Name: Flux de spectrométrie de masse dimmunoprécipitation sans étiquette pour le profilage de linteraction nucléaire à grande échelle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Découvrez une méthode de spectrométrie de masse sans étiquette pour identifier les interactions protéiques nucléaires à grande échelle. Ce protocole permet de cartographier les partenaires d'interaction protéiques endogènes avec une résolution sous-cellulaire.

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Ce travail a été appuyé par une subvention du Grand Défi à W.M.O. du Linda Crnic Institute for Down Syndrome et par un accord de coopération DARPA 13-34-RTA-FP-007. Nous tenons à remercier Jesse Kurland et Kira Cozzolino pour leur contribution à la lecture et aux commentaires sur le manuscrit.

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<li>Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Dependency+of+Cellular+Protein+Levels+on+mRNA+Abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance.</a> Cell. 165, 535-550 (2016).</li>
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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Le workflow protéomique décrit ici fournit une méthode efficace pour identifier les acteurs de protéines à haute confiance pour une protéine d'intérêt. Cette approche diminue la complexité de l'échantillon par fraction subcellulaire et se concentre sur l'augmentation des partenaires d'interaction d'identification grâce à une préparation robuste de l'échantillon, le nettoyage de l'échantillon hors ligne et un contrôle rigoureux de la qualité du système LC-MS. L'analyse des données en aval décrite ici permet une simple évaluation statistique des protéines identifiées comme copurifiantes avec l'appât. Cependant, en raison d'un grand nombre de variables expérimentales (échelle, lignée cellulaire, choix d'anticorps), chaque expérience nécessite des seuils et des considérations différents en ce qui concerne la visualisation et l'enrichissement des données.
La première considération de conception dans une expérience IP-MS est la sélection d'anticorps qui seront utilisés pour la copurification de la protéine d'intérêt avec ses partenaires en interaction. Bien que la disponibilité d'anticorps commerciaux se soit étendue pour couvrir de plus grandes parties du protéome humain au cours des dernières décennies, il existe encore de nombreuses protéines pour lesquelles les réactifs sont limités. En outre, les anticorps qui ont été validés pour des applications telles que la détection de taches occidentales peuvent être incapables d'enrichissement sélectif de la protéine cible dans une expérience d'immunoprécipitation. Avant de mener une expérience protéomique d'interaction à grande échelle, il est suggéré de compléter une propriété intellectuelle à partir d'un plat de 10 cm confluent à 90 %, ou numéro de cellule équivalent, et de sonder la protéine cible d'intérêt par le ballonnement occidental. Si plus d'un anticorps unique est disponible pour l'immunoprécipitation, il est en outre suggéré de sélectionner plusieurs anticorps reconnaissant les épitopes dans différentes parties de la protéine. La liaison d'un anticorps à une protéine d'appât peut obstruer l'interface de liaison nécessaire pour les partenaires en interaction putative. La sélection d'un épitope secondaire pour la protéine d'appât augmentera la couverture du profil d'interaction identifié par une expérience basée sur la spectrométrie de masse.
Une deuxième considération importante réside dans le choix du contrôle approprié pour distinguer les interactions à haute confiance des interactions à faible confiance ou non spécifiques de celles identifiées comme copurifiantes avec l'appât. Le contrôle le plus strict pour une expérience IP-MS est de compléter l'immunoprécipitation à partir d'une lignée cellulaire CRISPR KO de l'appât. Un tel contrôle permet d'identifier et de filtrer les protéines non spécifiques qui se lient directement à l'anticorps plutôt qu'à la protéine d'appât. Dans les cas où la génération d'une lignée cellulaire CRISPR KO de chaque protéine d'appât n'est pas faisable, un contrôle de perles d'IgG du même isotype de l'anticorps d'appât peut être employé. Dans les expériences utilisant un panel d'anticorps représentant plusieurs espèces, l'utilisation d'un contrôle des perles seulement peut être appropriée, mais augmentera le taux de faux positifs identifiés comme des interacteurs à haute confiance.
