Name: Organoïdes intestinaux canins dans un système de soutien perméable à double chambre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Découvrez la culture d'organoides intestinaux canins dans un système à double chambre perméable. Cette méthode améliore la fiabilité des prédictions de perméabilité médicamenteuse pour la recherche biomédicale.

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Nous tenons à exprimer notre gratitude aux employés du Laboratoire de diagnostic vétérinaire de l’Université d’État de l’Iowa, à savoir Haley Lambert, Emily Rahe, Rosalyn Branaman, Victoria Green et Jennifer Groeltz-Thrush, pour le traitement rapide des échantillons. Nous tenons également à remercier Jodi Smith et Bethann Valentine d’avoir fourni du matériel pour les expériences de perméabilité. Nous tenons également à remercier David Diaz-Reganon pour son aide avec la figure 9. À l’exception de la figure 6, toutes les figures ont été créées dans BioRender.com. Les auteurs souhaitent reconnaître le soutien du Faculty Startup, du prix ISU VPR Miller, du prix ISU VPR Miller et du sous-prix NSF SBIR à l’ISU # 1912948.

K. Allenspach est cofondateur de LifEngine Animal Health et 3D Health Solutions. Elle est consultante pour Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics et Mars. J.P. Mochel est co-fondateur de LifEngine Animal Health et 3D Health Solutions et est consultant pour Ceva Animal Health et Ethos Animal Health. Cet article reflète les points de vue des auteurs et ne doit pas être interprété comme représentant l’approbation, le point de vue ou les politiques de la Food and Drug Administration. Les autres auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Les cultures organoïdes intestinales canines dans l’appareil de support perméable sont un concept unique reliant les tests traditionnels de perméabilité aux médicaments40 avec un nouveau modèle canin in vitro 41. Différents types d’organoïdes intestinaux canins peuvent être utilisés et évalués en fonction de l’objectif de l’expérience avec un minimum d’ajustements. Il est recommandé de tester plusieurs concentrations du médicament d’intérêt dans 3 à 4 puits par groupe. Les concentrations peuvent être basées sur la concentration intestinale attendue du médicament. De plus, l’utilisation de recherches antérieures peut aider à déterminer les points temporels appropriés pour la conception de l’étude. Une documentation appropriée de la conception de l’étude doit être faite pour accroître la reproductibilité et aider au dépannage.
Cette technologie présente plusieurs limites en raison de la nouveauté de la méthode42, principalement en raison du manque de normalisation dans la conception expérimentale et l’exécution du protocole dans les laboratoires. Ce manque de normalisation a été reconnu par d’autres groupes43, et les protocoles de monocouche organoïde 3D canine conduiront à la reproductibilité interlaboratoire et introduiront la normalisation dans ce système. Les approches normalisées de l’analyse des données améliorent la reproductibilité et peuvent renforcer les résultats des tests préliminaires de dépistage de drogues à l’aide des organoïdes canins dans le système de soutien perméable dans différents laboratoires. Le modèle organoïde 3D canin manque également d’ensembles de données comparant les valeurs del’application P in vitro des médicaments modèles à leur absorption intestinale in vivo humaine ou canine connue, un peu comme les cellules Caco-2 44,45,46. Une fois ces données générées, ce modèle organoïde canin peut être utilisé pour évaluer la perméabilité intestinale pendant le développement du médicament.
Il est crucial de prendre soin lors de l’ensemencement des organoïdes sur le système de support perméable pour ensemencer une densité suffisamment élevée de cellules dissociées de manière appropriée. Les valeurs TEER du système sont plus fiables et reproductibles lorsqu’elles sont cultivées en monocouches strictes. La culture prolongée des monocouches peut entraîner une augmentation exponentielle des valeurs TEER s’éloignant des valeurs physiologiques de l’intestin. Les sections H &amp; E de ces structures 3D montrent ensuite plusieurs couches de cellules les unes au-dessus des autres avec des structures altérées d’entérocytes plus proches de la membrane.
