Name: Glycoingénierie rapide des anticorps dans les cellules ovaires du hamster chinois (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Découvrez une méthode de glycoingénierie rapide pour améliorer l'efficacité des anticorps thérapeutiques en utilisant des cellules CHO. Ce protocole permet un criblage à haut débit des enzymes de glycosylation.

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PK remercie le Département de génie chimique de l’Imperial College de Londres pour sa bourse. RD remercie le Conseil de recherches en biotechnologie et en sciences biologiques du Royaume-Uni pour sa bourse d’études. LE MM est financé par le Conseil de recherches en biotechnologie et en sciences biologiques du Royaume-Uni (référence de la subvention : BB/S006206/1). L’IAG remercie l’Irish Research Council (Scholarship No. GOIPG/2017/1049) et CONACyT (Bourse n° 438330).

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les voies de glycosylation impliquent un réseau métabolique complexe d’enzymes et de protéines accessoires. Disséquer la fonction des constituants de la voie est intimidant s’il dépend uniquement des stratégies conventionnelles de génie génétique knockin ou knockin. Une autre approche consiste à dépister au préalable les membres d’une voie à l’aide d’un test transitoire de perte de fonction. À cette fin, deux protocoles rapides ont été combinés, la détection de l’ARNi et du CGE-LIF, afin de créer un moyen plus efficace de caractériser les gènes de glycosylation. La méthode décrite nécessite 5 à 7 jours pour l’achèvement par rapport aux méthodes conventionnelles qui prennent potentiellement plusieurs semaines pour l’achèvement. En outre, les environnements de recherche dotés de capacités d’automatisation pourraient exploiter cette méthode pour dépister plus de gènes candidats que possible avec une manipulation manuelle.
Le succès d’une campagne de glyco-ingénierie transitoire dépend en grande partie de la conception du siRNA. Les conceptions DsiRNA personnalisées doivent suivre les règles décrites précédemment, ou pour plus de facilité, les utilisateurs peuvent opter pour des séquences prédéfinies disponibles dans le commerce. Comme d’autres stratégies de modification génétique, l’ARNi a le potentiel d’avoir des effets hors cible. Par conséquent, les utilisateurs sont encouragés à évaluer le ciblage involontaire des gènes par des méthodes de calcul41. Les choix de conception expérimentale peuvent également aider à limiter les effets hors cible. Kittler et al. ont montré que l’administration multiplexée de siRNA entraînait une réduction des effets hors cible42. Bien que cela semble contre-intuitif, il est suggéré qu’un mélange maître réduit la concentration de chaque construction de siRNA, limitant ainsi la possibilité de silençage génique hors cible. Un autre avantage est que la transfection simultanée des structures de siRNA qui ciblent le même gène augmente la probabilité de succès de l’ARNi. L’utilisation d’un mélange maître assure également la cohérence entre les échantillons et les répliques et accélère le processus de transfection. Après un criblage initial de constructions mixtes de siRNA, une autre expérience peut être menée en utilisant des constructions individuelles pour déterminer l’efficacité de l’ARNi de chaque séquence. Dans cette étude et d’autres, jusqu’à trois siRNA ont été regroupés et livrés aux cellules 43,44,45. Cependant, il peut être souhaitable de dépister plus de trois siRNA simultanément pour cibler efficacement un seul gène ou plusieurs gènes. En effet, une étude a démontré un silence multiplexé médié par le siRNA de jusqu’à six gènes à des niveaux comparables au silence de gènes individuels46. Cependant, d’autres études sont nécessaires pour déterminer le nombre maximal de constructions de siRNA pouvant être utilisées dans un pool sans compromettre l’efficacité du silencieux. La stratégie multiplex a été proposée par Martin et al. pour améliorer le rythme des expériences de criblage de bibliothèque d’ARNi46, et un concept similaire pourrait s’avérer utile pour dépister les gènes de glycosylation.
Le protocole décrit ici sert de preuve de concept avec l’espoir que des expériences ultérieures seront effectuées pour valider d’autres gènes de glycosylation. Les nouveaux gènes d’intérêt peuvent être non caractérisés ou moins populaires que Fut8, et les anticorps primaires pour détecter le silençage génique peuvent être médiocres ou indisponibles. Dans ce scénario, d’autres méthodes telles que la RT-PCR peuvent être utilisées pour quantifier le silençage génique47, mais il convient de noter que la RT-PCR détecte l’ARNm plutôt que les protéines. Lorsque des anticorps pour le transfert western sont disponibles, un problème courant est une mauvaise détection ou la présence de bandes non spécifiques. Des guides de dépannage pour aider les utilisateurs à résoudre les problèmes courants sont disponibles, et ceux-ci ont tendance à inclure une gamme de solutions telles que le titrage primaire des anticorps, le blocage alternatif et les conditions de détection48,49. Dans cette étude, FUT8 est apparu de manière inattendue sous la forme d’une double bande à ~65 et ~70 kDa. Il est possible que la bande ~70 kDa représente fut8 glycosylé. Les preuves de la littérature provenant de lignées cellulaires humaines décrivent la glycosylation liée à l’O à Thr 564 50,51, un site conservé dans le hamster chinois, et les séquences CHO K1 FUT8.
Comme mentionné précédemment, les voies de glycosylation impliquent souvent un ensemble complexe d’enzymes. Le protocole actuel a été développé, optimisé et démontré à l’aide d’une réaction de glycosylation monogénique contrôlée par Fut8. Par conséquent, d’autres études sont nécessaires pour confirmer la robustesse de cette méthode lorsque le gène cible code pour une enzyme avec des niveaux alternatifs de cinétique et d’expression ou une voie régulée par des isoenzymes aux fonctions redondantes.