La sélection de la lignée cellulaire utilisée dans une expérience IP-MS dépend de plusieurs facteurs clés. L'expression et la localisation des protéines dépendent en grande partie du type cellulaire. Tandis que des estimations d'expression d'ARN peuvent être trouvées pour la plupart des gènes dans beaucoup de lignes fréquemment utilisées de cellules, l'expression de protéine est mal corrélée avec l'expression d'ARN et doit être déterminée expérimentalement25. Les lignées cellulaires dans lesquelles une protéine d'appât est exprimée en très faible nombre de copies devraient être évitées pour contourner les problèmes associés à l'augmentation drastique de l'échelle de culture cellulaire qui peut être nécessaire. Il convient de noter, cependant, que la préparation de l'échantillon peut être optimisée pour la détection de protéines à très faible abondance. La méthode de préparation de l'échantillon assistée par filtre (FASP), bien que robuste, peut entraîner une perte de peptide de plus de 50 % dans un échantillon. La préparation d'échantillons à phase solide (SP3) à un seul pot est une méthode efficace de production d'échantillons pour l'analyse de spectrométrie de masse qui minimise la perte d'échantillons26. La récupération accrue permise par la méthode SP3 de préparation de l'échantillon peut être une alternative utile dans ce flux de travail pour la quantification des protéines qui tombent près de la limite de détection.
Ce flux de travail protéomique a été appliqué à de nombreux appâts nucléaires, y compris les kinases, les ligases d'ubiquitine E3 et les membres d'échafaudages de complexes multisubunit. En supposant une validation appropriée des réactifs d'anticorps, l'exécution réussie de ce flux de travail se traduira par la détection de partenaires d'interaction nucléaire protéique à haute confiance pour une protéine d'intérêt.

Le protéome humain présente une grande diversité structurelle et biochimique grâce à la formation de complexes multisubunit stables et d'interactions protéinées transitoires. En conséquence, l'identification des partenaires d'interaction pour une protéine d'intérêt est généralement exigée dans les investigations pour démêler le mécanisme moléculaire. Les progrès récents dans les protocoles de purification d'affinité et l'avènement de l'instrumentation de spectrométrie de masse à balayage rapide à haute résolution ont permis une cartographie facile des paysages d'interaction protéique dans une seule expérience impartiale.
Les protocoles d'interaction protéique emploient généralement des systèmes d'expression ectopique avec des constructions de fusion d'affinité pour identifier des interactions de protéine sans exiger des anticorps de haute qualité reconnaissant une protéine d'intérêt1,2. Cependant, les méthodes basées sur les étiquettes épitope ont plusieurs inconvénients. Les interactions physiques avec l'épitope peuvent conduire à la détection de protéines copurifiantes non spécifiques3. En outre, la fusion de ces étiquettes d'épitope au terminal N ou C d'une protéine peut bloquer les interactions protéines-protéines indigènes, ou perturber le pliage des protéines pour favoriser les conformations non physiologiques4. En outre, les systèmes d'expression ectopique surexpriment généralement la protéine d'appât aux concentrations supraphysiologiques, ce qui peut entraîner l'identification d'interactions de protéines artifactual, en particulier pour les gènes sensibles à la posologie5. Pour contourner ces problèmes, la protéine d'appât endogène peut être immunoprécipitée avec les protéines de proies qui interagissent, en supposant la disponibilité d'un anticorps de haute qualité qui reconnaît la protéine indigène.
Fourni ici est un flux de travail protéomique d'interaction pour détecter l'interactome nucléaire d'une protéine endogène utilisant la protéine cmGC kinase DYRK1A comme exemple. La perturbation du numéro de copie de DYRK1A, du niveau d'activité, ou de l'expression peut causer la incapacité intellectuelle grave chez l'homme, et la létalité embryonnaire chez les souris6,7,8,9. DYRK1A présente une régulation spatiotemporelle dynamique10, et compartimenté les interactions protéiques11,12, nécessitant des approches capables de détecter des partenaires d'interaction à faible abondance spécifiques à différents compartiments subcellulaires.