Après une expansion réussie de la monocouche organoïde intestinale canine, les résultats peuvent être analysés de la même manière que les tests cellulaires 2D traditionnels en calculant le coefficient de perméabilité apparente (Papp) d’un médicament de formule44. La valeur del’application P (voir Eq (2)) décrit le taux de transport à travers la monocouche cellulaire47.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
Le <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq03.jpg" style="margin: auto;"> est la pente initiale de la concentration par rapport à la courbe temporelle (p. ex., nmol/s). A est la zone de l’insert (cm2), et C0 est la concentration initiale du médicament ou du composé dans la chambre du donneur37. La reconnaissance fiable de l’intégrité monocouche est un élément crucial du test de perméabilité nécessitant une normalisation. La microscopie optique et les mesures TEER sont recommandées pour évaluer les organoïdes canins dans un système de support perméable et aider à déterminer le bon moment de l’expérience. De plus, des marqueurs de perméabilité moléculaire nulle (p. ex., FITC-dextran, jaune de Lucifer, PEG-400) peuvent être utilisés pour évaluer fonctionnellement l’intégrité des monocouches organoïdes. Une attention particulière doit être portée si le composé testé est affecté par un transporteur. La P-glycoprotéine (P-gp) est utilisée comme exemple courant de pompe d’efflux. Un rapport d’efflux doit être généré (application P, application BL-AP / P, AP-BL) par rapport à un substrat de sonde P-gp bien connu.
La microscopie optique (simple ou améliorée avec contraste de phase) est une méthode inestimable pour vérifier l’intégrité de la monocouche 2D ou 3D et de l’insert filtrant tout en évaluant une éventuelle prolifération cellulaire. La figure 7 peut servir de guide pour reconnaître les cultures saines de cellules organoïdes intestinales canines. Les valeurs TEER sont une mesure importante de la formation de jonctions intercellulaires et de la différenciation des cultures organoïdes en un épithélium intestinal intact. Les organoïdes intestinaux canins se différencient en entérocytes et en cellules de gobelet (Figure 6). Ces cellules productrices de mucus permettent d’étudier les interactions médicament-mucus, ce qui a été difficile à réaliser en utilisant des cultures cellulaires 2Dtraditionnelles 48. La présence de cellules entéroendocrines a déjà été confirmée dans les organoïdes intestinaux canins par Chandra et al.33.
Une caractérisation plus approfondie des monocouches organoïdes canines dérivées d’organoïdes jéjunaux, iléaux et coliques à l’aide de TEM est fournie. Les images TEM montrent la microarchitecture cellulaire, y compris les jonctions serrées et la formation de microvillosités, illustrant davantage la complexité et l’utilité de ces modèles organoïdes en médecine translationnelle. Sur la base des résultats expérimentaux, les cultures organoïdes sur le support perméable étaient prêtes à être expérimentées entre les jours 11 et 13 après l’ensemencement (figure 9). Les valeurs TEER à ce point temporel variaient entre 1 500 et 2 500Ω,cm 2. La phase de plateau des valeurs TEER dure pendant une période de temps très limitée où l’expérience doit être commencée avant que les valeurs TEER ne commencent à diminuer lentement. Les valeurs TEER peuvent également être un élément crucial de l’affichage de résultats expérimentaux importants, car certains médicaments ou excipients de produits pharmaceutiques peuvent interagir avec la monocouche (par exemple, des jonctions serrées), ce qui peut avoir un impact considérable sur les lectures de valeur TEER. Cela seul peut servir de données pour une expérience.
Les organoïdes intestinaux canins dans un appareil de culture cellulaire à double chambre peuvent être appliqués dans des domaines autres que la perméabilité orale aux médicaments en raison de l’architecture unique de la monocouche cellulaire résultante. Par exemple, ils peuvent être utilisés dans la recherche en microbiologie (p. ex., l’impact de la modification de la flore microbienne gastro-intestinale), les études sur l’absorption virale, les interactions médicamenteuses et les mécanismes de transport des médicaments49. La chambre du donneur est généralement remplie du médicament d’essai ou du composé de votre choix, et les aliquotes de la chambre du récepteur sont prélevées à différents moments. Ces aliquotes peuvent être analysées à l’aide de la chromatographie liquide à haute performance, de la spectrométrie de masse, du dosage immuno-enzymatique ou d’autres techniques pour déterminer la quantité et la vitesse auxquelles le soluté pénètre à travers la monocouche.