Dans l’ensemble, la capacité de faire taire rapidement les gènes et de détecter les glycoprofils IgG modifiés est un outil utile dans l’effort visant à obtenir des anticorps glyco-modifiés personnalisés. Les résultats d’études similaires à court terme peuvent être appliqués pour générer des cellules glyco-modifiées stables à utiliser dans des essais à long terme tels que la culture par lots nourris. En dehors du contexte pharmaceutique, cette méthode contribue à l’étude de la biologie des glycanes et met en évidence la fonction importante des glycanes dans le développement, la santé et la maladie.

La glycosylation liée à l’azote est un processus enzymatique par lequel les fractions oligosaccharidiques sont liées de manière covalente aux résidus d’Asn. Contrairement à la synthèse des protéines de novo, la synthèse des glycanes est une réaction non modélisée qui entraîne une glycosylation hétérogène des protéines. La structure, la composition et la distribution des glycanes peuvent affecter la conformation et la fonction des protéines. En effet, la N-glycosylation dans la région du fragment cristallisable (Fc) de l’immunoglobuline G (IgG) régule l’efficacité thérapeutique, l’immunogénicité et la demi-vie de l’anticorps1. En tant que tel, le paradigme de la qualité dès la conception (QbD) pour le développement de produits protéiques biothérapeutiques recombinants identifie naturellement la glycosylation comme un attribut de qualité critique (CQA)2,3. Les cellules de mammifères sont souvent les systèmes d’expression préférés car elles produisent intrinsèquement des modèles de glycosylation semblables à ceux de l’homme plus étroitement que les bactéries, les levures, les insectes ou les cellules végétales. De plus, les cellules de l’ovaire de hamster chinois (CHO) sont sélectionnées par rapport à d’autres lignées cellulaires de mammifères parce qu’elles sont résistantes à l’infection virale humaine, sécrètent des produits à titre élevé et peuvent être cultivées en culture en suspension à des densités cellulaires viables élevées4. En ce qui concerne la formation de glycanes, les cellules de production murine non CHO génèrent des glycanes immunogènes (galactose lié à la α(1-3)-Gal [α(1-3)-Gal] et acide N-glycolylneuraminique [NeuGc]) qui empiètent sur l’utilisation sûre des anticorps monoclonaux (mAbs)5. Ces avantages font des cellules CHO le premier système d’expression, responsable de la production de plus de 80% de nouvelles biothérapies entre 2014 et 20186. Cependant, la glycosylation indépendante du modèle est un mécanisme conservé qui conduit à des biothérapies dérivées de CHO avec un éventail de glycoformes.
Les stratégies de développement biothérapeutique visent à contrôler l’hétérogénéité des cellules CHO par génie génétique. Parmi les exemples de littérature, citons l’élimination des sialidases (Neu1, Neu3) 7, le knockout8 de la GDP-mannose 4,6-déshydratase (GMD) et la surexpression des glycosyltransférases (GnTIII)9. Les progrès de la glyco-ingénierie sont possibles grâce à une combinaison de ressources accessibles au public, comme le génomeCHO 10, et le développement continu d’outils de génie génétique, tels que les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALEN), les nucléases à doigts de zinc (ZFN) et les courtes répétitions palindromiques intercalaires groupées (CRISPR) associées à la protéine 9 (CRISPR-Cas9)11,12,13,14 . Ces outils sont généralement livrés aux cellules CHO sous forme d’ADN plasmidique ou de complexes ribonucléoprotéiques purifiés (RNP). Inversement, l’interférence ARN (ARNi) est une technologie de génie génétique qui, dans sa forme la plus simple, ne nécessite que la livraison d’oligonucléotides d’ARN interférent court purifié (siRNA). Les protéines endogènes transforment le siRNA double brin en brins simples, et la nucléase, le complexe de silençage induit par l’ARN (RISC), forme un complexe avec siRNA pour cliver les séquences d’ARNm cibles 15,16,17. Le silençage génique via cette méthode est transitoire en raison de l’instabilité de l’ARN, mais l’étude ici tire parti de cette fonctionnalité pour faciliter un dépistage rapide.
L’enzyme modèle sélectionnée pour la présente étude, l’α1,6-fucosyltransférase (FUT8), produit des N-glycanes avec α-1,6 L-fucose liée au noyau (Fuc). Cette modification est un déterminant primaire de l’activité de cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC), comme en témoignent les études sur les anticorps commerciaux. En l’absence de fucosylation du noyau, le rituximab (IgG1 anti-CD20) multiplie par 50 l’ADCC et augmente l’ADCC dans le trastuzumab (IgG1 anti-Her2) en améliorantla liaison fcgRIIIa 18,19. La fucosylation de base est donc considérée comme une caractéristique indésirable des mAbs qui justifie des efforts pour inverser ce phénotype. Il existe des exemples de ciblage réussi du gène Fut8 à l’aide de siRNA avec des augmentations concomitantes de l’ADCC 20,21,22, bien que ces exemples fournissent du SiRNA Fut8 codé sur l’ADN plasmidique. De telles expériences génèrent un silençage génique stable car l’ADN plasmidique sert de modèle pour la synthèse du siRNA. Cela permet aux cellules de reconstituer les molécules de siRNA dégradées par les RNases intracellulaires et les phosphatases. Inversement, l’administration de siRNA synthétique exogène ne permet que le silençage transitoire des gènes, car le siRNA ne peut pas être reconstitué en raison de l’absence d’un modèle intracellulaire. Ainsi, les utilisateurs doivent déterminer si les plans expérimentaux sont compatibles avec le siRNA dérivé de plasmides ou synthétique. Par exemple, les études axées sur le pic de production de mAb, généralement le sixième jour de la culture23,24, peuvent opter pour un siRNA synthétique qui peut être livré aux cellules quelques jours avant le pic d’expression. Les avantages d’une approche transitoire utilisant du siRNA synthétique incluent la capacité d’externaliser la production et le fait que plusieurs constructions de siRNA peuvent être générées en une fraction du temps nécessaire pour générer des constructions dans les plasmides. En outre, le siRNA synthétique est efficace, comme en témoignent les exemples de silençage du gène Fut8 qui sont suffisants pour réduire l’expression de la protéine FUT825 et produire des IgG afucosylées avec une liaison accrue à FCgRIIIa et ADCC26.