Ce protocole utilise la fractionnement cellulaire des cellules HeLa humaines en fractions de cytosol et de nucléopatme, immunoprécipitation, préparation d'échantillon pour la spectrométrie de masse, et un aperçu d'un pipeline bioinformatique pour évaluer la qualité des données et visualiser les résultats, avec des scripts R fournis pour l'analyse et la visualisation (Figure 1). Les progiciels utilisés dans ce flux de travail sont tous disponibles gratuitement en téléchargement ou peuvent être consultés via une interface web. Pour plus d'informations sur les logiciels et les méthodes de calcul, des tutoriels approfondis et des instructions sont disponibles sur les liens fournis.

<table><tbody><tr><td>0,25 % de trypsine, 0,1 % d’EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml de tubes à microcentrifugeuse à faible teneur en eau</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>4-20 % Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>acétone (HPLC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A949SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0,5 ml 30k colonne</td> <td>filtranteMillipore Sigma</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12072</td><td></td></tr><tr><td>benzonase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Chloroacétamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0267</td><td></td></tr><tr><td>Fermeture de tubulure de dialyse</td><td>Caroline Biological Supply Company</td><td>684239</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH anticorps</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-47724</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>887845</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HeLa QC tryptic digest</td><td>Pierce</td><td>88329</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ1692630</td><td></td></tr><tr><td>insuline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>iodoacétamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>KONTES Dounce homogénéisateur 7 ml</td><td>VWR</td><td>KT885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>Grand pilon de dégagement 7ml</td><td>VWR</td><td>KT885301-0007</td><td></td></tr><tr><td>Lysyl endopeptidase C</td><td>VWR</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td> <td>de magnésiumSigma-Aldrich</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>Microcystine</td><td>enzo sciences de la vie</td><td>ALX-350-012-C100</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 Solution de substitution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>p84</td><td>anticorps GeneTex</td><td>GTX70220</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BSA Protein Digest, grade MS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88341</td><td>LCMS QC Colonnes</td></tr> de <tr><td>spin Pierce C18 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89873</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Trypsin Protease, grade MS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90057</td><td>Pour la préparation d’échantillons par spectrométrie de masse</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Protéine A Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-0780-01</td><td></td></tr><tr><td>Protéine G Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Émetteur de silice</td><td>Pico TIP</td><td>FS360-20-10</td><td></td></tr><tr><td>Petit pilon de dégagement 7ml</td><td>VWR</td><td>KT885302-0007</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>Métabisulfite de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31448</td><td></td></tr><tr><td>Orthovanadate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/ Por 8 kDa 24 mm tube de dialyse</td><td>Thomas Scientific</td><td>3787K17</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish 150, Standard</td><td>Sarstedt</td><td>83.3903</td><td>Boîte de culture tissulaire pour cellules adhérentes</td></tr><tr><td>TCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9159</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Thermo Scientific</td><td>PG82080</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Urée</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>Eaux ACQUITY Classe M UPLC</td><td>Eaux Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Class Colonne Phase Inversée 1.7&micro ; m Hybride sphérique (1,7 & micro ; m, 75 et micro ; m x 250 mm)</td><td>Eaux</td><td>186007484</td><td>colonne nanoflow C18</td></tr></tbody></table>

flux de spectrométrie de masse d'immunoprécipitation sans étiquette pour le profilage de l'interaction nucléaire à grande échelle

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

La spectrométrie de masse de purification d'immunoaffinité (IP-MS) est apparue comme méthode quantitative robuste d'identification des interactions protéine-protéine. Cette publication présente un flux de travail protéomique d'interaction complète conçu pour identifier les interactions protéines-protéines à faible abondance du noyau qui pourraient également être appliquées à d'autres compartiments subcellulaires. Ce flux de travail comprend la fractionnement subcellulaire, l'immunoprécipitation, la préparation de l'échantillon, le nettoyage hors ligne, la spectrométrie de masse sans étiquette unique, ainsi que l'analyse de calcul et la visualisation des données en aval. Notre protocole est optimisé pour détecter les interactions compartimentées et à faible abondance qui sont difficiles à identifier à partir de lysates cellulaires entiers (p. ex., interactions des facteurs de transcription dans le noyau) par immunoprécipitation des protéines endogènes compartiments sous-cellulaires fractionnés. Le pipeline de préparation d'échantillons décrit ici fournit des instructions détaillées pour la préparation de l'extrait nucléaire de cellules HeLa, la purification d'immunoaffinité de la protéine endogène d'appât, et l'analyse quantitative de spectrométrie de masse. Nous discutons également des considérations méthodologiques pour effectuer l'immunoprécipitation à grande échelle dans les expériences de profilage d'interaction basées sur la spectrométrie de masse et fournissons des lignes directrices pour évaluer la qualité des données afin de distinguer la véritable protéine positive interactions provenant d'interactions non spécifiques. Cette approche est démontrée ici en étudiant l'interaction nucléaire de la kinase CMGC, DYRK1A, une kinase protéine à faible abondance avec des interactions mal définies dans le noyau.