Ces études nécessitent une monocouche intacte pour évaluer avec précision la perméabilité au médicament. Cela nécessite généralement des monocouches en croissance supérieures à celles nécessaires pour tenir compte des puits inutilisables. Les monocouches de cellules organoïdes peuvent également être utilisées pour mesurer l’absorption virale du côté apical ou basal d’une monocouche, avec des lectures comprenant des tests d’immunofluorescence utilisant des anticorps pour détecter l’absorption cellulaire du virus. Enfin, plusieurs médicaments (c.-à-d. substrat et inhibiteur) peuvent être appliqués à la chambre donneuse pour identifier les interactions médicamenteuses à base de transporteurs.
Sur la base des observations actuelles, ces méthodes seront non seulement applicables aux organoïdes canins dans les inserts de culture, mais conviendront également à d’autres espèces vétérinaires et systèmes d’organes, avec des modifications mineures nécessaires pour s’adapter au mieux à l’espèce ou au modèle d’organe de choix. Les protocoles pour la croissance organoïde intestinale canine ont dû être ajustés en fonction des propriétés uniques de la culture. Ainsi, le protocole peut être ajusté à une autre espèce mais nécessitera des modifications subtiles du protocole. Les modifications peuvent commencer par des changements à la densité d’ensemencement cellulaire et s’étendre à des changements dans la composition du milieu pour différencier correctement les organoïdes d’intérêt.
La normalisation, la documentation détaillée des procédures expérimentales et la surveillance cohérente des monocouches cellulaires sont des pratiques cruciales nécessaires dans les essais de soutien perméable et ne se limitent pas au système canin. Ces modifications possibles d’espèces ou d’organes sont essentielles pour documenter et rendre compte des progrès futurs dans le domaine. Ce modèle présente plusieurs limites, par exemple ses exigences en matière de coûts, sa variabilité interlaboratoire et ses données limitées sur la capacité de prédire l’absorption intestinale in vivo. Les chiens, dans certains cas, possèdent des transporteurs de médicaments et des enzymes métabolisantes différents de ceux des humains50.
De plus, le système organoïde canin doit être testé sur une variété d’autres appareils à double chambre d’autres fabricants afin de déterminer la pertinence d’un tel modèle (p. ex., la pertinence de différentes compositions de membrane filtrante doit être déterminée). Un autre inconvénient est que la partie du manuscrit consacrée à l’expérience de perméabilité aux médicaments est moins descriptive que les parties précédentes. Ceci est dû à un excès d’informations dans ce domaine. L’objectif de cette partie du manuscrit était de décrire ces méthodes de manière modifiable sans couper les bords des pierres angulaires de ces expériences. Des informations plus détaillées sur les expériences de perméabilité ont été recueillies par Hubatsch et al.37. De plus, les inserts perméables peuvent être utilisés dans les expériences de coculture, de migration cellulaire et de test d’invasion4.
En conclusion, les organoïdes intestinaux canins dans les appareils de culture à double chambre ont le potentiel d’être utilisés dans un large éventail d’applications, y compris les domaines biomédicaux et la médecine translationnelle, pour n’en nommer que quelques-uns. Les protocoles créent plusieurs stratégies pour planifier une expérience et promouvoir la fiabilité des données interlaboratoires pour les modèles organoïdes dans le domaine de la biologie.

Les systèmes de soutien perméables sont généralement utilisés pour déterminer la perméabilité apparente des candidats médicaments thérapeutiques à travers la barrière épithéliale intestinale 1,2. Ils peuvent également être utilisés pour évaluer la sécrétion cellulaire3, la migration cellulaire4 et la toxicité du médicament5. Les tests de perméabilité aux médicaments in vitro par voie orale sont une étape clé du processus de découverte et de développement de médicaments2, les candidats médicaments individuels étant testés au début du cycle de vie de la R&amp;D des médicaments6. Le système de support perméable est un appareil de culture cellulaire à double chambre composé d’un insert avec une membrane semi-poreuse placée dans une plaque multipuit. Ce système permet un accès direct aux côtés apical et basolatéral d’une monocouche cellulaire cultivée dans l’insert7. La monocouche utilisée dans ces systèmes est généralement dérivée de cellules épithéliales gastro-intestinales (p. ex. lignée cellulaire d’adénocarcinome colorectal humain Caco-2)8. Les cultures cellulaires se développent dans un état polarisé imitant la microarchitecture naturelle des cellules épithéliales intestinales, permettant une différenciation cellulaire supplémentaire, une microanatomie similaire et une fonction7. Les détails de l’insert de support perméable se trouvent à la figure 1. L’ensemencement des inserts avec des cultures cellulaires 2D, traditionnellement utilisées pour évaluer la perméabilité intestinale aux médicaments, est relativement abordable et facile à cultiver9. Ces systèmes présentent plusieurs limites majeures, notamment leur capacité limitée à prédire le métabolisme intestinal des candidats médicaments thérapeutiques10,11. Cela est vrai pour tous les mécanismes d’absorption des médicaments, qu’il s’agisse de l’absorption passive par les jonctions serrées entre les cellules épithéliales, de l’absorption transépithéliale active par efflux ou des transporteurs d’absorption (par exemple, la P-glycoprotéine, transporteur de monocarboxylate 1) et des médicaments métabolisés par les entérocytes.