Le succès de ce protocole de glyco-ingénierie a été déterminé par le degré de glycosylation Fc. La spectrométrie de masse est normalement la méthode de choix pour les analyses glycomiques; cependant, l’électrophorèse sur gel capillaire et la détection de fluorescence induite par laser (CGE-LIF) se prêtent parfaitement à la résolution du glycoprofil des IgG purifiées et présentent l’avantage d’une plus grande rapidité et simplicité. Les protocoles de spectrométrie de masse doivent combiner les méthodes de chromatographie et de dérivatisation appropriées, les sources d’ionisation et les analyseurs de masse 27,28,29. En plus de nécessiter un spécialiste qualifié, les protocoles de spectrométrie de masse sont longs et la diversité des méthodes rend les données difficiles à comparer entre les laboratoires avec des configurations différentes. Dans le contexte des produits biopharmaceutiques, le CGE-LIF est une méthode sensible qui peut fournir suffisamment de détails sur un glycoprofil d’anticorps et est facilement évolutive pour les méthodes à haut débit. Pour les mélanges à faible abondance et très complexes avec des glycoprotéines mal caractérisées, les avantages de la spectrométrie de masse pourraient demeurer. Cependant, l’analyse mAb haute résolution et haute sensibilité offerte par l’analyse N-glycane basée sur CGE-LIF sert de justification pour tester cette méthode. De plus, la préparation et l’analyse des échantillons sont terminées en quelques heures30 seulement. Des études récentes ont montré que le CGE-LIF peut être utilisé pour surveiller les glycanes dérivés du plasma humain31, de la souris32 et des IGG CHO33. Ces études mettent en évidence l’utilisation du CGE-LIF pour l’analyse d’échantillons à haut débit et de petits volumes d’échantillons.
La méthode CGE-LIF présente des limites à prendre en considération. Le coût est un obstacle important à l’utilisation de cet appareil et d’autres pour l’analyse des glycanes. Cependant, ces coûts sont typiques dans le domaine, et CGE-LIF est considéré comme une option rentable34. Les laboratoires disposant de petits budgets peuvent trouver plus pratique de louer des machines ou d’externaliser l’analyse d’échantillons. Une autre considération de toute méthode analytique est la répétabilité. L’évaluation du CGE-LIF a été réalisée à l’aide de 48 répétitions du même échantillon qui ont été analysées à des jours différents. L’écart-type relatif par capillaire a été déterminé pour la répétabilité intrabatch et interbatch. La comparaison intrabatch des réplicats s’est avérée avoir un écart-type relatif de 6,2%, ce qui indique que la performance capillaire n’est pas uniforme. De plus, une comparaison des données interbatch a montré un écart-type relatif de 15,8 %31, ce qui indique que le rendement capillaire change au fil du temps. Les lacunes opérationnelles identifiées peuvent ne pas s’appliquer dans la présente étude, qui utilise différentes machines et réactifs propriétaires. Si les utilisateurs ont l’intention de développer un protocole interne, il serait utile d’envisager l’étude de Ruhaak et al. 31, qui a soigneusement évalué les réactifs pour CGE-LIF. Ainsi, les réactifs pour l’injection d’échantillons (Hi-Di Formamide et DMSO), le marquage des glycanes (NaBH3CN ou 2-picoline borane)31, et d’autres ont été optimisés.
Cette étude présente un protocole de glycoingénierie rapide qui combine la rapidité de l’ARNi direct avec l’analyse glycomique en aval. La méthodologie est illustrée en utilisant le gène Fut8 comme cible pour les raisons décrites ci-dessus.

