Name: Édition génique de cellules primaires de macaque rhésus B (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Découvrez l'édition génique CRISPR/Cas9 de cellules B primaires de macaque rhésus pour la recherche préclinique sur les thérapies cellulaires. Cette méthode utilise rAAV6 et électroporation pour une modification efficace des gènes.

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Nous tenons à remercier Harry B. Gristick et Pamela Bjorkman d’avoir fourni l’antigène RC1 et l’ensemble des laboratoires Nussenzweig et Martin pour une discussion critique. Ce travail a été soutenu par la subvention INV-002777 de la Fondation Bill et Melinda Gates (au M.C.N.) et le programme de recherche intra-muros de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses, National Institutes of Health. (R.G. et M.A.M). M.C.N. est un enquêteur HHMI.

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<li>Plotkin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlates+of+protection+induced+by+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Correlates of protection induced by vaccination.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 17 (7), 1055-1065 (2010).</li>
<li>Brinkmann, V., Heusser, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dependent+differentiation+of+human+B+cells+into+IgM%2C+IgG%2C+IgA%2C+or+IgE+plasma+cells%3A+High+rate+of+antibody+production+by+IgE+plasma+cells%2C+but+limited+clonal+expansion+of+IgE+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell-dependent differentiation of human B cells into IgM, IgG, IgA, or IgE plasma cells: High rate of antibody production by IgE plasma cells, but limited clonal expansion of IgE precursors.</a> Cellular Immunology. 152 (2), 323-332 (1993).</li>
<li>Chernecky, C. C., Berger, B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChernecky%2C+CC+%22Protein+Electrophoresis+-+Serum.%2C+6th+edition%22">Protein Electrophoresis - Serum., 6th edition</a>. , Elsevier Saunders. St Louis, MO. 917-920 (2013).</li>
<li>Balazs, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+protection+against+HIV+infection+by+vectored+immunoprophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibody-based protection against HIV infection by vectored immunoprophylaxis.</a> Nature. 481 (7379), 81-84 (2011).</li>
<li>Greiner, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+editing+of+the+B+cell+receptor+in+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated editing of the B cell receptor in primary human B cells.</a> iScience. 12, 369-378 (2019).</li>
<li>Hartweger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-specific+humoral+immune+responses+by+CRISPR%2FCas9-edited+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV-specific humoral immune responses by CRISPR/Cas9-edited B cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1301-1310 (2019).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+elicitation+of+HIV+broadly+neutralizing+antibodies+from+engineered+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Vaccine elicitation of HIV broadly neutralizing antibodies from engineered B cells.</a> Nature Communications. 11, 5850(2020).</li>
<li>Jeske, A. M., Boucher, P., Curiel, D. T., Voss, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+strategies+to+actualize+B+cell-based+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Vector strategies to actualize B cell-based gene therapies.</a> Journal of Immunology. 207 (3), 755-764 (2021).</li>
<li>Nahmad, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+engineered+B+cells+secrete+high+titers+of+broadly+neutralizing+anti-HIV+antibodies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1241-1249 (2022).</li>
<li>Nahmad, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+B+cells+expressing+an+anti-HIV+antibody+enable+memory+retention%2C+isotype+switching+and+clonal+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineered B cells expressing an anti-HIV antibody enable memory retention, isotype switching and clonal expansion.</a> Nature Communications. 11, 5851(2020).</li>
<li>Voss, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+the+antigen+specificity+of+B+cells+using+genome-editing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Reprogramming the antigen specificity of B cells using genome-editing technologies.</a> eLife. 8, 42995(2019).</li>
<li>Pesch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+design%2C+optimization%2C+and+genomic+integration+of+chimeric+B+cell+receptors+in+murine+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular design, optimization, and genomic integration of chimeric B cell receptors in murine B cells.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2630(2019).</li>
<li>Cheong, T. C., Compagno, M., Chiarle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+of+mouse+and+human+immunoglobulin+genes+by+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Editing of mouse and human immunoglobulin genes by CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Communications. 7, 10934(2016).</li>
<li>Rogers, G. L., Cannon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+edited+B+cells%3A+A+new+frontier+in+immune+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Genome edited B cells: A new frontier in immune cell therapies.</a> Molecular Therapy. 29 (11), 3192-3204 (2021).</li>
<li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+protein-secreting+plasma+cells+by+homology-directed+repair+in+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells.</a> Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).</li>
<li>Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+primary+human+B+cells+with+CRISPR%2FCas9+targeted+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease.</a> Scientific Reports. 8, 12144(2018).</li>
<li>Wu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+in+primary+human+B+cells+with+CRISPR-Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering in primary human B cells with CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins.</a> Journal of Immunological Methods. 457, 33-40 (2018).</li>
