Protocole d’immunohistochimie et de distribution in situ de l’ARN au sein de l’embryon précoce de drosophile

En tant qu’organisme avec une courte période gestationnelle, les embryons de Drosophila melanogaster sont des sujets d’étude de premier ordre pour étudier la distribution et la localisation des protéines et de leurs régulateurs au cours du développement. Cependant, en raison de leurs embryons riches en lipides et de leur chorion riche en chitine, leur utilité est limitée par la difficulté de monter des embryons sur des surfaces en verre. Dans ce travail, nous introduisons une méthode pratique qui améliore considérablement l’attachement de l’embryon de drosophile sur des lames et détaillons nos méthodes pour une histochimie, une immunohistochimie et une hybridation in situ réussies.

Avant les étapes indiquées ici, les lames doivent être lavées avec du détergent, puis rincées à l’eau du robinet et à l’eau distillée avant d’être placées dans le four pour sécher. Les lames sèches doivent tremper doucement dans le dichromate de potassium pendant 24 heures avant d’être rincées et séchées à nouveau, puis placées dans de l’éthanol à 95% pendant au moins deux heures. Au cours de cette étape, vous pouvez préparer d’autres lames ou la gélatine d’alun chromée selon nos méthodes.

La gélatine peut ensuite être stockée dans l’eau du bain à 60 degrés avant utilisation. Pour recouvrir les lames, déposez une petite quantité de gélatine sur un bord de la lame. Ensuite, utilisez une autre glissière en verre pour faire glisser lentement et uniformément la gélatine sur la surface de la lame à enduire.

Cela crée une couche mince et uniforme. Avant d’être mis dans une grille ou un appareil de séchage à stocker dans un four pour permettre un séchage complet pendant une autre nuit ou 48 heures. Les embryons sont collectés à l’aide d’une assiette de gélose de jus de raisin, une fois prête, la plaque de gélose de jus de raisin peut ensuite être retirée.

Inonder la plaque de PBS et brosser doucement avec une brosse douce afin d’enlever tous les embryons attachés. Retirer l’embryon contenant du PBS dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre et laisser reposer sur la glace. Une fois que l’embryon est déposé sur la glace, retirez doucement le PBS surnageant.

Veillez à ne pas déranger l’embryon au fond du tube. Ajouter 1 mL d’eau de Javel à 50 % à l’échantillon et agiter doucement pendant deux minutes. Retirez l’eau de Javel par filtration et lavez les embryons dans le PBS trois fois.

Préparer le n-heptane. Une fois prêts, lavez les embryons du papier filtre en n-heptane en agitant doucement le papier filtre dans la solution. Laissez les embryons se déposer au fond de la plaque de n-heptane et collectez ce n-heptane dans un nouveau tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre.

Ajouter un millilitre de méthanol au tube, laisser la solution précipiter puis aspirer le méthanol n-heptane. Lavez l’embryon dans du PBS trois à cinq fois pour éliminer le méthanol résiduel. Retirez ce PBS supplémentaire et ajoutez le fixateur de Bouin et laissez reposer pendant 30 à 60 minutes afin de fixer les embryons.

Retirez le fixateur de Bouin et lavez à nouveau les embryons dans du PBS trois fois. Préparez 1,2% d’agarose dans le PBS et gardez-le au chaud dans un bain-marie à 60 degrés, puis préparez les embryons à l’incorporation en aspirant doucement le PBS supplémentaire dans lequel il a été stocké. Veillez à ne pas déranger les embryons au fond, puis aspirez le bouchon embryonnaire au fond de la solution et placez-le doucement dans un moule de bouchon de bouteille.

Aspirer tout PBS supplémentaire de ce moule avant d’ajouter du gel d’agarose à 1,2%. Préparez une solution de PBS afin de stocker ces bouchons d’agarose. Une fois que l’agarose s’est solidifiée, les fiches individuelles peuvent ensuite être déplacées dans ce PBS pour le stockage.