<table><tbody><tr><td>Logiciel 32 carats</td><td>SCIEX</td><td>contact fabricant</td><td>Logiciel pour l’acquisition et l’analyse des données de glycanes à l’aide du protocole d’analyse Fast Glycan et de la méthode de séparation.</td></tr><tr><td>Acétonitrile, grade HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34851</td><td>Solvant.</td></tr><tr><td>Anticorps anti-FUT8</td><td>AbCam</td><td>ab198741</td><td>Lapin polycloncal à Fut8. Utilisez cet anticorps pour quantifier l’expression de la protéine Fut8 ; remplacer cet anticorps si vous utilisez un siRNA ciblant un gène différent.</td></tr><tr><td>Anticorps anti-GAPDH</td><td>AbCam</td><td>ab181602</td><td>Lapin monoclonal à GAPDH. D’autres gènes d’entretien ménager existent et pourraient être préférés par l’utilisateur.</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre BioDrop</td><td>Biochrom</td><td>80 3006 55</td><td>Instrument utilisé pour quantifier la concentration en protéines.</td></tr><tr><td>Instrument BLItz</td><td>ForteBio</td><td>45 5000</td><td>. Système d’analyse des protéines sans marquage.</td></tr><tr><td>MARQUE Hémocytomètre</td><td>Sigma Alrich</td><td>BR717810</td><td>Dispositif de chambre de comptage</td></tr><tr><td>Cartouche capillaire</td><td>SCIEX</td><td>A55625</td><td>Cartouche capillaire pré-assemblée avec fenêtre (30 cm de longueur totale, 375 &micro ; m Diamètre extérieur (O.D), x 50 & micro ; m Diamètre intérieur (I.D).</td></tr><tr><td>C100HT Analyse des glycanes&mdash ; électrophorèse capillaire</td><td>SCIEX</td><td>contact fabricant Instrument</td><td>d’électrophorèse sur gel capillaire, l’instrument CESI 8000 Plus est maintenant utilisé.</td></tr><tr><td>CD CHO Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10743029</td><td>Remplacez-le par un milieu de culture adapté à la lignée cellulaire de votre choix.</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger, 15 mL</td><td>Greiner Bio</td><td>188261</td><td>Tube stérile en polypropylène.</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger, 50 mL</td><td>Greiner Bio</td><td>227270</td><td>Tube stérile en polypropylène.</td></tr><tr><td>CHO IgG</td><td>MedImmune</td><td>Gift</td><td>Cellules ovariennes de hamster chinois exprimant un anticorps monoclonal IgG (CHO T127). Créé à l’aide du système GS.</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de DulbeccoGibco</td><td></td> <td>14190144</td><td>1x PBS, sans calcium ni magnésium.</td></tr><tr><td>Erlenmeyer avec capuchon d’aération, 125 mL</td><td>Corning</td><td>431143</td><td>Remplacez-le par un récipient de culture adapté à la culture de la lignée cellulaire de votre choix.</td></tr><tr><td>Erlenmeyer avec capuchon d’aération, 250 mL</td><td>Corning</td><td>431144</td><td>Remplacez-le par un récipient de culture adapté à la culture de la lignée cellulaire de votre choix.</td></tr>Kit <tr><td>de marquage et d’analyse rapide des glycanes</td><td>SCIEX</td><td>B94499PTO</td><td>Étiquette les N-glycanes avec APTS, puis utilise un système de nettoyage à base de billes magnétiques pour éliminer l’excès d’APTS.</td></tr><tr><td>Fut8 DsiRNA</td><td>IDT</td><td>Personnalisé</td><td>DsiRNA conçu sur mesure ciblant Fut8.</td></tr><tr><td>Cuvettes Gene Pulser,</td> cuvette <td>Bio-Rad</td><td>1652088</td><td>Electroporation de</td> 0,4 cm.</tr><tr><td>Gène pulser xcell Système eucaryote</td><td>Bio-Rad</td><td>165 2661</td><td>Insturment. Unité principale Xcell avec prolongateur de capacité (CE) Mocdule et ShockPod.</td></tr><tr><td>Membrane Immobilon-FL PVDF&nbsp ;</td><td>Merck-Millipore</td><td>IPFL00010</td><td>Membrane de transfert Immunoblot, faible bruit de fond.</td></tr><tr><td>L-Méthionine sulfoximine (MSX)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5379</td><td>Uniquement nécessaire pour les lignées cellulaires CHO utilisant le système de sélection de la glutamine synthétase (GS).</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10623111</td><td>Lingettes peu pelucheuses, à haute capacité d’absorption et chimiquement inertes.</td></tr><tr><td>M-PER Réactif d’extraction de protéines de mammifères</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78505</td><td>D’autres tampons de lyse tels que RIPA sont également appropriés.</td></tr><tr><td>Méthanol, qualité HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>10365710</td><td>Solvant.</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation, tubes Eppendorf de 1,5 mL</td><td></td><td>616201</td><td>autoclavables.</td></tr><tr><td>Système de cellules d’électrophorèse verticale Mini-PROTEAN Tetra</td><td>Bio-Rad</td><td>1658035FC</td><td>. Capacité de 4 gels, pour des gels coulés à la main de 1,0 mm d’épaisseur, avec module Mini Trans-Blot et alimentation PowerPac HC.</td></tr><tr><td>NC-Slide A8</td><td>ChemoMetec</td><td>942 0003</td><td>Lame à 8 chambres pour utilisation avec NucleoCounter NC 250.</td></tr><tr><td>DsiRNA de contrôle négatif, 5 nmol</td><td>IDT</td><td>51 01 14 04</td><td>DsiRNA non ciblé.</td></tr><tr><td>Tampon duplex sans nucléase</td><td>IDT</td><td>11-01-03-01</td><td>Tampon de reconstitution pour DsiRNA.</td></tr><tr><td>NucleoCounter NC-250</td><td>Chemometec</td><td>contacter le fabricant</td><td>Instrument. Échelle</td></tr><tr><td>Page-Ruler, 10 à 180 kDa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td>Étalons de protéines mixtes bleus, oranges et verts pour SDS PAGE et western blot.</td></tr><tr><td>Tubes PCR</td><td>Greiner Bio 608281</td><td></td><td>Tubes autoclavables pour la préparation d’aliqouts DsiRNA et de glycanes.