Adaptation de la microélectrode Array technologie pour l’étude de la neurotoxicité induite par l’anesthésie dans le cerveau Intact Porcinet

L’objectif global de cette procédure expérimentale est d’utiliser une nouvelle application de la technologie des réseaux de microélectrodes à base d’enzymes pour mesurer les neurotransmetteurs chez les porcelets nouveau-nés. Dans cet exemple, l’activité in vivo du glutamate est examinée pour étudier la neurotoxicité induite par l’anesthésie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut mesurer l’activité des neurotransmetteurs in vivo avec une résolution spatiale et temporelle exceptionnelle dans un modèle animal cliniquement pertinent de neurotoxicité induite par l’anesthésie.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des mécanismes de neurotoxicité induite par l’anesthésie, elle peut également être appliquée à d’autres états pathologiques, tels que les traumatismes cérébraux pédiatriques, l’épilepsie et les accidents vasculaires cérébraux. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car l’utilisation du modèle du porcelet nécessite de l’expérience et de la pratique dans la mise en œuvre. De plus, l’utilisation de réseaux de microélectrodes nécessite un ensemble de compétences spécialisées.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes chirurgicales et de placement des microélectrodes sont difficiles à apprendre, en raison de leur nature délicate. Pour cette expérience, utilisez des porcelets pendant leur période de croissance cérébrale maximale, lorsqu’ils ont trois à cinq jours. Laissez-les s’acclimater pendant au moins 24 heures avant l’expérience.

Du personnel formé doit s’occuper des porcelets. Ils devraient avoir un accès ad lib à de la nourriture, des couvertures et quelques jouets pour les stimuli. Au moins trois heures avant l’anesthésie, retirez le lait d’allaitement de la cage pour vous assurer que l’estomac du porcelet est vide.

Suivez les directives d’ARRIVE pour éliminer tout facteur de confusion potentiel basé sur le sexe. Plus tard, à un poste d’anesthésie équipé d’un ventilateur pédiatrique et d’appareils de surveillance appropriés, intuber et ventiler mécaniquement le porcelet. Ensuite, administrez l’anesthésie au sévoflurane à 1 MAC pendant 3,5 heures d’anesthésie.

Maintenant, utilisez une pince d’orteil pour confirmer une profondeur d’anesthésie adéquate, puis fixez le porcelet à un cadre stéréotaxique spécifique au porcelet doté d’un rembourrage adéquat. Positionnez les dents du maxillaire sur la barre dentaire. Ensuite, fixez et serrez les deux barres d’oreille pénétrantes avec le porcelet centré sur la ligne médiane.

Insérez les barres auriculaires suffisamment fermement pour entendre les membranes tympaniques éclater. Commencez une dose de charge de rocuronium et une perfusion pour éviter les mouvements pendant que le porcelet est fixé dans le cadre. Il est essentiel que le porcelet reste au chaud et que ses signes vitaux soient surveillés.

Utilisez une lampe chauffante et/ou une couverture pour maintenir une thermie normale. Assurez-vous que la lampe chauffante n’est pas si proche qu’elle brûle. Si la survie des porcelets est souhaitée, prenez des préparations supplémentaires pour maintenir la stérilité du champ opératoire.

Maintenant, procédez à l’implantation du réseau de microélectrodes. Pour commencer, créez une incision médiane de quatre à six centimètres le long du crâne, en faisant attention d’éviter de marquer le crâne avec le scalpel. Une fois l’incision pratiquée, utilisez une rétraction douce et une dissection émoussée pour élever le cuir chevelu du crâne.

Ensuite, frottez doucement le crâne avec un tampon de gaze pour enlever tout tissu conjonctif et exposer les lignes de suture. Déterminez ensuite l’emplacement prévu pour la craniotomie. Si la zone d’intérêt reste obscurcie, réfléchissez davantage le cuir chevelu.

Maintenant, utilisez une perceuse chirurgicale pour créer une fenêtre de craniotomie d’environ 0,25 centimètre carré recouvrant la structure d’intérêt. Veillez à ne pas blesser la dure-mère ou le cerveau sous-jacent. Au besoin, utilisez des outils chirurgicaux fins pour exciser la dure-mère recouvrant le tissu cérébral.

Faites preuve d’une extrême prudence pour éviter d’endommager le cerveau. Cette expérience utilise un réseau de microélectrodes à base d’enzymes précédemment décrit, pré-enrobé de glutamate oxydase et électrolysé avec du mPD. Les réseaux de microélectrodes ont un arbre rigide de 40 millimètres, personnalisé pour une utilisation avec des porcelets.

Fixez le bras métallique au micromanipulateur, puis positionnez le réseau de microélectrodes aussi verticalement que possible au-dessus de Bregma. Ensuite, abaissez soigneusement le réseau aussi bas que possible sans toucher la surface du crâne, en notant les coordonnées du bregma. Utilisez maintenant un atlas de cerveau de porcelet pour déterminer les coordonnées stéréotaxiques exactes de la structure d’intérêt, puis repositionnez la microélectrode en conséquence.

Ensuite, placez l’électrode pseudo-référence sous le cuir chevelu, en assurant le contact avec l’animal. Maintenant, abaissez lentement le réseau de microélectrodes dans le cerveau à une profondeur presque appropriée. Pour les deux derniers millimètres de course, utilisez un micro-entraînement hydraulique pour abaisser doucement le réseau dans la structure d’intérêt avec un minimum de traumatisme tissulaire.

Une fois le réseau de microélectrodes positionné, attendez 30 minutes pour permettre aux électrodes d’atteindre la ligne de base. Ensuite, prenez des mesures pendant environ trois heures. Si le porcelet doit survivre à l’expérience, fermez l’incision après avoir recueilli des données.

Des mesures in vivo en temps réel du glutamate ont été prises dans l’hippocampe de porcelets âgés de trois à quatre jours sous anesthésie au sévoflurane, comme décrit. Les sessions d’enregistrement ont dépassé trois heures. Les mesures d’ampérométrie ont été enregistrées à 4 hertz et converties en concentration à l’aide d’une régression linéaire basée sur les paramètres d’étalonnage.

Pour chaque point temporel, la moyenne des signaux des deux sites sensibles au glutamate a été calculée avant de soustraire le signal sentinelle moyenné, afin d’obtenir un signal de glutamate corrigé. La concentration basale moyenne de glutamate était d’environ 4,6 micromoles et est demeurée relativement stable pendant toute la durée de l’exposition à l’anesthésique. L’activité glutamatergique transitoire a été identifiée en analysant les pics du signal qui n’étaient pas corrélés avec le signal sentinelle et qui avaient un rapport signal/bruit supérieur à trois.

Au total, 116 pics transitoires ont été détectés au cours de la période expérimentale. L’amplitude des pics transitoires résultants a généralement été observée dans la gamme de 1 micromole. Afin de quantifier la durée de chaque transitoire, on a obtenu le temps nécessaire pour que chaque valeur de crête maximale décroît de 80 %, et on a constaté qu’il était d’environ 4 à 5,5 secondes.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures, si elle est exécutée méthodiquement et soigneusement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de minimiser toute lésion tissulaire involontaire qui peut confondre les données expérimentales. Suite à cette procédure, d’autres méthodes, comme la mesure d’autres analytes électrochimiques, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires.