Surveillance de la dynamique d’interaction protéine-ARN in vivo à haute résolution temporelle à l’aide de χCRAC

Le CRAC cinétique peut être utilisé pour étudier les associations temporelles entre l’ARN et les protéines de liaison à l’ARN sur une échelle de temps sans précédent. Lorsqu’il est combiné avec notre réticulant, le CRAC cinétique est capable de réticuler des cellules vivantes en quelques secondes. Cela réduit les réponses aux dommages causés par les UV et facilite l’étude des réponses aux contraintes à une résolution à l’échelle minuscule.

Kinetic CRAC est un protocole très long qui peut être difficile pour les nouveaux utilisateurs. De plus, travailler avec l’ARN pose ses propres défis. Pour éviter la dégradation de l’ARN, il faut filtrer et stériliser toutes les solutions et s’assurer que les pipettes et la paillasse du laboratoire sont maintenues propres.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car certaines étapes ne sont pas très intuitives. Cela comprend la réticulation UV et la récolte de cellules, ainsi que l’extraction d’ARN réticulés du gel. Pour effectuer la réticulation UV sur les micro-organismes en solution, inoculez 3,5 litres du milieu souhaité avec de la levure à une OD 600 de départ de 0,05, et cultivez la culture pendant la nuit à 30 degrés Celsius avec une agitation continue à 180 tr/min.

Une fois que les cellules atteignent la DO souhaitée, versez 500 millilitres de la culture directement dans le réticulant Vari-X-linker et irradiez-la avec 250 millijoules d’UV de 254 nanomètres. Après la réticulation, utilisez un dispositif de filtration sous vide pour filtrer les cellules. Enroulez la membrane avec les cellules filtrées et placez-la dans un tube conique de 50 millilitres étiqueté T0. Filtrez les cellules restantes sur six filtres différents et déposez les membranes dans trois litres de milieu induisant le stress préchauffé, en les mélangeant vigoureusement avec une pipette pendant 50 secondes. Continuez à réticuler les cellules dans des volumes de 500 millilitres aux points de temps souhaités et stockez les échantillons à moins 80 degrés Celsius.

Pour réticuler les cellules adhérentes, transférez la boîte de culture de quartz avec les cellules dans le plateau spécialisé et irradiez-la avec 300 millijoules d’UV de 254 nanomètres. Placez immédiatement le plat sur de la glace. Retirez le milieu de croissance du plat et ajoutez 10 millilitres de PBS glacé. Récupérez les cellules en les grattant et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres.

Ensuite, granulez les cellules par centrifugation à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir lavé les cellules avec du PBS, retirez le PBS et congelez la pastille de cellule sur de la glace sèche. Conservez l’échantillon à moins 80 degrés Celsius au besoin.

Réglez la centrifugeuse à quatre degrés Celsius et préparez deux rangées de tubes de 1,5 millilitre par échantillon pour l’élution. Faites tourner rapidement les colonnes avec les billes de nickel pour vous débarrasser du volume vide. Placez ensuite les colonnes dans la première rangée de tubes d’élution et remplissez-les de 200 microlitres de tampon d’élution.

Au bout de deux minutes, faites tourner rapidement les colonnes et transférez-les dans la deuxième rangée de tubes. Répétez ensuite l’élution comme indiqué précédemment. Lorsque vous avez terminé, combinez tous les éluats dans un tube de cinq millilitres et ajoutez deux microlitres de 20 milligrammes par millilitre de glycogène.

Ajoutez ensuite 100 microlitres d’acide trichloracétique à l’échantillon et faites-le tourbillonner pendant 30 secondes. Après avoir lavé l’échantillon avec de l’acétone, mettez-le en suspension dans 30 microlitres de tampon de charge de protéines. Ensuite, vérifiez la radioactivité à l’aide du compteur Geiger.

Chauffez l’échantillon pendant 10 minutes à 65 degrés Celsius et chargez-le sur un gel Bis-Tris préfabriqué d’un millimètre à quatre à 12 %. Faites fonctionner le gel pendant 90 minutes à 125 volts dans le tampon MOPS. Lorsque vous avez terminé, enveloppez le gel dans un film alimentaire et fixez-le à l’intérieur d’une cassette étanche légère avec du ruban adhésif.

Après avoir exposé le gel au film autoradiographique, développez le film en coupant le film alimentaire recouvrant le gel, en veillant à ne pas déplacer le gel et à décaler l’image. Placez le film sur le gel et excisez la bande d’intérêt. Mettez la tranche de gel dans un tube de deux millilitres et écrasez-la avec une pointe de pipette P1000.

Ajoutez ensuite le tampon protéinase K et la protéinase K. Incuber l’échantillon à 55 degrés Celsius en secouant vigoureusement. Exécutez l’ADNc sur un gel préfabriqué à 6 % TBE à 100 volts pendant une heure, à l’aide d’une échelle appropriée pour la quantification de fragments d’ADN courts. Lorsque vous avez terminé, placez le gel dans un récipient étanche avec suffisamment de TBE pour le recouvrir et ajoutez une quantité appropriée de colorant SYBR Safe.

Colorez le gel pendant 15 minutes à température ambiante. Remplacez ensuite le tampon contenant SYBR par du TBE frais. Lavez le gel pendant 10 minutes en le secouant doucement.

Égouttez le TBE et placez le gel dans un dossier transparent. Coupez le dossier à une taille appropriée et imagez le gel avec une image quant. Excisez les fragments d’ADN entre 175 et 400 paires de bases et placez le morceau de gel dans un tube de 1,5 millilitre.

Écrasez le gel avec une pointe de pipette P1000 et ajoutez 400 microlitres d’eau. Ensuite, incubez-le pendant une heure à 37 degrés Celsius en le secouant. Congelez l’échantillon sur de la glace sèche pendant 10 minutes.

Répétez ensuite l’incubation à 37 degrés Celsius. Insérez deux filtres en microfibre de verre à l’intérieur d’une colonne de filtre placée dans un tube. Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette P1000 coupée, transférez la suspension de gel TBE dans l’unité de filtration et faites-la tourner à 17 000 G pendant 30 secondes.

Ce protocole a été utilisé pour surveiller les interactions Nrd1-ARN dans des cellules de levure soumises à un environnement pauvre en glucose. Les échantillons ont été réticulés avant le passage à un milieu sans glucose, ainsi qu’une, deux, quatre, huit, 14 et 20 minutes après. Les autoradiographies de l’expérience ont montré un signal intense au poids moléculaire attendu de Nrd1, représentant la protéine liée à de courts ARN radiomarqués qui ne se prêtent pas au séquençage.

Le signal au-dessus de cette bande, qui est la protéine réticulée à des fragments d’ARN plus longs, a été isolé. Pour modifier le protocole cinétique CRAC pour les cellules de mammifères, une étape spéciale a été développée pour permettre l’irradiation UV des boîtes contenant des cellules adhérentes. L’efficacité de cette configuration a été mesurée par réticulation et capture de GFP RBM7 étiqueté de manière stable.

L’agent de réticulation a été capable de récupérer des complexes d’ARN protéiques à partir de cellules de mammifères en utilisant une irradiation UV de 254 nanomètres à des efficacités comparables à celles d’un dispositif d’irradiation UV largement utilisé. Le développement d’une boîte de Pétri en quartz perméable aux UV lors de la réticulation a encore amélioré la récupération des complexes d’ARN protéique. Les données de Nrd1 montrent que la protéine se lie à de nombreux transcrits d’ARN non codants, ce qui indique qu’elle est impliquée dans la dégradation de ces transcrits.

La liaison aux transcrits codant pour HXT6 et HXT7, qui sont tous deux régulés à la hausse pendant la privation de glucose, a également été démontrée. Le CRAC cinétique permet de mesurer les interactions dynamiques entre les ARN protéiques au cours du développement cellulaire, des réponses au stress et de l’assemblage de complexes macromoléculaires, tels que le ribosome ou l’épissage.