La majorité de la masse protéique identifiée dans une expérience IP-MS se compose de protéines non spécifiques. Ainsi, l'un des principaux défis d'une expérience IP-MS est l'interprétation des protéines qui sont des interacteurs de confiance par rapport aux interacteurs non spécifiques. Pour démontrer les paramètres cruciaux utilisés dans l'évaluation de la qualité des données, l'étude a analysé les immunoprécipitations triplicate de 5 mg d'extrait nucléaire HeLa en utilisant un contrôle de perle seulement. La première vérification interne pour s'assurer qu'une expérience IP-MS est fiable est de savoir si la protéine d'appât se classe comme l'une des protéines enrichies les plus élevées identifiées par le changement de pli sur le contrôle et la probabilité DE SAINT. Dans ce cas, l'appât DYRK1A classé parmi les trois premières protéines enrichies sur le contrôle (Figure 2A,B)). Dans une étude d'interaction nucléaire de DYRK1A utilisant quatre anticorps indépendants, une coupure de FC-A de la limite de probabilité de 'gt;3.00 et DE SAINT 'gt;0.7 a fourni une coupure rigoureuse pour l'identification des interactors nouveaux et précédemment validés22. Lorsqu'il est appliqué à cette expérience, une séparation claire pourrait être observée entre les acteurs à haute confiance et les protéines copurifiées identifiées comme non spécifiques (Figure 2A,B). L'application d'un seuil d'enrichissement et de probabilité de changement de pli augmente la rigueur en exigeant un enrichissement constamment élevé des ID de protéine à travers des répliques biologiques.
En plus de la notation statistique, le workflow d'analyse de CRAPome cartographie également les interactions précédemment signalées sur les données appât-proie23. Bien que cette cartographie puisse être utile pour le seuil des interactions à haute et à faible confiance, les interactions précédemment signalées peuvent obtenir de mauvais résultats par les probabilités FC-A et SAINT, ce qui peut indiquer que de nombreuses interactions connues d'un appât donné peuvent n'exister que dans des types de cellules, des contextes ou des organites spécifiques. Pour l'exemple du jeu de données DYRK1A, les valeurs IREF interactor FC-A étaient aussi basses que 0,45, ce qui représente un très faible enrichissement sur le contrôle (figure 2C). Pour éviter l'inflation des faux positifs, le seuil statistique doit être effectué d'une manière qui donne la priorité à la rigueur plutôt qu'à la réduction des faux négatifs. Il convient de noter que la détection de ces interactions était indépendante de l'abondance des protéines (Figure 2C). Le numéro de copie absolu calculé de chaque interaction iREF au sein des cellules HeLa n'a montré aucune corrélation avec les niveaux de détection d'un partenaire d'interaction par IP-MS24.