Les chiens partagent un environnement et un régime alimentaire communs avec les humains12. L’anatomie intestinale canine et la composition du microbiome ressemblent beaucoup à celles des humains13, ce qui a été attribué à la domestication et aux régimes alimentaires partagés au cours des 36 000 dernières années14. Malheureusement, ces similitudes peuvent également être des causes / déclencheurs courants du développement de la maladie. Les chiens développent des morbidités chroniques similaires à celles des humains, telles que l’obésité15, la maladie inflammatoire de l’intestin16, l’adénocarcinome colorectal17, la tumeur stromale gastro-intestinale (GIST)18 et diverses autres pathologies associées à leur longévité relative19. En conséquence, les organoïdes canins peuvent être utilisés avec succès pour la recherche translationnelle inverse de ces maladies multifactorielles chroniques dans l’esprit de l’initiative One Health20.
Les cellules Caco-2 sont les lignées cellulaires les plus utilisées pour les tests d’absorption orale de médicaments21. Ces cellules sont actuellement considérées comme le modèle « étalon-or » pour les tests de perméabilité intestinale in vitro 2,22,23. La lignée cellulaire Caco-2 exprime l’efflux et les transporteurs d’absorption trouvés dans le tractus intestinal humain, bien qu’à des niveaux d’expression différents 24,25,26. Les cellules Caco-2 sont également largement utilisées comme modèles pour déterminer si un médicament est un substrat ou un inhibiteur des transporteurs d’efflux intestinal22,27. Bien que les cellules Caco-2 soient d’origine colique, elles imitent une cellule entérocytaire. Malheureusement, les cellules Caco-2 ne représentent qu’un seul type de cellule de la couche épithéliale de l’intestin grêle9, qui ne parvient pas à récapituler avec précision la composition complexe du type de cellules épithéliales intestinales. Par exemple, les cellules de gobelet dédiées à la production de mucus sont absentes des cultures Caco-2, de sorte que les interactions mucus-médicament ne peuvent être évaluées sans coculture avec d’autres lignées cellulaires28. De plus, les cultures de Caco-2 n’expriment pas plusieurs des récepteurs nucléaires importants généralement présents dans l’intestin, tels que le récepteur X du prégnane (PXR), le récepteur X des stéroïdes (SXR) et le récepteur constitutif de l’androstane (CAR)29. Par conséquent, les cultures de Caco-2 ne parviennent pas à modéliser l’induction des transporteurs de médicaments et des enzymes par certains médicaments qui sont inducteurs de ces récepteurs (par exemple, la rifampicine)30.
La technologie organoïde intestinale 3D répond à certaines de ces limitations19. Les organoïdes sont des constructions auto-assemblées dérivées de cellules souches adultes qui peuvent être établies à partir d’échantillons de tissus prélevés à l’aide de techniques micro-invasives20. Des cellules souches pluripotentes d’origine humaine sont utilisées pour les modèles de perméabilité intestinale31,32. Les organoïdes canins offrent une alternative pertinente aux organoïdes humains parce que la recherche sur les cellules souches humaines est limitée par des questions éthiques33. En outre, les organoïdes canins fournissent un système in vitro pour explorer la perméabilité canine aux médicaments, le métabolisme, le transport actif et les interactions médicamenteuses. Pour combler cette lacune technologique, la croissance constante et fiable des organoïdes intestinaux canins dans un système de soutien perméable a été décrite34. Un test de perméabilité avec des organoïdes intestinaux canins peut potentiellement prédire la perméabilité intestinale canine et le métabolisme de petites molécules médicamenteuses par rapport aux tests actuellement utilisés (Caco-2). La confirmation de ces caractéristiques essentielles prête ce nouveau système in vitro à des travaux futurs explorant l’impact potentiel des inducteurs sur le métabolisme intracellulaire et le transport actif.