<li>Luo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+alpha-PD-1+antibody-expressing+long-lived+plasma+cells+by+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+gene+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Engineering of alpha-PD-1 antibody-expressing long-lived plasma cells by CRISPR/Cas9-mediated targeted gene integration.</a> Cell Death and Disease. 11 (11), 973(2020).</li>
<li>Laoharawee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+of+primary+human+B+cells+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genome engineering of primary human B cells using CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visualized Experiments. (165), e61855(2020).</li>
<li>Laoharawee, K., Johnson, M. J., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering+of+primary+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome engineering of primary human B cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2115, 435-444 (2020).</li>
<li>Moffett, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+engineered+to+express+pathogen-specific+antibodies+protect+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells engineered to express pathogen-specific antibodies protect against infection.</a> Science Immunology. 4 (35), (2019).</li>
<li>Hartweger, H., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+comes+a-knock-in+to+reprogram+antibodies+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR comes a-knock-in to reprogram antibodies in vivo.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1183-1184 (2022).</li>
<li>Nishimura, Y., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice%2C+macaques%2C+and+men%3A+Broadly+neutralizing+antibody+immunotherapy+for+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Of mice, macaques, and men: Broadly neutralizing antibody immunotherapy for HIV-1.</a> Cell Host & Microbe. 22 (2), 207-216 (2017).</li>
<li>Shedlock, D. J., Silvestri, G., Weiner, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monkeying+around+with+HIV+vaccines%3A+Using+rhesus+macaques+to+define+%27gatekeepers%27+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monkeying around with HIV vaccines: Using rhesus macaques to define 'gatekeepers' for clinical trials.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (10), 717-728 (2009).</li>
<li>Kreuser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+methods+for+generation+and+expansion+of%2C+and+gene+delivery+to+rhesus+macaque+plasma+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient methods for generation and expansion of, and gene delivery to rhesus macaque plasma B cells.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
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<li>Su, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-attenuating+adenovirus+enables+production+of+recombinant+adeno-associated+virus+for+high+manufacturing+yield+without+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Self-attenuating adenovirus enables production of recombinant adeno-associated virus for high manufacturing yield without contamination.</a> Nature Communications. 13, 1182(2022).</li>
<li>Endo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-+and+long-term+clinical+outcomes+in+rhesus+monkeys+inoculated+with+a+highly+pathogenic+chimeric+simian%2Fhuman+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Short- and long-term clinical outcomes in rhesus monkeys inoculated with a highly pathogenic chimeric simian/human immunodeficiency virus.</a> Journal of Virology. 74 (15), 6935-6945 (2000).</li>
<li>Balaphas, A., Buchs, N. C., Meyer, J., Hagen, M. E., Morel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+splenectomy+in+the+era+of+minimally+invasive+surgery%3A+The+current+laparoscopic+and+robotic+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Endoscopy%22%5BJournal%5D)">Partial splenectomy in the era of minimally invasive surgery: The current laparoscopic and robotic experiences.</a> Surgical Endoscopy. 29 (12), 3618-3627 (2015).</li>
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<li>Labun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v3%3A+Expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li>
<li>Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+cesium+chloride-+and+iodixanol-based+purification+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+for+preclinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).</li>
<li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simplified+purification+of+recombinant+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus.</a> Journal of Virological Methods. 183 (2), 139-146 (2012).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22The+CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> The CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12, 686(2021).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broadly+neutralizing+macaque+monoclonal+antibody+against+the+HIV-1+V3-Glycan+patch%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A broadly neutralizing macaque monoclonal antibody against the HIV-1 V3-Glycan patch.</a> eLife. 9, 61991(2020).</li>
<li>Escolano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+expands+B+cells+specific+to+HIV-1+V3+glycan+in+mice+and+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunization expands B cells specific to HIV-1 V3 glycan in mice and macaques.</a> Nature. 570 (7762), 468-473 (2019).</li>
<li>Pathiraja, V., Matar, A. J., Gusha, A., Huang, C. A., Duran-Struuck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukapheresis+protocol+for+nonhuman+primates+weighing+less+than+10+kg%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Leukapheresis protocol for nonhuman primates weighing less than 10 kg.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 70-77 (2013).</li>
<li>Stratigopoulos, G., De Rosa, M. C., LeDuc, C. A., Leibel, R. L., Doege, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO+increases+efficiency+of+genome+editing+at+two+non-coding+loci%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">DMSO increases efficiency of genome editing at two non-coding loci.</a> PLoS One. 13 (6), 0198637(2018).</li>
</ol>

Aucun intérêt concurrent n’est déclaré.