Cytoscape sert d'outil efficace pour visualiser plusieurs couches de données d'interaction19. Dans l'expérience d'immunoprécipitation DYRK1A décrite ici, l'utilisation combinée de FC-A et de SAINT -gt; 0.9 a réduit la liste des interactors de haute confiance à six protéines (Figure 2D). Cependant, lors de l'application d'une coupure FC-A de 3,0 dans l'isolement, huit protéines supplémentaires ont été ajoutées au réseau. Ces interacteurs protéiques supplémentaires ont une connectivité élevée avec les acteurs déjà dans le réseau, ce qui suggère qu'ils sont associés à des complexes similaires ou des rôles fonctionnels. À cette fin, les preuves de la STRING-DB des interactions protéines-protéines ont été intégrées dans ce réseau sous forme de lignes pointilléesbleues 20. Bien que cette expérience à appât unique et triplicate fournisse un échantillon limité du réseau d'interaction DYRK1A, l'utilisation d'appâts, de répliques et d'intégration supplémentaires de grands ensembles de données publiques peut être utilisée pour élargir le réseau d'interactions à haute confiance. Les seuils statistiques seront donc spécifiques à chaque expérience individuelle et devront être évalués en profondeur.
<img alt="Production d’extraits nucléaires ; immunoprécipitation ; spectrométrie de masse; l’analyse des données ; diagramme de recherche." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : Flux de travail représentatif protéomique pour ip-MS subcellulaire. Les cellules sont cultivées dans des flacons de fond ronds de 4 L ou des plats de culture tissulaire de 15 cm et récoltées en même temps pour la fractionnement subcellulaire. Les cellules sont fractionnées en une pastille cytosolique, nucléaire et nucléaire, et les immunoprécipitations sont faites à partir de 1 à 10 mg de lysate nucléaire à l'aide d'un ou plusieurs anticorps reconnaissant le même appât. Le nettoyage de l'échantillon assisté par filtre (FASP) et hors ligne sont effectués avant la spectrométrie de masse à tir unique. Un pipeline de calcul en aval est utilisé pour traiter les données en données d'interaction interprétables. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Analyse de l’interaction protéique DYRK1A ; A, B, C : tracés de données ; D : schéma du réseau d’interaction." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 : Données représentatives pour une expérience IP-MS à un seul appât. (A) Sortie de probabilité FC-A et SAINT du flux de travail d'analyse CRAPome pour une expérience optimale utilisant un seul anticorps pour la kinase DYRK1A (n ' 3). Les contrôles perlés seulement ont été utilisés pour la comparaison. Les lignes solides rouges représentent des seuils fixés à FC-A 'gt; 3.00 et SAINT 'gt; 0.7. (B) Estimations de l'abondance des protéines MaxQuant (iBAQ) de la production par rapport au rapport log2 de l'abondance des protéines dans la propriété intellectuelle DYRK1A à la lutte, colorée par la gamme de valeur p ajustée de l'analyse empirique bayes des intensités sans étiquette. (C) FC-A et nombre estimatif de copies de protéines répertoriées comme protéines en interaction dans la base de données iRef23,24. (D) Visualisation du réseau Cytoscape des interactors DYRK1A. Noeuds bleus - FC-A -gt; 3.00, SAINT -gt; 0.7. Noeuds oranges - FC-A - 3.00. Bords noirs et protéines identifiées comme interacteurs dans l'expérience IPMS. Bord pointillé bleu - interaction SAINT entre la protéine de proie (confiance 'gt; .150). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Mélange d'inhibiteur de la protéase (PI)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Réactif</td>
			<td>Concentration finale</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sodium Metabisulfite</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Benzamidine Benzamidine</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dithiothreitol (TNT)</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fluorure de phénylmethanesulfonyl (PMSF)</td>
			<td>0,25 mm</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Mélange d'inhibiteur de la phosphatase (PhI)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Réactif</td>
			<td>Concentration finale</td>
		</tr>
<tr>
<td>MicrocystinE LR</td>
			<td>1 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sodium Orthovanadate</td>
			<td>0,1 mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fluorure de sodium</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tampons de fractionnement subcellulaires :</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tampon A pH 7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Réactif</td>