Les organoïdes canins sont composés de tous les types de cellules généralement présents dans la couche épithéliale de l’intestin. D’un point de vue fonctionnel et microanatomique, ils reproduisent de manière fiable l’environnement de la couche épithéliale de l’intestin canin19,35. En outre, la présence de mucus, de transporteurs de médicaments et d’enzymes spécifiques à la canine et la différenciation cellulaire globale dans les organoïdes intestinaux canins sont comparables à ce qui est observé in vivo chez les chiens34. Ainsi, les organoïdes peuvent être isolés chez des patients vétérinaires malades et utilisés pour modéliser l’effet de divers processus pathologiques (par exemple, inflammation intestinale chronique) sur la perméabilité canine orale aux médicaments19,36. Le système organoïde intestinal canin peut également être utilisé dans d’autres contextes que les expériences de perméabilité aux médicaments. Ces structures 3D peuvent également être isolées chez des patients malades, comme décrit précédemment par Chandra et al. pour les maladies inflammatoires de l’intestin, l’adénocarcinome colorectal et la tumeur stromale gastro-intestinale19.
Le protocole d’ensemencement perméable décrit les méthodes permettant d’établir des cultures organoïdes intestinales canines dans les inserts. Ce premier protocole décrit les méthodes de dissociation des cultures organoïdes canines établies plaquées dans la matrice de la membrane extracellulaire. De plus, le prérevêtement des inserts avec du collagène I et la matrice de la membrane extracellulaire est discuté dans ce protocole. L’intégration d’organoïdes canins dans les inserts de support perméables est également décrite en détail.
Le deuxième protocole est le protocole de maintenance monocouche, qui comprend l’entretien général des organoïdes 3D canins plaqués dans un insert. La fréquence et les volumes des milieux organoïdes utilisés pour rafraîchir la culture, ainsi que les moyens de prévenir les dommages à la culture cellulaire, sont présentés dans ce deuxième protocole, ainsi que des méthodes expérimentales pour évaluer la confluence de la monocouche épithéliale.
Enfin, le protocole expérimental de perméabilité se concentre sur les moyens de déterminer si les organoïdes 3D intestinaux canins dans un test de perméabilité sont prêts pour une utilisation expérimentale et les étapes de vérification nécessaires avant de mener une expérience. Cette section décrit également la mise en place et l’exécution réussie d’une expérience de perméabilité, ainsi que l’incubation et l’échantillonnage de candidats médicaments thérapeutiques dans les chambres de la culture monocouche. L’utilisation de l’isothiocyanate de fluorescéine à faible perméabilité (FITC-dextran) pour surveiller l’intégrité des monocouches est également discutée. Enfin, une méthode d’évaluation in vitro pour valider les résultats après la conclusion d’une expérience est décrite. Les expériences de perméabilité sont un sujet extrêmement vaste et sont très bien résumées par Hubatsch et al.37. Le flux de travail des protocoles est résumé à la figure 2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig01.jpg"> Figure 1 : Organoïdes intestinaux canins sur un système de soutien perméable. L’insert de support perméable est positionné dans un puits d’une plaque de 24 puits. La membrane microporeuse permet l’ensemencement d’organoïdes intestinaux canins dissociés, et ces cellules finiront par former une monocouche organoïde 2D. Cette technologie permet d’accéder à la fois aux côtés AP et BL de la monocouche. Le milieu organoïde est introduit dans les chambres AP et BL du support perméable. L’absorption (AP→BL) et la sécrétion (BL→AP) du candidat médicament sont illustrées, ainsi que deux modes possibles de transport du médicament. Abréviations: AP = apical; BL = basolatéral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig02.jpg"> Figure 2 : Flux de travail des protocoles de support perméable organoïde canin. L’insert de support perméable est prélaqué avec un mélange de la matrice de membrane extracellulaire et de collagène I et incubé pendant 1 h. Au cours du processus d’incubation, la culture organoïde est dissociée. Les cellules organoïdes individuelles sont ensemencées dans l’insert, le milieu dans la chambre basolatérale est ajouté immédiatement après l’ensemencement, tandis que le milieu à la chambre apicale est ajouté 24 heures après la fin du processus d’ensemencement. L’entretien et la surveillance des organoïdes comprennent des changements réguliers de milieu, des mesures de valeur TEER et la microscopie optique pour évaluer l’intégrité de la monocouche. Avant l’expérience, les organoïdes doivent être différenciés en retirant l’inhibiteur de ROCK et GSKiβ du milieu. Les valeurs TEER sont mesurées le jour de l’expérience et