Exon Skipping dans des myotubes directement reprogrammés obtenus à partir de cellules dérivées de l’urine humaine

Nous avons établi un nouveau protocole pour la reprogrammation directe des cellules humaines dérivées de l’urine en myotubes. Cette modélisation in vitro nous permet d’évaluer le saut d’exon dans les myotubes dérivés du patient présentant la dystrophie musculaire de Duchenne. Nous avons découvert que 3-deazaneplanocin Un hydrochlorure, DZnep, sont inhibiteur de méthyltransferase d’histone pourrait favoriser de manière significative le criblage direct des UDCs dans myotube dans un court laps de temps.

Cette nouvelle modélisation autologue de la maladie basée sur l’UDC pourrait conduire à la médecine de précision d’application pour diverses maladies musculaires. Pour commencer, centrifuger l’échantillon d’urine entier à 400 x g pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, aspirez le surnatant en laissant un millilitre dans le tube.

Resuspendez les granulés individuellement dans le reste d’un millilitre d’urine. Rassemblez-les dans un seul tube de 50 millilitres et ajoutez 10 millilitres de tampon de lavage au tube. Centrifuger les échantillons à 200 x g pendant 10 minutes à température ambiante.

Aspirer le supernatant en laissant 0,2 millilitres dans le tube. Resuspendez les granulés cellulaires en 4,5 millilitres de milieu primaire. Ensemencer les cellules dans trois puits de plaque de six puits recouverte de gélatine, 1,5 millilitres de suspension cellulaire par puits.

Culture à 37 degrés Celsius et 5% dioxyde de carbone. Pendant trois jours, ajouter 1,5 millilitres du milieu primaire chaque jour. Le quatrième jour, remplacer le milieu par 1,5 millilitres de milieu de croissance complété comme décrit dans le manuscrit.

Après le quatrième jour, remplacer le milieu de croissance supplémentaire tous les deux jours jusqu’à ce que la culture UDC est 80 à 90%confluent. Retirez ensuite le milieu et lavez les cellules avec du PBS. Divisez les cellules à l’aide de 0,25% trypsine-EDTA.

Ensemencer les cellules à une densité de 3000 à 5000 cellules par centimètre carré sur un nouveau plat de 60 millimètres recouvert de gélatine. Ensemencer les UDCs à 3000 à 5000 cellules par centimètre carré sur un plat de 60 millimètres recouvert de gélatine et placer le plat dans l’incubateur. 24 heures après l’ensemencement, infecter les cellules avec le rétrovirus décongelé à une multiplicité d’infection de 200.

Utilisez un milieu frais avec une concentration de bromure d’hexadiméthrine de 8 microgrammes par millilitre. Incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Pour sélectionner les cellules transduced MYOD1, remplacez le milieu de culture par un milieu de croissance frais contenant un microgramme par millilitre de puromycine.

Continuez à changer le milieu tous les deux jours pendant sept à dix jours. Plaquez les UDCs transduced MYOD1 dans une plaque multi-puits enduite de collagène. Après avoir couver les cellules pendant 24 heures, changer le milieu de croissance en milieu de différenciation décrit dans le manuscrit.

Ensuite, après trois jours, changer le milieu de différenciation en milieu de différenciation frais sans DZNep. Continuez à changer le milieu tous les trois jours. Pour transfecter l’oligonucléotide antisens dans les UDCs myod1-transduced, mélangez le réagent de transfection d’ASO et le milieu de différenciation à une concentration finale d’un à 10 micromolar.

Et utiliser ce mélange pour remplacer le milieu dans les puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% d’humidité. Après 72 heures d’incubation avec ASO, changer le milieu au milieu de différenciation frais sans ASO.

Trois à sept jours après la transfection de l’ASO, retirez le milieu de différenciation. Lavez les UDCs une fois avec PBS et ajoutez le tampon de lyse cellulaire. Récoltez l’ARN total à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN.

Mesurer la concentration d’ARN à l’l’insurgomètre. Tel que décrit dans le manuscrit, combinez les réacoleurs pour un RT-PCR en une étape dans des tubes PCR. Placez les tubes PCR dans le thermocycleur et exécutez le thermocycleur.

Effectuez l’électrophoresis de micropuce et calculez l’efficacité de saut d’exon. Les CDI ont été recueillis facilement et non invasivement et ont formé des colonies dans la semaine de la culture primaire. Les UDCs transfectés MYOD1 dans le milieu de différenciation avec DZNep pouvaient fusionner les uns avec les autres et former efficacement des myotubes multinucléés.

RT-PCR a clairement détecté le saut d’exon dans MYOD1-UDCs dérivé des patients présentant la dystrophie musculaire de Duchenne. Sauter l’efficacité dépendait de la dose d’ASO. Le saut d’exon dose-dépendant a également été détecté par la tache occidentale.

Des intensités de dystrophine ont été mesurées avec le microscope fluorescent une semaine après transfection d’ASO. Des signaux fluorescents nettement plus élevés ont été observés chez les CDI MYOD1 traités par ASO que dans le contrôle. Nous pouvons modéliser n’importe quelle maladie musculaire menant à la compréhension de la pathophysiologie de ces maladies.