Nous montrons ici le processus de déshydratation séquentielle. Prévoir 15 minutes pour l’incubation à chaque fois. Ensuite, retirer de l’éthanol à 100% et fixer dans une solution individuelle d’éthanol et de xylène pendant encore 15 minutes.

Une fois retiré de cette solution individuelle, retirer dans le xylène pur pendant une minute. Maintenant, l’échantillon de tissu est prêt à être déplacé dans une solution de paraffine de xylène chauffée en une à une. Laisser reposer pendant 30 minutes avant l’intégration finale dans de la paraffine 100%.

Passez au premier de 100% paraffine et reposez-vous pendant deux heures. Répétez ce processus dans ses deux et trois paraffines. L’échantillon est maintenant prêt à être déplacé dans un moule et le moule rempli de cire pour compléter le processus d’intégration.

Intégration d’embryons de drosophiles. Placer les sections de paraffine préparées d’embryons de drosophiles dans un four à 60 degrés pendant 15 minutes. Placez-les dans une solution à 100% de xylène.

Nous commençons alors la réhydratation. Placez les diapositives dans chacune de ces solutions pendant trois minutes chacune. Une fois que la lame est dans de l’eau distillée, placer dans la solution d’hématoxyline pendant deux minutes.

Une fois terminé, assurez-vous de drainer autant de solution que possible de la lame. Une fois la lame lavée à l’eau distillée, tachez la lame dans l’éosine pendant une minute. Enfin, retirez la lame de l’éosine et lavez-la à l’eau distillée.

Une fois que cette lame est propre, nous commençons maintenant notre processus de déshydratation finale. Enfin être placé dans du 100% xylène pendant cinq minutes. Ce processus est répété dans deux nouvelles solutions de 100% xylène et laisse tomber une petite quantité de gomme neutre le long d’un bord de la lame.

Prenez ce couvercle et positionnez-le doucement sur un bord de la glissière. Déparaffinez d’abord les lames en les plaçant dans du xylène à 100%. Une fois que les lames sont retirées de l’eau distillée, elles doivent être recouvertes d’une solution acide périodique à 1%.

Nous jetons ensuite l’excès de solution et rinçons à l’eau distillée. En plaçant la glissière directement dans une solution préchauffée. Une fois cela terminé, nous rinçons la lame à l’eau distillée, puis teintons la solution avec du chlorure d’or à 0,2% pendant une à deux minutes.

Ensuite, nous fixons le tissu avec du thiosulfate de sodium à 3% pendant trois minutes en utilisant de l’eau distillée. Et puis contre-tache avec de l’hématoxyline. Après contre-teinture, la tache peut être lavée avec l’un ou l’autre tube d’eau distillée comme indiqué ici.

Ensuite, nous passons au processus de déshydratation. Ensuite, mettez les lames directement dans du xylène à 100%, puis appliquez une petite quantité de gomme neutre sur le coin de la lame. Couvrez doucement avec un couvercle.

Commencez à préparer les lames comme précédemment en déparaffinant et en xylène. Et puis dans l’éthanol xylène un à un. Une fois les lames déparaffinisées, nous commençons à réhydrater leurs tissus et enfin dans pbS.

Placez les lames dans du peroxyde d’hydrogène à 0,3% de méthanol pendant 10 minutes. Ensuite, les diapositives sont recouvertes de 20 ml de solution de récupération cible. Les lames peuvent ensuite être placées dans la boîte de coloration.

Placez la boîte à taches dans un cuiseur à vapeur, en vous assurant qu’aucune solution ne s’échappe et que les glissières sont toujours entièrement couvertes. Notez que le couvercle de la boîte à taches ne doit pas être entièrement fermé afin que la vapeur d’eau puisse s’échapper pendant le processus de cuisson à la vapeur. Et puis rincer doucement dans PBS-T trois fois.