la monocouche organoïde est inspectée par microscopie optique pour détecter les dommages aux cellules. Le milieu est ensuite échangé contre un tampon approprié et incubé avant l’expérience. Le test FITC-dextran est utilisé lors d’expériences de perméabilité intestinale39 comme marqueur de l’intégrité monocouche. Les mesures TEER sont prises après l’expérience, et la microscopie optique validera les résultats après 24 h. Abréviations : TEER = résistance électrique transépithéliale ; ROCK = kinase rho-associée; GSKiβ = glycogène synthase kinase bêta; F = fluorescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td><Milieux organoïdes forts></forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inhibiteur de ROCK (Y-27632)</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>SCM 075</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I human</td><td>Sigma</td><td>G9145-.5MG</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>PeproTech</td><td>9094360</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061 substitut de</td><td>glutamine</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR Life Science</td><td>J848-500ML</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin-1 Humain</td><td>PeproTech</td><td>120-38-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Murine EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Noggin Murin</td><td>PeproTech</td><td>250-38-250UG</td><td></td></tr><tr><td>Murine Wnt-3a</td><td>PeproTech</td><td>315-20-10UG</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplément</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-Acétyl-L-cystéine</td><td>Sigma</td><td>A9165-25G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>SB202190 (inhibiteur de P38)</td><td>Sigma</td><td>S7067-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&beta ;)</td><td>Reprocell</td><td>04-0004-base</td><td></td></tr><tr><td>TMS (sulfate de triméthoprime)</td><td>Sigma</td><td>T7883-5G</td><td></td></tr><tr><td><réactifs>forts</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique, Glacial</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>alpha-D(+)-Glucose, 99+ %, anhydre</td><td>Acros Organics</td><td>170080010</td><td></td></tr><tr><td>Solution de récupération cellulaire</td><td>Corning</td><td></td><td></td>354253</tr><tr><td>Collagène I, Queue de Rat 3 mg/mL</td><td>Gibco</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CM-Dextran</td><td>Millipore Sigma</td><td>68059-1G</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde (37 %)</td><td>Fisher Chemical</td><td>F79P-4</td><td></td></tr><tr><td>Solution de glutaraldéhyde</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix Pour Culture organoïde</td><td>Corning</td><td>356255</td><td>Matrice membranaire extracellulaire</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde, 97 %</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x (solution saline tamponnée au phosphate)</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>Protéase de type trypsine</td></tr><tr><td><fort>Matériaux et équipements</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube de centrifugation de 15 ml</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>9" Pasteur Pipets</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell 6,5 mm Inserts de membrane en polyester préchargés dans des plaques de culture à 24 puits, taille des pores : 0,4 & micro ; m, Stérile</td><td>Corning</td><td>3470</td><td>Support perméable</td></tr><tr><td>Millicell ERS (sondes)</td><td>Millipore Sigma</td><td>MERSSTX01</td><td></td></tr><tr><td>Millicell ERS-2 Voltohmmètre</td><td>Millipore Sigma</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Panasonic</td><td>Panasonic MCO-170ML-PA</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M Film d’emballage</td><td>Bemis Company Inc</td><td>PM996 / EMD</td><td>Film de laboratoire flexible</td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire 24 puits</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012929</td><td></td></tr></tbody></table>

organoïdes intestinaux canins dans un système de soutien perméable à double chambre

Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System

Le système de support perméable est généralement utilisé en conjonction avec des lignées cellulaires bidimensionnelles (2D) traditionnelles comme outil in vitro pour évaluer la perméabilité orale de nouveaux candidats médicaments thérapeutiques. Cependant, l’utilisation de ces lignées cellulaires conventionnelles présente des limites, telles que l’expression altérée des jonctions serrées, la différenciation cellulaire partielle et l’absence de récepteurs nucléaires clés. Malgré ces lacunes, les modèles Caco-2 et MDCK sont largement acceptés et validés pour la prédiction de la perméabilité orale in vivo chez l’homme.