</td></tr><tr><td>Pointes de filtre de pipette stérilisées&nbsp ; (10, 200, 1000 et micro ; L)</td><td>Gibson</td><td>F171203, F171503 F171703</td><td>Pointes filtrantes stériles pour éviter la contamination par l’ARN.</td></tr><tr><td>PNGase F enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>P0704S</td><td>Clivage enzymatique des glycanes à partir de glycoprotéines.</td></tr><tr><td>Colonnes en polypropylène, 1 mL</td><td>Qiagen</td><td>34924</td><td>Colonnes pour chromatographie par gravité.</td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase Cocktail</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td>Inhibition de la sérine, de la cystéine, des protéases aspartiques et des aminopeptidases</td></tr><tr><td>Protéines-A Perles d’agarose</td><td>Merck-Millipore</td><td>16 125</td><td>Pour la purification des immunoglobulines humaines, de souris et de lapin.</td></tr><tr><td>Biocapteur Protein-A</td><td>ForteBio</td><td>18 5010</td><td>Embouts fonctionnalisés avec Protein A pour une quantification rapide des anticorps.</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>Élimine la contamination par l’ARNA.</td></tr><tr><td>Échantillon de dilutif</td><td>ForteBio</td><td>18 1104</td><td>Activate Protein A tips.</td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques (5, 10, 25 mL)</td><td>Corning</td><td>4487, 4488, 4489</td><td>Utilisé pour les techniques de culture cellulaire stérile.</td></tr><tr><td>Solution de cyanoborohydrure de sodium 1 M dans du THF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296813</td><td>Agent réducteur.</td></tr><tr><td>Solution 18</td><td>ChemoMetec</td><td>910-3018</td><td>Réactif de coloration contenant de l’orange acridine (AO) et du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)</td></tr><tr><td>Filtres à tube de centrifugation Spin-X Corning</td><td></td><td>8161</td><td>&nbsp ; 0,22 et micro ; mpore, membrane d’acétate de cellulose.</td></tr><tr><td>Plaque de suspension avec couvercle, 6 puits</td><td>Greiner Bio</td><td>657 185</td><td>Plaque de culture hydrophobe pour la croissance de cultures en suspension.</td></tr><tr><td>Filtres pour seringues,&nbsp ; 0,22 &mu ; m</td><td>Sartorius</td><td>514 7011</td><td>Acétate de cellulose sans tensioactif (SFCA)</td></tr><tr><td>Seringues avec embout Luer lock, 20 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10569215</td><td>Pour une connexion sûre avec le filtre de seringue.</td></tr><tr><td>Trypan Blue solution</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>Colore les cellules mortes et mourantes.</td></tr><tr><td>Vivaspin 500, 3 000 MWCO</td><td>Sartorius</td><td>VS0191</td><td>Polyethersulfone</td></tr><tr><td>WesternBreeze Chromogenic Kit,</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>WB7105</td><td>Western blot kit de détection de transfert Western, des tampons de blocage alternatifs et des diluants d’anticorps peuvent être fabriqués par l’utilisateur à l’aide de recettes disponibles en ligne.</td></tr></tbody></table>

glycoingénierie rapide des anticorps dans les cellules ovaires du hamster chinois

Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

Les anticorps monoclonaux recombinants lient des cibles moléculaires spécifiques et, par la suite, induisent une réponse immunitaire ou inhibent la liaison d’autres ligands. Cependant, la fonctionnalité et la demi-vie des anticorps monoclonaux peuvent être réduites par le type et la distribution de la glycosylation spécifique à l’hôte. Les tentatives de produire des anticorps supérieurs ont inspiré le développement de cellules productrices génétiquement modifiées qui synthétisent des anticorps glyco-optimisés. La glyco-ingénierie nécessite généralement la génération d’une lignée cellulaire knockin ou knockin stable à l’aide de méthodes telles que la protéine 9 associée à de courtes répétitions palindromiques régulièrement espacées en grappes (CRISPR). Les anticorps monoclonaux produits par les cellules modifiées sont ensuite caractérisés à l’aide de méthodes de spectrométrie de masse pour déterminer si le glycoprofil souhaité a été obtenu. Cette stratégie prend beaucoup de temps, est techniquement difficile et nécessite des spécialistes. Par conséquent, une stratégie alternative qui utilise des protocoles rationalisés pour la glyco-ingénierie génétique et la détection des glycanes peut aider les efforts vers des anticorps optimaux. Dans cette étude de preuve de concept, une cellule d’ovaire de hamster chinois produisant des IgG a servi d’hôte idéal pour optimiser la glyco-ingénierie. Un ARN interférent court ciblant le gène Fut8 a été livré aux cellules de l’ovaire de hamster chinois, et les changements qui en ont résulté dans l’expression de la protéine FUT8 ont été quantifiés. Les résultats indiquent que le knockdown par cette méthode était efficace, conduisant à une réduction d’environ 60% de FUT8. Une analyse complémentaire du glycoprofil d’anticorps a été réalisée à l’aide d’une technique rapide mais très sensible : l’électrophorèse sur gel capillaire et la détection de fluorescence induite par laser. Toutes les expériences de knockdown ont montré une augmentation des glycanes afucosylés; cependant, le plus grand changement réalisé dans cette étude était d’environ 20 %. Ce protocole simplifie les efforts de glyco-ingénierie en exploitant des outils de conception in silico , des réactifs de ciblage de gènes synthétisés commercialement et des tests de quantification rapide qui ne nécessitent pas d’expérience préalable approfondie. En tant que tel, les gains de temps offerts par ce protocole peuvent aider les recherches sur de nouvelles cibles génétiques.