			<td>Concentration finale</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (en)</td>
			<td>1,5 mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tampon B pH 7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Réactif</td>
			<td>Concentration finale</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (en)</td>
			<td>1,5 mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>420 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA)</td>
			<td>0,4 mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycérol</td>
			<td>25% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tampon C pH 7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Réactif</td>
			<td>Concentration finale</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (en)</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>100 mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA)</td>
			<td>0,4 mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycérol</td>
			<td>20% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tampons d'immunoprécipitation :</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tampon IP 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Réactif</td>
			<td>Concentration finale</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>150 mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>0,1 mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0,1 % (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycérol</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tampon IP 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Réactif</td>
			<td>Concentration finale</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>500 mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>0,1 mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0,1 % (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycérol</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">SDS Alkylation Buffer pH 8.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Réactif</td>
			<td>Concentration finale</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sds</td>
			<td>4 % (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chloroacétamide</td>
			<td>40 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ptce</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
			<td>100 mm</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">UA pH 8,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Réactif</td>
			<td>Concentration finale</td>
		</tr>
<tr>
<td>Urée</td>
			<td>8 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
			<td>0,1 M</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">- utiliser HPLC grade H2O</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Compositions tampons
Fichiers de codage supplémentaires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/Supplemental_Coding_Files.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Décrit est un workflow protéomique pour identifier des partenaires d'interaction de protéine d'une fraction subcellulaire nucléaire utilisant l'enrichissement d'immunoaffinité d'une protéine donnée d'intérêt et de la spectrométrie de masse sans étiquette. Le flux de travail comprend la fractionnement subcellulaire, l'immunoprécipitation, la préparation de l'échantillon assisté par filtre, le nettoyage hors ligne, la spectrométrie de masse et un pipeline de bioinformatique en aval.

Flux de spectrométrie de masse d'immunoprécipitation sans étiquette pour le profilage de l'interaction nucléaire à grande échelle

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Ce flux de travail protéomique permet l’identification impartiale et la cartographie des interactions protéine-protéine endogène avec la résolution subcellulaire. Cette technique est particulièrement avantageuse lors de l’étude des protéines appâts sensibles au dosage, à faible abondance ou qui ont plusieurs localisations subcellulaires. Cette méthode pourrait être appliquée à la cartographie des interactions protéiques endogènes en supposant qu’il existe un réagencé d’affinité approprié disponible.Ceci est particulièrement important pour bon nombre des milliers de protéines qui ont une fonction inconnue, dont beaucoup ont été liées à la maladie humaine. Cette méthode peut être adaptée à n’importe quelle lignée cellulaire ou tissu adapté à la fractionnement subcellulaire. Toute protéine ayant un reagent d’affinité approprié pourrait être ciblée.Un résultat commun pour des expériences de purification d’affinité n’est souvent aucun résultat. Très bons reagents, la collecte de données QC partout, et la limitation de la manipulation de l’échantillon sont tous très importants. Sachez que vous avez un