Les protocoles présentés ici fournissent une méthode rapide et efficace pour générer des rendements et des titres élevés de rAAV6 en tant que HDRT et de nouvelles méthodes pour modifier efficacement les cellules primaires du macaque rhésus B in vitro.
Le protocole de production rAAV6 est relativement simple et rapide, permettant la production et le test de nombreuses constructions différentes simultanément sans travail excessif. Si vous le souhaitez, le rAAV6 peut être purifié davantage à l’aide de protocoles établis tels que l’ultracentrifugation à gradient d’iodixanol34 ou la séparation aqueuse à deux phases35 avant échange tampon et concentration.
Bien que cela ait réduit le rendement global, nous avons choisi d’utiliser uniquement un milieu de culture cellulaire réduit au sérum pour la purification du rAAV6 au lieu de la purification à partir de la pastille cellulaire, car la majorité du rAAV6 est libérée dans le milieu36 et la purification à partir de la pastille cellulaire ajoute plus de coûts et de main-d’œuvre. L’utilisation de l’assistant adénoviral auto-inactivant a augmenté les rendements de 30 à 40 fois en moyenne, ce qui a permis de tester les constructions emballées dans AAV6 dans une seule boîte de 15 cm. Bien que notre méthode de purification soit basique, en utilisant cette méthode, nous obtenons relativement peu de variation d’un lot à l’autre dans l’efficacité de l’édition de gènes ou la viabilité cellulaire après la transduction en utilisant diverses lignées cellulaires ou d’autres cellules primaires (données non présentées).
Nous avons développé un protocole de purification des cellules B du macaque rhésus pour obtenir des cellules B primaires intactes en utilisant l’épuisement négatif des populations indésirables. Bien qu’il ne soit pas nécessaire pour l’édition de gènes de ces cellules, il fournit un moyen d’obtenir une population relativement pure de cellules primaires de macaque rhésus B pour cette application ou d’autres si d’autres types de cellules interfèrent avec les objectifs expérimentaux. Cependant, la pureté se fait au prix d’une réduction des rendements globaux des cellules B. Notamment, pour les cultures de cellules B enrichies et non enrichies, la fraction de cellules B dans les préparations initiales de PBMC ou de splénocytes est cruciale. Pour les PBMC en particulier, nous recommandons de dépister différents macaques chez les individus ayant un pourcentage élevé de lymphocytes B dans le sang périphérique afin d’obtenir un nombre élevé de lymphocytes B pour les expériences, car cette valeur peut varier considérablement d’un individu à l’autre27. Les PBMC peuvent être obtenues par saignement régulier ou leucaphérèse42.
Le protocole d’édition de gènes conduit à une édition de gènes efficace, généralement entre 60% et 80% des cellules B knock-out et 5% à 20% des cellules B knock-in, bien que nous ayons atteint jusqu’à 90% de BCR knock-out et 40% BCR knock-in B (Figure 5 et Figure 6).
Les principaux paramètres pour l’édition efficace des cellules B de macaque rhésus sont l’efficacité de coupe de l’ARNg, les paramètres d’électroporation, le MOI et la qualité de la préparation rAAV6. L’efficacité de coupe des ARNg candidats doit être déterminée empiriquement pour permettre une édition et une conception optimales du HDRT. Les paramètres d’électroporation présentés ici équilibrent l’efficacité et la viabilité pour obtenir le nombre total maximal de cellules B éditées plutôt que le pourcentage le plus élevé de cellules B éditées. Si un pourcentage plus élevé de cellules éditées est nécessaire, des tensions accrues (jusqu’à 1 750 V) ou des longueurs d’impulsion modifiées (10-30 ms) sont recommandées, bien que plus de mort cellulaire puisse être observée. Nous avons également noté des efficacités d’édition légèrement plus élevées dans les cellules B spléniques par rapport aux cellules B des PBMC du même individu (Figure 5) ; Cependant, la raison sous-jacente de cette situation est actuellement inconnue.
Nous avons constaté que l’ajout de 1% de DMSO après électroporation augmentait significativement l’efficacité de l’édition de gènes de ~40% dans les cellules B de macaque rhésus sans affecter la viabilité cellulaire (Figure 6A-C), conformément aux rapports dans d’autres cellules43. Cependant, une culture prolongée dans du DMSO à 1% doit être évitée et peut affecter la viabilité cellulaire. Le DMSO peut être complètement omis si vous le souhaitez.