Jetez l’excès de solution et répétez le processus, cette fois avec PBS. Ensuite, nous incubons les lames dans un bloc de peroxyde pendant cinq à 10 minutes, puis nous rinçons plusieurs fois à nouveau dans PBS-T, puis dans PBS. Préparez l’anticorps et déposez-le directement sur le tissu.

Ces tissus peuvent ensuite être incubés ou à température ambiante pendant quatre heures. L’anticorps secondaire doit être incubé à température ambiante pendant 90 minutes, ce qui se tache avec 5% DAB pendant deux à 10 minutes. Une fois la couleur appropriée obtenue, rincer à l’eau distillée, puis contre-tacher dans l’hématoxyline.

Après cette coloration à l’hématoxyline, les lames peuvent ensuite être déshydratées séquentiellement. Placez les lames dans du xylène à 100% et laissez tremper pendant trois minutes. Ensuite, déposez de petites quantités de gomme neutre sur un bord de la glissière.

Une fois qu’une gomme a été placée, prenez le couvercle de la glissière et placez-la doucement à partir d’un bord de la glissière. Ajoutez un microgramme d’ADN modèle linéarisé purifié à un flacon de réaction stérile sans RNase. Ajoutez ensuite suffisamment d’eau double distillée stérile traitée au DEPC sans RNase pour obtenir un volume d’échantillon total de 13 microlitres.

Ensuite, centrifugez brièvement et incubez pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Pour les expériences de protection contre la RNase, nous recommandons d’incuber pendant 15 minutes avec deux microlitres de Dnase-1, sans RNase pour supprimer l’ADN modèle. Une fois l’étape d’incubation terminée, arrêtez la réaction en ajoutant deux microlitres d’EDTA 0,2 molaire à un pH de huit.

Avant les étapes montrées ici, les lames ont été déparaffinisées et réhydratées, conformément à notre protocole précédemment démontré. Après réhydratation, incuber les lames dans 0,01 mole par litre de PBS à un pH de 7,4 pendant cinq minutes chacune pour éliminer la solution fixatrice du tissu. Après le rinçage dans pbS, nous rinçons ensuite avec une solution de glycine de 100 millimolaires par litre pendant cinq minutes deux fois pour éliminer les groupes aldéhydes libres du tissu.

Après cette étape, rincez les lames avec PBS pendant cinq minutes. Ensuite, incuber dans du PBS contenant 0,3% de triton X-100 pendant 15 minutes avant le rinçage, puis incuber à nouveau avec un microgramme par microlitre de protéinase K.Ensuite, fixez les lames avec 4% de paraformaldéhyde et de PBS à un pH de 7,2 pendant trois minutes. Ensuite, lavez les lames avant d’incuber avec un tampon triéthanolamine molaire 0,1 pH 8, contenant 0,25% d’anhydride acétique.

Vous pouvez choisir d’incliner la boîte à ce stade pour assurer une couverture complète avec la solution. La boîte est préparée en ajoutant 20% de glycérol ou d’eau DEPC au fond d’une boîte d’hybridation sèche. Ensuite, couvrez les diapositives dans 20 microlitres de solution de pré-hybridation.

L’ADN du sperme du saumon à une concentration de 100 microgrammes par millilitre à chaque lame. Et puis incuber à 42 degrés Celsius pendant quatre heures. Ceci est fait dans une boîte humidifiée pré-préparée pour s’assurer que la solution ne sèche pas pendant ce processus.

Dans la phase post-hybridation, il est très important que la solution d’hybridation soit complètement rincée à partir de vos échantillons. Cela peut être fait dans des rinçages consécutifs de 15 minutes à 37 degrés, en utilisant quatre fois la concentration SSC, deux fois la concentration une fois la concentration, 0,5 fois la concentration et 0,1 fois la concentration SSC solution. Chaque incubation pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius.