échantillon.Pour commencer, décongeler les granulés cellulaires préparés pendant 15 minutes dans un volume de granulés 1X de tampon A froid avec des inhibiteurs de la protéase ou des inhibiteurs de la phosphatase. Placez le tube contenant la pastille cellulaire sur un nutator à quatre degrés Celsius pour faciliter la résuspension pendant 30 minutes. Ensuite, placez le tube dans une centrifugeuse à 2000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour pelleter.Décanter le supernatant et resuspendre les cellules avec 5X le volume cellulaire emballé avec tampon A.Incubate sur la glace pendant 20 minutes. Ensuite, pelletez à nouveau à 2000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Décanter le tampon et résuspendre avec 2X tampon original volume cellulaire emballé A avec inhibiteurs de la protéase ou inhibiteurs de la phosphatase.Dounce environ sept fois avec le pilon lâche A.Centrifugeuse le lysate pendant 10 minutes à 2000 fois g et quatre degrés Celsius. Transférer délicatement le supernatant dans un nouveau tube et le congeler avec de l’azote liquide. Conserver le lysate à moins 80 degrés Celsius.Resuspendez la pastille avec un volume de granulés de 0,9 X de tampon B avec des inhibiteurs de la protéase ou des inhibiteurs de la phosphatase et mélangez sur un nutator pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Pour lyse les noyaux, dounce 20 fois avec le pilon de titer B.Mélanger le lysate nucléaire sur un nutator pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius afin qu’il soit homogène. Puis centrifugeuse le lysate nucléaire pendant 30 minutes à 21 000 fois g à quatre degrés Celsius.Pipette sur le supernatant et enregistrer comme un extrait de protéine nucléaire soluble. Pour dialyser l’extrait nucléaire soluble, coupez d’abord une longueur appropriée de tube de dialyse de largeur de 24 millimètres avec une coupure moléculaire de poids de huit kilodalton. Serrez un côté du tube et chargez le nucléoplasme dans le tube.Après le chargement du lysate, serrez l’autre extrémité et plongez dans un récipient en verre propre contenant le tampon C avec des inhibiteurs de protéase. Dialyz pendant trois heures à quatre degrés Celsius. Après cela, transférer le nucléoplasme d’extrait nucléaire dialysé dans un tube et une centrifugeuse à 21 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.Transférer trois aliquots de 20 microlitres de l’extrait nucléaire vers de nouveaux tubes de microcentrifugeuse pour validation de fractionnement par tache occidentale. À l’aide de pointes de pipette qui ont été coupées à la pointe, préparer un mélange de perles protéiques A/G pour chaque réplique en combinant 12,5 microlitres de protéines A Sepharose avec 12,5 microlitres de protéine G Sepharose dans des tubes de microcentrifugeuse. Lavez le mélange de perles protéiques A/G deux fois avec 300 microlitres de tampon IP I.Spin les perles à 1500 fois g à quatre degrés Celsius pendant une minute et décanter le tampon.Ensuite, préparez les perles a/g de protéine d’anticorps. Pour lier l’anticorps aux perles, ajouter au tube 300 microlitres de tampon IP I et 10 microgrammes de l’anticorps désiré. Laissez le mélange perle-anticorps se balancer sur un nutator à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Maintenant aliquot volumes appropriés des lysates nucléaires dans les tubes de microcentrifugeuse à faible rétention pour un milligramme d’entrée de protéines par réplique. Faites tourner le lysate à 16 000 fois g pendant 30 minutes et transférez le supernatant dans un nouveau tube. Ajouter un microlitre de Benzonase à 250 unités par microlitre pour chaque milligramme du lysate nucléaire et de la roche sur un nutator à quatre degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes.Pour préparer les perles pour pré-compensation du lysate, ajouter 12,5 microlitres de chaque protéine A et protéines G perles à 1,5 millilitre tubes à faible rétention. Lavez-vous deux fois avec le tampon de lavage IP I avec des inhibiteurs de protéase. Décanter le tampon et ajouter un milligramme du lysate nucléaire préparé aux perles.Incuber en se berçant sur un nutator pendant une heure à quatre degrés Celsius. Centrifugeuse les lysates pré-effacés à 1500 fois g et quatre degrés Celsius pendant une minute. Ensuite, lavez les perles d’anticorps protéine A ou G deux fois avec le tampon IP I avec des inhibiteurs de la protéase.Après avoir centrifugé à 1500 fois g et quatre degrés Celsius pendant une minute, décanter le tampon. Maintenant, transférez le lysate nucléaire pré-autorisé sur les perles de protéine A ou G d’anticorps. Incuber en se berçant sur un nutator à quatre degrés