en place des lignées transgéniques mâles et femelles pour l’accouplement selon le protocole textuel, utilisez une passoire à thé en plastique pour collecter les embryons après une ponte réussie en filtrant l’eau du réservoir.

Utilisez ensuite de l’eau d’œuf pour rincer les œufs et transférez-les dans de l’eau d’œuf dans une boîte de Pétri. Examinez les embryons au microscope optique pour déterminer la fécondation. Ensuite, incubez les œufs fécondés à 28 degrés Celsius.

Lorsque les embryons atteignent deux à cinq jours après la fécondation ou le DPF, placez-les sous un microscope à fluorescence et examinez les embryons pour une expression appropriée du fluorophore. Ensuite, séparez le poisson étiqueté de couleurs vives dans un plat frais avec de l’eau d’œuf pour une intégration ultérieure. Pour incorporer le poisson-zèbre dans l’agarose, préparez une solution d’anesthésie en ajoutant quatre grammes par litre de MS 222 goutte à goutte dans une boîte de Pétri contenant de l’eau d’œuf.

Préparez un bouillon d’agarose à bas point de fusion et d’eau d’œuf et aliquotez-le dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Placez une aliquote dans un bloc de chaleur à 38 à 40 degrés Celsius et laissez-la s’équilibrer. Pour des temps d’imagerie de plus de quatre heures, pipetez environ 300 microlitres d’agarose le long du cercle intérieur d’un plat à fond de verre pour préparer un cercle en forme de beignet avec une petite ouverture au centre.

Pour monter le poisson-zèbre dans l’agarose pour la microscopie, après avoir anesthésié le poisson selon le protocole textuel, utilisez une pipette réglable pour prélever une larve et la laisser couler au fond de la pointe. Déposez la larve dans un volume minimal de liquide dans de l’agarose préchauffée. Ensuite, préparez le poisson avec de l’agarose et distribuez-le rapidement dans un plat de 35 millimètres à fond de verre préalablement préparé.

À l’aide d’un microscope de dissection, à l’aide d’un pinceau standard, positionnez l’animal ou plusieurs animaux à l’intérieur de l’agarose sur leurs flancs de manière à ce que le corps et la queue soient plats. Laissez le poisson incrusté reposer pendant 10 à 15 minutes jusqu’à ce que l’agarose soit fermement prise. Ensuite, utilisez environ deux millilitres d’eau d’œuf avec de la tricaïne pour compléter soigneusement la boîte de Pétri de 35 millimètres.

Placez la boîte de Pétri avec une larve incrustée sur la platine du microscope confocal et, à l’aide d’un éclairage en champ clair et d’un grossissement de 40x, concentrez-vous sur la face dorsale de la moelle épinière de l’animal. Passez à un réglage de fluorescence approprié et visualisez la structure d’intérêt pour confirmer que tous les paramètres d’imagerie sont nécessaires pour l’ablation ultérieure. Pour déterminer l’épaisseur de la structure pour l’ablation laser UV, utilisez le lecteur Z pour vérifier le haut et le bas de la structure d’intérêt en effectuant manuellement la mise au point vers le haut et vers le bas.

Enregistrez manuellement le plan Z qui sera ablaté. Par exemple, le centre de la cellule. Pour effectuer une ablation laser, lancez l’assistant FRAP en cliquant sur le menu déroulant en haut du menu du logiciel.

Dans la nouvelle fenêtre, déterminez les paramètres d’image pour l’approche d’ablation en sélectionnant le format, la vitesse de balayage et le calcul de la moyenne. Si le plan Z pour l’ablation n’a pas encore été sélectionné, appuyez sur le bouton Live et faites la mise au point sur l’échantillon jusqu’à ce que la structure fluorescente ou le plan Z souhaité à ablater soit net. Une fois les paramètres généraux de l’image définis, accédez à l’étape Bleach pour contrôler les composants d’ablation spécifiques.

Engagez ensuite le laser de 405 nanomètres en l’activant pour la procédure de blanchiment. Ensuite, utilisez l’option Zoom avant pour maximiser l’intensité du blanchiment au retour d’intérêt sélectionné en réduisant le champ de balayage, maximisant ainsi le temps de séjour. Sélectionnez une ou plusieurs zones d’intérêt pour l’ablation à l’aide de l’un des outils de dessin de la fenêtre Acquisition d’images.

Ciblez la butte axonale, par exemple, avec l’outil de dessin circulaire d’environ quatre à huit micromètres. Après avoir établi le retour sur investissement, sélectionnez le bouton Parcours temporel et confirmez le nombre de cycles pendant lesquels les retours sur investissement seront scannés et ablatés. Choisissez les cadres avant et après le blanchiment comme vous le souhaitez pour permettre une vue d’ensemble de l’image juste avant et immédiatement après le processus de blanchiment.

Ces paramètres permettent aux chercheurs de plusieurs niveaux de raffinement. Grâce à l’ajustement de la puissance laser, de la vitesse de balayage, de la moyenne des lignes, de la taille de la région d’intérêt et des répétitions, cette technique offre un haut degré de liberté pour provoquer le stress ou la mort dans les cellules individuelles. Après avoir établi tous les paramètres d’ablation nécessaires, appuyez sur Run Experiment et surveillez l’efficacité de l’ablation.

Pour plus de détails, reportez-vous au protocole texte. Dans cette expérience, l’ablation au laser UV a été réalisée sur des motoneurones exprimant la GFP dans la moelle épinière d’un poisson-zèbre transgénique. L’expression de la GFP pilotée par des promoteurs de motoneurones tels que 3 MINX one, IO one ou MET permet une visualisation à haute résolution des corps cellulaires, des axones principaux et des branches périphériques s’étendant aux muscles.

L’ablation réussie des neurones de la moelle épinière a été obtenue lorsque la fluorescence s’estompe immédiatement après l’ablation et ne reprend jamais. La spécificité de cette approche est confirmée comme le montre ici, où un seul neurone ciblé a été converti à l’aide du photofluro photoconvertible Kaede qui bascule son émission du vert au rouge après une exposition à la lumière UV. Pour cibler des cellules d’intensités différentes, plusieurs couches de réglage fin sont disponibles en ajustant la puissance laser, la vitesse de balayage, la moyenne des lignes, la taille du retour sur investissement à ablater et les répétitions.

Comme le montre ici, les motoneurones avec de longues projections axonales qui ont été ablatés au niveau du soma avec des intensités laser UV plus faibles ont révélé des blebbs caractéristiques qui se sont poursuivis à partir du soma le long de l’axone au fil du temps. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que chaque configuration confocale est unique et que la puissance de sortie laser de chaque instrument est spécifique et peut différer. À la suite de la procédure, des traits caractéristiques de la mort cellulaire apoptotique peuvent être observés dans les neurones ablatés.

Des marqueurs apoptotiques tels que XN 5 ou des changements morphologiques tels que la dégénérescence somale ou le gonflement externe peuvent être détectés de manière reproductible. Des tests supplémentaires peuvent être effectués pour répondre à d’autres questions telles que la façon dont les performances de natation sont affectées par l’ablation d’un ou plusieurs neurones de la moelle épinière. En croisant différentes lignées de poissons-zèbres transgéniques, les chercheurs peuvent étudier la réponse d’autres cellules à la destruction cellulaire induite par laser.

Ces méthodes fournissent une plate-forme expérimentale unique pour comprendre les mécanismes moléculaires précis d’une maladie telle que la MMN in vivo. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation du poisson-zèbre pour la microscopie confocale et de la façon d’effectuer l’ablation au laser UV sur cellule unique.