Génération des variantes d’évasion de neutraliser les anticorps monoclonaux Influenza Virus

L’objectif global de cette méthode est de fournir un protocole de travail sur la façon d’élucider l’épitope d’un anticorps monoclonal neutralisant. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’immunologie et de la virologie qui peuvent aider à définir les interactions entre les virus de l’hôte, à développer des traitements et des outils de diagnostic, qui peuvent tous aider à la conception de vaccins. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être réalisée avec des techniques de base de culture tissulaire et de biologie moléculaire sans instruments ou équipements spéciaux.

Mark Bailey, MD, doctorant du laboratoire de Peter Palese, fera la démonstration de la procédure. Commencer cette procédure par la caractérisation des anticorps basée sur l’inhibition de l’hémoagglutination, ou HI, et les activités de neutralisation comme décrit dans le protocole textuel. Les anticorps neutralisants qui ont une activité HI sont analysés plus en détail en préparant d’abord quatre dilutions de l’anticorps d’intérêt en augmentant les concentrations en une fois PBS dans un volume de 100 microlitres par dilution.

Ensuite, préparez un stock de virus d’un million d’unités formant des plaques par millilitre en une fois PBS dans un volume de 400 microlitres. Ensuite, mélangez 100 microlitres d’un million d’unités formant des plaques par millilitre de virus avec 100 microlitres de chaque dilution d’anticorps ou 100 microlitres d’une fois PBS. Incuber les échantillons pendant une heure dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.

Après un bref vortex, injectez 200 microlitres de chaque mélange dans des œufs de poule embryonnés exempts d’agents pathogènes spécifiques. Ensuite, incubez les œufs à 37 degrés Celsius sans dioxyde de carbone pendant 40 à 44 heures. Après l’incubation, sacrifiez les œufs embryonnés infectés par le virus en les plaçant à quatre degrés Celsius pendant au moins six heures.

Ensuite, récoltez le liquide allantoïdien des œufs comme décrit précédemment. Enfin, confirmez les variantes d’échappement en effectuant le test HI comme décrit dans le protocole texte. Pour générer des variants d’échappement contre les anticorps neutralisants qui n’ont pas d’activité HI, le virus doit être passé en présence de quantités croissantes d’anticorps.

Plaquez les cellules MDCK dans une plaque à six puits à une densité d’un million de cellules par puits. Incuber les cellules pendant au moins quatre heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Pendant ce temps, diluez le stock de virus à un million d’unités formant des plaques par millilitre.

Préparez une dilution unique d’anticorps à 0,02 milligramme par millilitre en une fois MEM avec de la trypsine traitée TPCK dans un volume de 250 microlitres. Utilisez des concentrations d’anticorps plus élevées pour tous les passages suivants. Mélangez 250 microlitres de virus dilué avec 250 microlitres d’anticorps dilués, ou 250 microlitres de MEM une fois comme contrôle sans anticorps.

Incuber le mélange d’anticorps antiviraux pendant 30 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Après l’incubation des cellules, aspirer le milieu à l’aide d’une pipette Pasteur en verre et laver la monocouche de cellules avec un millilitre d’une fois PBS. Ajoutez 500 microlitres des mélanges dans les puits avant d’incuber dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure.

Au bout d’une heure, complétez les puits avec deux millilitres de MEM avec de la trypsine traitée par TPCK. Vérifiez les cellules 48 heures après l’infection pour détecter des signes d’effet cytopathique, ou CPE, au microscope, ou effectuez un test d’hémoagglutination pour détecter une croissance virale. S’il y a une EPC de croissance dans la culture complétée par des anticorps, récoltez le surnageant dans plusieurs cryotubes.

Étiquetez les tubes avec le numéro de passage et rangez-les à moins 80 degrés Celsius. Conservez 100 microlitres de surnageant pour infecter une nouvelle monocouche de MDCK avec deux millilitres de MEM une fois complétée par de la trypsine TPCK et des anticorps. N’oubliez pas d’inclure un contrôle sans anticorps pour chaque passage.

Augmentez la concentration de l’anticorps à chaque passage successif jusqu’à ce que la croissance du virus soit encore viable, même avec la concentration finale de 0,6 milligramme par millilitre d’anticorps. Congelez les multiples flacons de surnageant de chaque passage et conservez-les à moins 80 degrés Celsius. Poursuivez vers l’isolement et l’analyse des variants échappés comme détaillé dans le protocole texte.

Des anticorps induits par le vaccin isolés chez des personnes vaccinées avec le vaccin candidat contre la grippe A H7N9 ont été utilisés pour générer des variants mutants d’échappement. La cartographie des mutants d’échappement a révélé que de nombreux anticorps reconnaissaient des résidus critiques à des endroits distincts de l’HA viral. Chaque résidu, indiqué en rouge, représente l’emplacement des acides aminés critiques nécessaires à la liaison efficace d’un anticorps monoclonal, tandis que la majorité des anticorps positifs pour HI ont échappé aux résidus mutants à proximité des sites antigéniques précédemment signalés de l’H7HA. Les anticorps HI-négatifs ont généré des mutants d’échappement avec des mutations ponctuelles dans la région de stock.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être appliquée pour élucider les déterminants structurels de la protection contre d’autres agents pathogènes. Cette technique ne se limite pas seulement à générer des variants d’échappement d’anticorps monoclonaux, mais aussi à lutter contre les composés antiviraux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’élucider l’épitope de liaison des anticorps monoclonaux en générant des variantes d’échappement in vitro.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’être prudent lorsque vous travaillez avec des virus et d’utiliser un équipement de protection individuelle approprié.