Mise en œuvre d’une résection mini-invasive de tumeurs cérébrales chez les rongeurs pour une collecte de tissus à haute viabilité

Il s’agit d’un paradigme de résection de tumeur cérébrale qui est très nécessaire dans la recherche préclinique sur les traitements pour les tumeurs cérébrales. Il permet une résection standardisée grâce à une approche mini-invasive, tout en étant couplé à un système automatisé de préservation des tissus. Ce protocole permet à l’animal de survivre après la chirurgie et aide ainsi à comprendre les changements dans l’état de la maladie après le traitement chez le même animal.

Cela aide dans les applications thérapeutiques séquentielles et accélérées. En utilisant cette technique, nous pouvons évaluer la biologie de la maladie et planifier une éventuelle prise en charge ultérieure. Cela a des implications et des opportunités importantes dans la découverte de médicaments et de nouvelles thérapies.

Les concepts de résection standardisée, d’approche mini-invasive et de préservation automatisée des tissus peuvent être étendus à d’autres types de tumeurs dans différents systèmes organiques, tels que les tumeurs du foie et les cancers de la tête et du cou. Le protocole est simple et le système est convivial. Il est préférable de lire le protocole publié, qui contient toutes les étapes nécessaires et le dépannage.

Commencez l’expérience en évaluant la souris pour la sédation en pinçant l’orteil. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter la sécheresse de la cornée. Ensuite, placez la souris sur un cadre stéréotaxique.

Retirez l’agrafe de la chirurgie précédente et désinfectez la peau avec des cycles alternés d’un gommage à base de chlorhexidine ou de bétaïne et d’alcool. Ensuite, créez une incision longitudinale médiane d’un centimètre le long de la cicatrice chirurgicale précédente à l’aide d’un scalpel stérile. Fixez la pièce à main MIRS au bras stéréotaxique à travers l’adaptateur de scène.

Pour configurer la machine MIRS, insérez le cordon d’alimentation situé sur le panneau arrière dans la prise du cordon d’alimentation. Allumez ou éteignez l’alimentation du système en basculant entre zéro et un. Insérez une extrémité du tuyau d’azote dans le raccord mâle sur le panneau arrière de la console.

Faites pivoter l’écrou de connexion dans le sens des aiguilles d’une montre pour le serrer. Assurez-vous que la pression d’alimentation ne dépasse pas 100 PSIG et fixez le tuyau à l’alimentation en azote. Scellez le couvercle de l’orifice de vide pour éviter toute fuite.

Vérifiez que le bouton d’aspiration à l’avant de la console est réglé sur 100, qu’il n’y a pas de fuite dans le système d’aspiration et que la pression d’alimentation en azote est correcte. Insérez le connecteur de pédale gris dans sa prise grise jusqu’à ce qu’il clique. De la même manière, insérez le connecteur de pièce à main bleu dans sa prise bleue.

Amorcez chaque pièce à main en aspirant du liquide stérile dans l’ouverture à travers le tube et la pièce à main, puis dans la cartouche pour s’assurer que l’intérieur du tube et de la pièce à main est lubrifié. Sélectionnez le mode d’aspiration sur le panneau avant de la console et lancez à l’aide de la pédale. Insérez la canule MIRS 23-G dans le trou de bavure à une profondeur de 2,5 millimètres.

Lancez le processus de résection en appuyant sur la pédale reliée à la canule. Effectuer des cycles complets de résection à l’aide du bouton de commande de la pièce à main. Après le processus de résection, retirez la canule MIRS de calibre 23 et ajoutez cinq millilitres de PBS 1X pour rincer le tube et déloger tous les débris résiduels.

Ensuite, fermez la plaie avec une agrafeuse et retirez la souris du cadre stéréotaxique. Remettez la souris dans le coussin chauffant pour récupérer de l’anesthésie avant de la remettre dans sa cage. Après l’expérience, purgez la canule avec du fluide refroidi et de l’air pour repousser tout le tissu réséqué vers la boîte de collecte.

Retirez la boîte de collecte du système et placez un capuchon. Ensuite, placez l’extrémité distale de la canule dans du peroxyde d’hydrogène à 3% et appliquez une aspiration pour remplir la conduite d’aspiration jusqu’à la cartouche de collecte d’aspiration. Laissez-le reposer pendant 60 à 90 secondes et pulsez de l’air et du média par intermittence pour le rincer.

Immerger l’échantillon tumoral dans une boîte de culture tissulaire contenant un milieu de lyse des globules rouges pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, placez un filtre de 70 microns sur un tube conique de 50 millilitres et utilisez un piston de seringue pour faire passer l’échantillon tumoral à travers le filtre. Avec une pipette de transfert, utilisez le média RPMI 1640 pour faire passer les cellules et toute masse tissulaire à travers le filtre.

Centrifuger à 428 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnageant et remettre chaque échantillon en suspension dans cinq millilitres de milieu RPMI 1640 préparé. Placez les échantillons dans un incubateur à agitateur pendant 20 minutes à 200 tr / min à 37 degrés Celsius.

Après l’incubation, centrifuger les échantillons à 428 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant. Filtrer les cellules individuelles à travers une crépine à cellules de 70 microns et centrifuger à 274 fois G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Effectuer une analyse de viabilité cellulaire avec du bleu de trypan et un hémocytomètre.

La résection chirurgicale chez la souris utilisant MIRS a entraîné une diminution significative de la charge tumorale, comme l’indique la réduction du signal bioluminescent moyen de base pour les groupes présentant une charge tumorale importante et petite. Par rapport aux images IRM pré-résection des tumeurs, la cavité de résection peut être identifiée sur les scans post-résection comme une grande zone hypointense ronde au site d’inoculation de la tumeur. Dans les sections colorées H & E, une cavité de résection circulaire claire avec un bord de produits sanguins, une inflammation et des cellules tumorales résiduelles ont été observées.

Le volume de résection a augmenté de manière significative lorsque deux rotations de l’ouverture de coupe ont été effectuées, ce qui a permis d’optimiser le volume de résection en fonction de la charge tumorale. La comparaison de la survie chez les souris atteintes de tumeurs non traitées par rapport aux souris subissant une résection de tumeurs par MIRS a montré une augmentation de la survie de 16 à 22 jours dans le petit groupe tumoral. De même, dans le groupe avec une charge tumorale plus importante, la survie médiane est passée de 12 à 19 jours.

Les images de microscopie optique des échantillons prélevés dans le système de préservation des tissus sont apparues sous forme de cellules uniques avec la présence de quelques petits morceaux de tissu au jour zéro. Après sept jours, les cellules récoltées avec MIRS ont montré la formation de neurosphères dans des cultures en suspension, ce qui indiquait leur potentiel d’initiation tumorale. Il est important de purger et de rincer le système de tuyauterie juste après la procédure pour éviter un colmatage du système.

Après cette procédure, les études d’efficacité thérapeutique et les études sur les marqueurs diagnostiques et pronostiques peuvent être utilisées sur les animaux survivants après une résection chirurgicale avec le système de résection mini-invasive.