Les chiens sont un modèle translationnel pertinent pour la recherche biomédicale en raison de leurs similitudes dans l’anatomie gastro-intestinale et la microflore intestinale avec les humains. En conséquence, et à l’appui du développement parallèle de médicaments, l’élaboration d’un outil in vitro efficace et précis pour prédire les caractéristiques de perméabilité in vivo des médicaments chez le chien et l’homme est hautement souhaitable. Un tel outil pourrait être le système organoïde intestinal canin, caractérisé par des structures épithéliales tridimensionnelles (3D) auto-assemblées dérivées de cellules souches adultes.
Le (1) Permeable Support Seeding Protocol décrit les méthodes expérimentales de dissociation et d’ensemencement des organoïdes canins dans les inserts. L’isolement, la culture et la récolte d’organoïdes canins ont déjà été décrits dans un ensemble distinct de protocoles dans ce numéro spécial. Les méthodes d’entretien général de la monocouche organoïde intestinale canine sont discutées en détail dans le (2) Protocole d’entretien monocouche. De plus, ce protocole décrit des méthodes pour évaluer l’intégrité structurelle de la monocouche via des mesures de résistance électrique transépithéliale (TEER) et la microscopie optique. Enfin, le (3) protocole expérimental de perméabilité décrit les tâches précédant directement une expérience, y compris la validation in vitro des résultats expérimentaux.
Dans l’ensemble, le modèle organoïde canin, combiné à une technologie de culture cellulaire à double chambre, surmonte les limites associées aux modèles expérimentaux 2D, améliorant ainsi la fiabilité des prédictions de la perméabilité orale apparente des candidats médicaments thérapeutiques chez le patient canin et humain.

Les procédures opérationnelles normalisées pour la culture des organoïdes canins ont déjà été décrites33, et le Protocole des organoïdes canins a également été discuté en détail dans ce numéro spécial38. Les organoïdes intestinaux canins cultivés sur des supports perméables ont été fixés et incorporés à la paraffine pour examiner la microanatomie de la monocouche et des populations cellulaires. Le processus d’incorporation de la paraffine a déjà été discuté par Gabriel et al.38. Une coloration de routine (hématoxyline et éosine) a été effectuée et la technique de coloration Alcian Blue a été utilisée pour détecter les cellules de gobelet dans la monocouche organoïde canine (voir la figure 7).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig07.jpg"> Figure 7 : Coloration monocouche organoïde intestinale canine. Les organoïdes intestinaux canins d’origine colique dans le support perméable ont été incorporés à la paraffine et colorés avec H &amp; E et AB. Des images représentatives ont été prises en microscopie optique à un grossissement de 40x (A) et 60x (B). La coloration H &amp; E révèle une monocouche épithéliale en colonnes, et les microvillosités dans la partie apicale des cellules peuvent être observées à un grossissement de 60x. La coloration AB dévoile en outre la présence de cellules de gobelet (bleu foncé) dans la monocouche organoïde intestinale canine. Barres d’échelle = 20 μm (A), 50 μm (B). Abréviations : H&amp;E = hématoxyline et éosine ; AB = Bleu Alcian. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
La culture organoïde sur le support perméable doit être cultivée pendant 10 à 14 jours pour être prête pour une expérience de perméabilité. La microscopie optique est utilisée conjointement avec les mesures de la valeur TEER pour confirmer l’état de préparation de la culture organoïde aux tests de perméabilité des candidats médicaments. Des images microscopiques lumineuses représentatives de différentes monocouches organoïdes intestinales canines d’animaux sains et malades sont présentées à la figure 8.