L’analyse par transfert western a montré une réduction de l’expression de la protéine FUT8 dans les cellules transfectées avec un mélange de trois constructions d’ARNds Fut8 . Dans les échantillons témoins transfectés avec de l’ARNdsi non ciblé, FUT8 est apparu comme une double bande à ~65 et 70 kDa. Étant donné que le poids moléculaire prédit de FUT8 est de 66 kDa, une réduction de l’intensité du signal de la bande de poids moléculaire inférieure est révélatrice d’un silençage génique. Pour confirmer et quantifier le silençage génique, le niveau de protéine FUT8 a été normalisé au niveau relatif de la protéine GAPDH. L’analyse par transfert Western a détecté deux bandes pour LE GAPDH à ~37 et 35 kDa. La bande de poids moléculaire plus élevée correspond à la taille prédite des protéines et est donc utilisée dans les calculs de normalisation. Lorsqu’elle est normalisée par rapport aux niveaux de protéines GAPDH, l’expression de la protéine FUT8 a été réduite jusqu’à 60 % (Figure 1).
Conformément à l’observation de l’élimination des gènes à 48 h après la transfection, les échantillons mAb correspondants ont été traités pour analyse par CGE-LIF. Les structures glycanes des cellules knockdown ont montré une diminution de la fucosylation. Cette tendance était plus prononcée dans les structures agalactosylées (G0F) et observée dans une moindre mesure dans les structures galactosylées (G1F, G1F' et G2F). À partir de cet ensemble de données, la fucosylation totale du noyau IgG a diminué à ~75 %, en baisse par rapport à ~95 % de fucosylation du noyau observée pour la condition de contrôle négative (Figure 2). Une plus grande réduction de la fucosylation du noyau était prévue compte tenu de la diminution d’environ 60% des niveaux de protéines FUT8. Après réflexion, il convient de noter que le glycoprofil représente des mAbs glycosylés qui se sont accumulés sur une période de 48 h depuis la transfection, tandis que le silençage génique représente les niveaux de protéines présents au moment de la récolte seulement.
Un examen plus approfondi de cette méthode d’élimination impliquait de faire varier la concentration d’ARNdsi, le temps de récolte et les conditions d’électroporation. Chaque facteur a été examiné individuellement pour déterminer sa pertinence. L’impact des conditions d’impulsion d’électroporation sur la fucosylation du noyau et la viabilité cellulaire est capturé dans les expériences B, C, D et E. Ces résultats démontrent une réduction de deux fois de la fucosylation du noyau due à l’électroporation à l’aide de deux impulsions d’onde carrées (expérience C) par rapport à une seule impulsion d’onde carrée (expérience B), sans différences significatives dans la viabilité cellulaire (tableau 2). La condition d’électroporation e3 (expérience D) a conduit à la viabilité cellulaire la plus faible (~ 90%) et au rendement en IgG à ce moment-là. Cependant, les cellules qui ont survécu à l’événement d’électroporation ont été modérément transfectées, comme en témoigne la diminution d’environ 10% de la fucosylation du noyau (tableau 2). Fait intéressant, l’expérience D a utilisé des conditions d’électroporation qui ont fourni la plus grande réduction de la fucosylation du noyau (14,7%), mais qui étaient manifestement préjudiciables à la viabilité cellulaire (viabilité de 91% à 93%). Cet ensemble limité d’expériences illustre la nécessité de déterminer les paramètres d’électroporation qui permettent une perméabilisation suffisante de la membrane cellulaire sans causer de dommages irrévocables. Il est également intéressant de noter le rôle de la concentration en siRNA et du temps de récolte sur la fucosylation du noyau. Dans l’ensemble, l’augmentation de la concentration de siRNA a une plus grande influence sur la fucosylation du noyau que l’augmentation du temps de récolte (expériences B, F, G par rapport aux expériences A, B, H). Dans de futures expériences, il serait intéressant de titrer les concentrations de siRNA délivrées par la méthode d’électroporation e2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig01.jpg"> Graphique 1. Organigramme expérimental. Les étapes de glyco-ingénierie et d’analyse des échantillons sont représentées avec le temps associé requis pour chaque étape. La conception de SiRNA prend quelques heures, en fonction du nombre de cibles ou de constructions de gènes par cible de gène. La transfection des cellules CHO avec siRNA est terminée en quelques heures et les cellules transformées sont laissées à croître pendant 48 h. Les granulés cellulaires et les surnageants sont récoltés en quelques heures. Les pastilles cellulaires sont lysées et les protéines intracellulaires sont séparées sur un SDS PAGE, puis effacées et sondées avec des anticorps contre le gène cible. Les glycanes sont clivés des anticorps purifiés et analysés par CGE-LIF. Ces tests peuvent nécessiter 1 jour chacun. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig02.jpg"> Graphique 2. Confirmation de l’interférence ARN. Détection par transfert western des niveaux de protéines α-1,6-fucosyltransférase (FUT8) dans des échantillons traités avec Fut8 ou avec de l’ARNdsi témoin non ciblé. Les bandes correspondant à FUT8 sont plus intenses en contrôle que les échantillons de Knockdown Fut8. Le niveau de protéine GAPDH a également été évalué afin de normaliser l’expression du gène cible. Tous les échantillons ont été prélevés à partir de l’expérience G (voir le tableau 2). Reproduit à partir de Kotidis et al. 52. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63872/63872fig3v2.jpg"> Graphique 3. Effet de Fut8 knockdown sur la glycosylation cumulative des IgG à 48 h. Un changement dans la distribution des glycanes est détecté dans les échantillons de knockdown. En particulier, l’abondance relative des principales structures fucosylées du noyau (G0F) est réduite tandis que les espèces afucosylées sont augmentées dans l’expérience de knockdown. Les mesures ont été effectuées à partir d’échantillons de l’expérience G (voir le tableau 2). Les triples biologiques effectués pour chaque expérience ont été mélangés après la récolte afin de réduire le fardeau de l’analyse en aval. Reproduit à partir de Kotidis et al. 52. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63872/63872fig3v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Nom de l’expérience</td>
