Génération des variantes d’évasion de neutraliser les anticorps monoclonaux Influenza Virus

L'objectif général de cette méthode est de fournir un protocole opérationnel permettant d'élucider l'épitope d'un anticorps monoclonal neutralisant. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l'immunologie et de la virologie, permettant ainsi de définir les interactions hôte-virus, de développer des thérapeutiques et des outils diagnostiques, ce qui peut contribuer à la conception de vaccins. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle peut être réalisée à l'aide de techniques de base de culture tissulaire et de biologie moléculaire, sans instruments ou équipements particuliers.

La procédure sera démontrée par Mark Bailey, étudiant en médecine et doctorat du laboratoire de Peter Palese. Commencez cette procédure par la caractérisation des anticorps selon leur activité d'inhibition de l'hémagglutination, ou HI, et leur activité de neutralisation, comme décrit dans le protocole écrit. Les anticorps neutralisants possédant une activité HI sont ensuite analysés en préparant d'abord quatre dilutions de l'anticorps d'intérêt à des concentrations croissantes dans du PBS 1×, avec un volume de 100 microlitres par dilution.

Ensuite, préparez un stock de virus à un million d'unités formant des plaques par millilitre dans un volume de 400 microlitres de PBS à une fois. Puis, mélangez 100 microlitres de virus à un million d'unités formant des plaques par millilitre avec 100 microlitres de chaque dilution d'anticorps ou 100 microlitres de PBS à une fois. Incubez les échantillons pendant une heure dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone.

Après un vortexage bref, injecter 200 microlitres de chaque mélange dans des œufs de poulet embryonnés spécifiquement exempts de pathogènes. Ensuite, incuber les œufs à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone pendant 40 à 44 heures. Après l'incubation, sacrifier les œufs embryonnés infectés par le virus en les plaçant à quatre degrés Celsius pendant au moins six heures.

Ensuite, récoltez le liquide allantoïque des œufs comme décrit précédemment. Enfin, confirmez les variants échappant à la neutralisation en réalisant le test d'inhibition de l'hémagglutination (HI) tel que décrit dans le protocole. Pour générer des variants échappant à des anticorps neutralisants dépourvus d'activité HI, le virus doit être repiqué en présence de quantités croissantes d'anticorps.

Plaquez les cellules MDCK dans une plaque de six puits à une densité d'un million de cellules par puits. Incubez les cellules pendant au moins quatre heures dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone. Pendant ce temps, diluez le stock viral à un million d'unités formant des plaques par millilitre.

Préparez une dilution unique d'anticorps à 0,02 milligramme par millilitre dans du MEM 1x contenant de la trypsine traitée au TPCK, dans un volume de 250 microlitres. Utilisez des concentrations d'anticorps plus élevées pour tous les passages suivants. Mélangez 250 microlitres de virus dilué avec 250 microlitres d'anticorps dilué, ou 250 microlitres de MEM 1x servant de témoin sans anticorps.

Incuber le mélange d'anticorps viral pendant 30 minutes dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone. Après l'incubation des cellules, aspirer le milieu à l’aide d’une pipette Pasteur en verre et laver la monocouche de cellules avec un millilitre de PBS 1×. Ajouter 500 microlitres des mélanges dans les puits avant de les incuber dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure.

Après une heure, complétez les puits avec deux millilitres de MEM à une fois, contenant de la trypsine traitée au TPCK. Vérifiez les cellules 48 heures après l'infection pour observer au microscope les signes d'effet cytopathogène, ou CPE, ou réalisez un test d'hémagglutination pour détecter une croissance virale. S’il y a une croissance du CPE dans la culture complétée avec l’anticorps, récoltez le surnageant dans plusieurs cryotubes.

Étiquetez les tubes avec le numéro de passage et conservez-les à moins 80 degrés Celsius. Conservez 100 microlitres du surnageant pour infecter une nouvelle monocouche de MDCK avec deux millilitres de MEM un fois, supplémenté en trypsine TPCK et en anticorps. N'oubliez pas d'inclure un témoin sans anticorps pour chaque passage.

Augmentez la concentration de l'anticorps à chaque passage successif jusqu'à ce que la croissance du virus reste viable, même avec la concentration finale de 0,6 milligramme par millilitre d'anticorps. Congelez plusieurs flacons de surnageant de chaque passage et conservez-les à moins 80 degrés Celsius. Poursuivez par l'isolement et l'analyse des variants échappés, comme décrit dans le protocole textuel.

Des anticorps induits par un vaccin, isolés à partir d'individus vaccinés avec un vaccin candidat contre la grippe A H7N9, ont été utilisés pour générer des variants mutants d'échappement. La cartographie des mutants d'échappement a révélé que bon nombre de ces anticorps reconnaissaient des résidus critiques situés à des emplacements distincts sur l'hémagglutinine (HA) virale. Chaque résidu, indiqué en rouge, représente l'emplacement d'acides aminés critiques nécessaires à une liaison efficace d'un anticorps monoclonal, tandis que la majorité des anticorps positifs au test d'inhibition de l'hémagglutination (HI) présentent des résidus mutants situés près des sites antigéniques précédemment décrits sur la HA de type H7. Les anticorps négatifs au test HI ont généré des mutants d'échappement portant des mutations ponctuelles dans la région de la tige.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être appliquée pour élucider les déterminants structuraux de la protection contre d'autres agents pathogènes. Cette méthode ne se limite pas seulement à la génération de variants d'échappement d'anticorps monoclonaux, mais s'étend également aux composés antiviraux. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'élucider l'épitope de liaison d'anticorps monoclonaux en générant des variants d'échappement in vitro.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se montrer prudent lorsqu'on travaille avec des virus et d'utiliser des équipements de protection individuelle adaptés.