Une fois cela fait, lavez avec PBS trois fois pendant cinq minutes chacun avant d’ajouter le tampon de lavage. Le tampon de lavage doit être rincé pendant une minute avant les étapes suivantes Assurez-vous que le tampon de lavage est complètement sec des lames avant d’ajouter la solution suivante. Ajouter 100 millilitres de solution bloquante à chaque lame et incuber la lame pendant 30 minutes.

Il est préférable de le faire dans un environnement sans lumière pour assurer une bonne coloration. Ensuite, incubez à nouveau les lames pendant 30 minutes dans 20 ml de solution d’anticorps. Appliquez la solution d’anticorps directement sur les lames pour une couverture complète de vos tissus.

Une fois l’incubation terminée, appliquez 100 millilitres de tampon de lavage. Incuber pendant 15 minutes dans des conditions sans lumière pour éliminer les conjugués d’anticorps non liés. Retirez le tampon de lavage.

Ensuite, appliquez 20 millilitres de tampon de détection et laissez incuber pendant environ quatre minutes. Après quatre minutes, retirez la mémoire tampon de détection. Séchez les lames pour éviter toute solution supplémentaire et ajoutez 10 millilitres de solution de substrat de couleur fraîchement préparée.

Cette réaction commence en quelques minutes, mais elle est terminée après 16 heures. Permettez donc d’incuber pendant cette période de temps dans un état sans lumière. Une fois que les endroits souhaités où les bandes sont détectées, lavez la lame avec 50 millilitres de tampon TE pour arrêter la réaction.

Et puis complétez notre processus de déshydratation et de montage précédemment montré pour la gomme neutre. Les figures un et deux illustrent la méthode de revêtement de gélatine chrome aluminium pour les sections de paraffine et la méthode d’intégration pour le profil d’expression de FKBP12 et DmFKBP12 dans le développement d’embryons de drosophiles. La figure trois montre la distribution protéique de l’anticorps détecté FKBP12 aux stades syncytiaux du blastoderme cellulaire.

À partir de ces résultats histochimiques, on peut voir que l’expression de FKBP12 est moins polarisée dans le blastoderme syncytial, puis commence à se localiser dans la membrane basale sous l’épithélium du trophectoderme informe le gradient avec plus d’expression trouvée dans les pôles antérieur et postérieur. La figure quatre, qui suit les stades précoces et tardifs de la relation gazeuse de l’embryon de drosophile, montre que la protéine FKBP12 se limite à certains composants architecturaux du tissu embryonnaire primitif. Avec une distribution extracellulaire inférieure à celle observée aux stades gastro-embryonnaires précoces et tardifs.

Fait intéressant, la distribution dynamique des protéines décrite ci-dessus ne s’accompagne pas de changements correspondants dans les niveaux d’IRM de FKBP12 comme le montre la figure cinq. Indiquant que l’expression des protéines est le résultat d’un mécanisme moléculaire post-transcriptionnel encore inconnu. La signalisation du calcium médiée par les récepteurs de la ryanodine est une voie fondamentale dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques des animaux vertébrés et invertébrés.

Les mutations de ce gène sont connues pour causer de nombreuses perturbations physiologiques conduisant à la maladie ou à la mort cardiaque précoce. Cependant, le rôle que joue ce gène dans le développement précoce de la drosophile a été difficile à étudier. En tant que composant de transit de l’embryon, l’embryon riche en lipides et le chorion riche en chitine rendent difficiles les études des protéines et de l’expression embryonnaire au début du développement de la drosophile.

Le revêtement de lames, l’incorporation d’embryons et les techniques immunohistochimiques décrites dans cet article nous ont permis d’étudier en détail la distribution dynamique de la protéine du récepteur de la ryanodine et de l’ARNm. Nous partageons ces techniques et l’espoir qu’elles permettront à d’autres d’étudier d’autres protéines au cours des premiers stades de développement de la drosophile.