			<td colspan="2">Méthode d’électroporation</td>
			<td colspan="2">Concentration d’ARNdsi (nΜ)</td>
			<td>Temps de récolte (h)</td>
			<td>Viabilité (%)</td>
			<td colspan="2">Xv (106 cellules·mL-1)</td>
			<td>Titre IgG (mg· L-1)</td>
			<td colspan="2">Différence dans la fucosylation du noyau (%)</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpA_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>24</td>
			<td>98.3</td>
			<td colspan="2">4.71</td>
			<td>122.5</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpA_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>24</td>
			<td>98.3</td>
			<td colspan="2">4.9</td>
			<td>110.3</td>
			<td colspan="2">4.08</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpB_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>95.6</td>
			<td colspan="2">9.55</td>
			<td>453.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpB_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.7</td>
			<td colspan="2">9.61</td>
			<td>469</td>
			<td colspan="2">5.38</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpC_Negative</td>
			<td colspan="2">e2</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.3</td>
			<td colspan="2">9.91</td>
			<td>449.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpC_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e2</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>96.7</td>
			<td colspan="2">11</td>
			<td>454.6</td>
			<td colspan="2">11.42</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpD_Negative</td>
			<td colspan="2">e3</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>90.6</td>
			<td colspan="2">6.25</td>
			<td>318.5</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpD_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e3</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>89.1</td>
			<td colspan="2">6.09</td>
			<td>311.85</td>
			<td colspan="2">9.71</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpE_Negative</td>
			<td colspan="2">e4</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>91.1</td>
			<td colspan="2">7.2</td>
			<td>380.3</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpE_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e4</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>48</td>
			<td>93.3</td>
			<td colspan="2">7.79</td>
			<td>422.8</td>
			<td colspan="2">14.7</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpF_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">750</td>
			<td>48</td>
			<td>96.2</td>
			<td colspan="2">9.7</td>
			<td>501</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpF_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">750</td>
			<td>48</td>
			<td>95.7</td>
			<td colspan="2">9.76</td>
			<td>504.6</td>
			<td colspan="2">9.9</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpG_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">1000</td>
			<td>48</td>
			<td>96.1</td>
			<td colspan="2">11.1</td>
			<td>422.6</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpG_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">1000</td>
			<td>48</td>
			<td>95.9</td>
			<td colspan="2">9.73</td>
			<td>499.3</td>
			<td colspan="2">17.26</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpH_Negative</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>72</td>
			<td>94.4</td>
			<td colspan="2">14.3</td>
			<td>925.8</td>
			<td colspan="2">-</td>
		</tr><tr><td colspan="3">ExpH_Knockdown</td>
			<td colspan="2">e1</td>
			<td colspan="2">500</td>
			<td>72</td>
			<td>95</td>
			<td colspan="2">13.5</td>
			<td>1018.4</td>
			<td colspan="2">7.37</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2. Optimisation de la transfection. Les modifications itératives de la méthode d’électroporation, de la concentration d’ARNdsi et du temps de récolte ont entraîné des changements dans la viabilité cellulaire, la densité cellulaire viable, le titre d’IgG au moment de la récolte et des différences dans la fucosylation du noyau. Chaque expérience a comparé le knockdown et le contrôle négatif respectif pour déterminer si la modification produit l’effet souhaité (c’est-à-dire une diminution de la fucosylation). Les réglages d’électroporation étaient les suivants: e1: 1200 V, 0,1 ms, forme d’onde carrée; e2: 1200 V, 2x 0,1 ms, 5 s entre les impulsions, forme d’onde carrée; e3: 150 V, 20 ms, forme d’onde carrée; e4 : 250 V, 500 μF, désintégration exponentielle. Reproduit à partir de Kotidis et al. 52.

Le schéma de glycosylation d’un anticorps détermine ses performances cliniques, de sorte que les efforts industriels et académiques pour contrôler la glycosylation persistent. Étant donné que les campagnes typiques de glyco-ingénierie nécessitent beaucoup de temps et de main-d’œuvre, la génération d’un protocole rapide pour caractériser l’impact des gènes de glycosylation à l’aide d’un silence transitoire s’avérerait utile.