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig08.jpg"> Figure 8 : Microscopie monocouche organoïde intestinale canine. Images de monocouches en croissance vues sous microscopie optique. Les monocouches organoïdes dérivées de donneurs sains sont représentées par des cultures entéroïdes jéjunales (10x; 40x) et colonoïdes (20x; 40x). Les monocouches organoïdes des donneurs malades sont représentées par des entéroïdes duodénaux (5x; 10x) et iléaux (5x; 10x) dérivés d’un patient canin diagnostiqué avec PLE. Les deux cultures organoïdes PLE sont des exemples d’isolement cellulaire inapproprié pendant l’ensemencement d’organoïdes, et ces cultures n’ont pas pu être utilisées pour des tests de perméabilité aux médicaments en raison de la présence d’organoïdes 3D. Des exemples d’écarts par rapport à la formation correcte de monocouches, tels que les déchirures monocouches (5x), sont causés par une manipulation imprudente des échantillons biologiques. La culture prolongée d’organoïdes (10x; 20x) est causée par le long entretien des organoïdes sur l’insert lorsque les organoïdes commencent à ressembler à leur structure 3D d’origine. À titre de comparaison, des images de lignées cellulaires 2D traditionnelles sur les supports perméables couramment utilisés pour les études de perméabilité aux médicaments sont présentées (MDCK-10x; 40x et Caco-2-10x; 20x). Abréviations : PLE = entéropathie perdante de protéines; MDCK = rein canin de Madin-Darby. Barres d’échelle = 500 μm (5x), 200 μm (10x), 100 μm (20x), 50 μm (40x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Des monocouches organoïdes ont également été fixées dans 3 % de paraformaldéhyde-3 % de glutaraldéhyde dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). La microscopie électronique à transmission (TEM) a été utilisée pour caractériser l’ultrastructure de la culture organoïde sur les supports perméables. Les structures microanatomiques des microvillosités et des jonctions serrées peuvent être vues à la figure 9.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig09.jpg"> Figure 9 : Images TEM de monocouches organoïdes intestinales canines saines. La TEM a été utilisée pour révéler la microarchitecture cellulaire des monocouches organoïdes jéjunales (A), iléales (B) et coliques (C). La membrane microporeuse de l’insert de support perméable est marquée d’une flèche jaune. La présence de microvillosités (flèche bleue) et de jonctions serrées (flèche rouge) est délimitée dans les images. Abréviation : TEM = Microscopie électronique à transmission. Barres d’échelle = 5 μm (A), 2 μm (B, C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig09large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Les mesures TEER et la microscopie optique doivent être effectuées pour s’assurer que le système est prêt pour les tests de perméabilité. Le test est prêt à l’emploi lorsque TEER atteint un état stable, tandis que la microscopie optique aidera à exclure les dommages ou la prolifération des organoïdes. Un résumé des mesures TEER typiques de cinq groupes constitués d’entéroïdes jéjunaux canins et de colonoïdes est présenté à la figure 6.
Tableau 1 : Composition des milieux organoïdes et FAA. La composition complète de CMGF+, CMGF+ R/G et FAA est résumée dans ce tableau. Abréviations : ROCK = kinase rho-associée ; GSKiβ = glycogène synthase kinase bêta; CMGF + R/G = Milieu complet avec des facteurs de croissance améliorés avec un inhibiteur de ROCK et GSKiβ; CMGF+ = Milieu complet avec des facteurs de croissance mais sans inhibiteur de ROCK ou GSKiβ; FAA = formol-acide acétique-alcool; EGF = facteur de croissance épidermique. Ce tableau est adapté de 38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Table%201%20(8).xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau supplémentaire 1 : Tableau pour la prise de notes sur l’organoïde canin du système de support perméable. Abréviations : TEER = résistance électrique transépithéliale ; ROCK = kinase rho-associée; GSKiβ = glycogène synthase kinase bêta; CMGF + R/G = Milieu complet avec des facteurs de croissance améliorés avec un inhibiteur de ROCK et GSKiβ; CMGF+ = Milieu complet avec des facteurs de croissance mais sans inhibiteur de ROCK ou GSKiβ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Supplementary%20Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>

Nous présentons ici un protocole décrivant la culture d’organoïdes intestinaux canins dans un système de soutien perméable à double chambre. L’ensemencement organoïde dans les supports perméables, l’entretien monocouche et les expériences ultérieures de perméabilité aux médicaments sont décrits.

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