Celsius pendant quatre heures.Après l’incubation, centrifugeuse à 1500 fois g et quatre degrés Celsius pendant une minute. Transférer le supernatant dans des tubes étiquetés comme le flux à travers pour chaque réplique. Lavez les perles de protéine A ou G d’anticorps quatre fois avec un millilitre de tampon IP II avec des inhibiteurs de protéase.Ensuite, lavez les perles deux fois avec un millilitre de tampon IP I avec des inhibiteurs de protéase. Assurez-vous que tous les tampons sont enlevés après le dernier lavage. Elute protéine sur les perles en couveant avec 20 microlitres de 0,1 glycine molaire au pH 2,75 chacun pendant 30 minutes sur un nutator.Puis tourner à 750 fois g et quatre degrés Celsius pendant une minute et pipette hors du supernatant. Répétez cette incubation avec tampon d’élitution une deuxième fois. Après avoir préparé la pastille protéique, réutilisez-la avec 30 microlitres de tampon d’alkylation SDS.Incuber l’échantillon sur un bloc thermique de 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Laisser refroidir à température ambiante pendant 15 minutes. Ajouter 300 millilitres de solution UA et 30 microlitres de TCEP de 100 millimlaires à chaque échantillon.Chargez la solution sur un filtre centrifuge de 30 K. Après avoir fait tourner le filtre centrifuge à 21 000 fois g à température ambiante pendant 10 minutes, gardez le flux à travers au cas où il y ait un problème avec le filtre. Après avoir lavé le filtre selon le manuscrit, ajouter trois microlitres d’un microgramme par microlitre lyse C résuspendus en 0,1 molaire Tris pH 8,5.Remplissez les filtres jusqu’à la marque de 100 microlitres avec 0,1 molaire Tris pH 8,5. Laissez-le digérer pendant une heure à 37 degrés Celsius tout en basculant sur un nutator. Ensuite, ajoutez un microlitre d’un microgramme par trypsine de qualité MS microliter.Mélanger délicatement et laisser la trypsine couver avec l’échantillon pendant la nuit à 37 degrés Celsius tout en berçant sur un nutator. Le matin, centrifugeuse plusieurs fois à 21 000 g pendant 20 minutes pour éducher les peptides du filtre dans un tube de microcentrifugeuse propre à faible rétention. Après avoir desalcé les peptides à l’aide de colonnes de spin C18, résuspendez les peptides lyophilisés dans sept microlitres de 0,1% TFA en 5% d’acétylonitrile.Sonicate l’échantillon pendant trois minutes pour s’assurer que les peptides ont été résuspendus, puis tourner vers le bas à 14.000 fois g pendant 10 minutes. Chargez 15 à 30 % de l’échantillon sur le système de spectrométrie de masse de chromatographie liquide pour analyse. Dans cette étude, des immunoprécippitations de triplicate ont été analysées de cinq milligrammes d’extrait nucléaire d’HeLa utilisant un contrôle perlé-seulement.L’appât DYRK1A s’est classé parmi les trois principales protéines enrichies par rapport au contrôle qui indique que l’expérience IP-MS effectuée était fiable. Une séparation claire a été montrée entre les interacteurs de confiance élevée et plus de 95% des protéines copurifiées ont été identifiées comme non spécifiques. Par exemple, les partenaires d’interaction DYRK1A ont présenté des valeurs FC-A aussi faibles que 0,45 représentant un enrichissement très faible sur le contrôle.Par conséquent, bon nombre de ces interactions précédemment signalées sont de faux négatifs dans cet ensemble de données en tombant en dessous du seuil FC-A de trois. Le nombre de copies absolues calculées de chaque interaction IREF n’a montré aucune corrélation avec les niveaux de détection d’un partenaire d’interaction par IP-MS. L’utilisation combinée de FC-A supérieure à trois et saint supérieure à 0,9 réduit la liste des interacteurs à haute confiance à six protéines.Toutefois, lors de l’application d’un seuil FC-A de plus de trois dans l’isolement, huit protéines supplémentaires ont été ajoutées au réseau. La partie la plus cruciale de ce protocole est la sélection du réagrément d’anticorps pour l’immunoprécipitation. La validation de la sélectivité par la tache occidentale ou coomassie est recommandée avant d’achever ce flux de travail.Des preuves à l’appui des interactions protéine-protéine peuvent être eues à partir du ballonnement occidental de co-IP des interacteurs identifiés. Les liaisons croisées chimiques protéiques, bien que plus complexes, peuvent révéler des domaines d’interaction d’interacteurs. En utilisant cette méthode, mon groupe de recherche a découvert de nouvelles fonctions pour DYRK1A, une kinase protéique nécessaire au développement du cerveau des mammifères et liée à la neuropathologie de la maladie d’Alzheimer.

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