Glycoingénierie rapide des anticorps dans les cellules ovaires du hamster chinois

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

Ce protocole peut être utilisé pour dépister l’effet de plusieurs enzymes de glycosylation sur le profil glyco d’une protéine cible et contribuer à une meilleure compréhension des fonctionnalités de l’enzyme. La nature du protocole permet le criblage des enzymes de glycosylation de manière transitoire, mais à haut débit. Des profils de glycosylation altérés peuvent conduire à une amélioration des activités des anticorps, et donc augmenter l’efficacité du produit final.Les sociétés biopharmaceutiques surveillent de près la glycosylation en tant qu’attribut de qualité critique. Une glycosylation aberrante est une caractéristique de maladies comme le cancer. Par conséquent, cette méthode est pertinente pour la recherche pharmacologique et biomédicale.Le protocole suppose que les utilisateurs ont de l’expérience dans plusieurs techniques expérimentales, y compris la transfection de cellules de mammifères et les transferts de Western. Il est préférable de commencer avec moins d’échantillons et d’utiliser des points d’arrêt en premier lieu. Commencez par évaluer la densité et la viabilité des cellules de l’ovaire du hamster chinois.Ensuite, nettoyez soigneusement l’armoire de biosécurité et tout l’équipement avec de l’éthanol à 70% et une solution d’inhibiteur de RNase pour éviter toute contamination. Ensuite, abattez les cellules à 100 fois G pendant cinq minutes et remettez-les en suspension dans un milieu préchauffé à une densité cellulaire de cinq fois 10 à six cellules par millilitre. Transférer huit microlitres du mélange ou du contrôle maître DsiRNA dans une cuvette d’électroporation stérile.Ajouter 800 microlitres de la suspension cellulaire à la même cuvette, mélanger et délivrer l’impulsion d’électroporation. Ensuite, transférez la suspension cellulaire de la cuvette à un puits d’une plaque à six puits, en évitant le matériau semblable à de la mousse. Incuber les cellules pendant 10 minutes sans secouer.Après l’incubation, ajouter 800 microlitres de milieux préchauffés pour obtenir un volume final de 1,6 millilitre par puits. Cultivez les cellules transfectées dans l’incubateur tout en secouant à 150 RPM. Après 48 heures, récoltez le surnageant et les cellules.Après la purification des IgG, ajouter l’élution A sur un concentrateur centrifuge de coupure de poids moléculaire de trois kilodaltons et centrifuger à 13 300 fois G pendant 40 à 50 minutes à quatre degrés Celsius. La centrifugation est terminée une fois que le volume résiduel est égal ou inférieur à 50 microlitres. Jeter le flux et ajouter 500 microlitres de PBS 1X pré-réfrigéré pour diluer le surnageant résiduel.Centrifuger à nouveau l’échantillon en utilisant les mêmes conditions jusqu’à ce qu’il reste 50 microlitres de surnageant résiduel. Pour obtenir une dilution 100X du surnageant, ajoutez 500 microlitres de PBS 1X pré-réfrigéré et répétez le processus de centrifugation. Concentrez le surnageant dans une concentration finale d’environ 2,5 grammes par litre dans 40 microlitres pour assurer la compatibilité avec la méthode d’analyse du glycane.Pour l’analyse des glycanes, transférer 200 microlitres de la solution de billes magnétiques dans un tube PCR de 2 millilitres. Placez-le sur le support magnétique pour séparer les perles du surnageant et retirez soigneusement le surnageant. Ensuite, retirez les tubes du support magnétique et ajoutez l’échantillon de protéine purifiée et le vortex.Ensuite, ajoutez le tampon de dénaturation d’alimentation au tube d’échantillonnage et incubez pendant huit minutes à 60 degrés Celsius. Gardez les tubes d’échantillonnage ouverts pour des performances de réaction optimales. Après l’incubation, ajouter PNGase F et incuber pendant encore 20 minutes à 60 degrés Celsius pour cliver les glycanes des anticorps purifiés.Après la libération de N-glycanes, fermez le tube d’échantillonnage et le vortex. Ensuite, ajoutez l’acétonitrile au tube d’échantillonnage, au vortex et incubez à température ambiante pendant une minute. Placez les tubes d’échantillonnage dans le support magnétique pour séparer les billes de la solution.Ensuite, à l’aide d’une pipette, retirez soigneusement le surnageant sans toucher les perles. Ajouter la solution d’étiquetage du glycane contenant du fluorophore à l’échantillon dans une hotte et mélanger par vortex. Après une incubation de 20 minutes à 60 degrés Celsius avec des couvercles ouverts, enlever l’excès de colorant en lavant l’échantillon trois fois dans de l’acétonitrile.Ensuite, éluez les glycanes étiquetés dans de l’eau double distillée. Placez le tube d’échantillonnage dans le support magnétique et prélevez le surnageant enrichi en glycanes purifiés et étiquetés. Ensuite, préparez et chargez toutes les normes et tous les échantillons requis dans les positions de plateau désignées.Exécutez le protocole d’analyse des glycanes et analysez et identifiez les glycanes présents dans l’échantillon à l’aide d’un logiciel approprié. L’analyse par transfert Western a montré une réduction de l’expression de la protéine Fut8 dans les cellules transfectées avec un mélange de trois constructions d’ARNds Fut8. Les structures glycanes des cellules knockdown ont également montré une diminution de la fucosylation.Cette tendance était plus prononcée dans les structures agalactosylées et observée dans une moindre mesure dans les structures galactosylées. Une réduction de deux fois de la fucosylation du noyau a été observée à partir de l’électroporation en utilisant deux impulsions à ondes carrées par rapport à une seule impulsion à ondes carrées sans différences significatives dans la viabilité cellulaire. Dans l’ensemble, l’augmentation de la concentration d’ARN interférent à court terme a une grande interférence sur la fucosylation du noyau que l’augmentation du temps de récolte.Le rapport entre l’eau et l’acétonitrile détermine si les glycanes sont en solution ou en partie des perles. C’est crucial de s’en souvenir pendant les étapes de lavage pour éviter le retrait accidentel des glycanes étiquetés de la solution. Une expérience de suivi pourrait impliquer la caractérisation d’anticorps monoclonaux purifiés à l’aide de tests cellulaires pour quantifier la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps et la cytotoxicité dépendante du complément.

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