La culture des cellules dans un petit volume après électroporation pendant plusieurs heures avec le rAAV6 conduit à des rendements d’édition plus élevés, probablement en raison de la meilleure transduction du HDRT par le rAAV6 et, par conséquent, de la concentration intracellulaire plus élevée de HDRT au moment pertinent où Cas9 est actif. Nous avons constaté que la culture des cellules de cette façon jusqu’à 8 heures n’affectait pas la viabilité cellulaire, mais que l’efficacité de l’édition n’augmentait pas de façon spectaculaire au-delà de 5 heures (Figure 6). Si seule l’élimination au lieu de la frappe est requise, cette étape peut être omise.
En conclusion, nous présentons des protocoles complets pour l’édition génique des cellules B du macaque rhésus in vitro et la production de rAAV6 HDRT nécessaires à l’impact efficace des constructions souhaitées. Ces protocoles permettent de tester rapidement et à moindre coût de nombreuses constructions présentées sous forme de rAAV6 et de tester précliniquement la faisabilité et l’évolutivité des thérapies à base de cellules B dans un modèle de primates non humains plus pertinent.

Les cellules B sont le fondement de l’immunité humorale. Lors de l’activation par l’antigène apparenté et les signaux secondaires, les cellules B naïves donnent naissance à des cellules B du centre germinal, des cellules B mémoire et des plasmocytes1. Ce dernier est la source des anticorps sécrétés qui interviennent dans les fonctions protectrices de la plupart des vaccins actuellement disponibles2. Les plasmocytes ont été décrits comme des usines d’anticorps car ils sécrètent de grandes quantités d’anticorps dans le sérum - environ 2 ng / jour / cellule3, soit 7-16 g / L de sérum, faisant des anticorps l’une des trois protéines les plus abondantes dans le sérum4. Les cellules B sont abondantes dans le sang et peuvent donc être facilement obtenues et réinjectées à un individu.
Ces caractéristiques ont fait des cellules B une cible des efforts de thérapie cellulaire pour modifier le récepteur des cellules B (BCR) et exprimer des anticorps largement neutralisants (bNAbs) dirigés contre le virus de l’immunodéficience humaine (VIH)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 et d’autres protéines 16, 17,18,19,20,21. De telles approches ont montré un potentiel dans de nombreuses études sur la souris in vivo 7,8,10,11,16,22. Cependant, plusieurs obstacles doivent encore être surmontés pour la traduction clinique 9,15,23, parmi lesquels l’innocuité, la durée et l’ampleur de l’efficacité thérapeutique, ainsi que la mise à l’échelle à des animaux plus gros tels que les primates non humains (PNH). En effet, les PSN, et en particulier les macaques rhésus, qui ont une longue histoire dans la recherche sur les anticorps et le VIH24,25, sont le modèle le plus approprié pour tester ces paramètres.
Ici, nous avons développé des protocoles qui permettent de résoudre ces problèmes. À ce jour, peu d’études ont tenté de cultiver des cellules B de macaque rhésus ex vivo, et seule une sélection positive utilisant CD20 a été rapportée pour la purification des cellules B de macaque rhésus26,27,28. Nous avons établi un protocole pour l’isolement des cellules B du macaque rhésus intactes par l’épuisement négatif d’autres types de cellules. De plus, les conditions de culture sont définies pour l’édition génique ciblée des cellules B de macaque rhésus. Ce protocole décrit l’utilisation des ribonucléoprotéines CRISPR/Cas9 (RNP) et du virus adéno-associé recombinant sérotype 6 (rAAV6) comme modèle de réparation dirigée par homologie (HDRT) pour modifier des gènes de cellules de macaque rhésus B en culture. Grâce à ce protocole, des gains d’édition allant jusqu’à 40 % avec de grands inserts (~1,5 ko) ont été atteints. Nous présentons également une méthode rapide et rentable pour produire du rAAV6 en utilisant un assistant adénoviral auto-silencieux activé par la tétracycline29 pour permettre le test rapide des HDRT dans ce format. Ensemble, ces protocoles décrivent un flux de travail efficace pour l’édition de gènes de cellules B de macaque rhésus (Figure 1), permettant l’évaluation des thérapies à base de cellules B dans un modèle de PSN.
Pour commencer les expériences, le matériel du donneur peut être commandé auprès de sources commerciales ou obtenu par phlébotomie ou splénectomie. Dans cette étude, les phlébotomies et les prélèvements sanguins ont été effectués comme décrit précédemment30 en utilisant l’anticoagulant EDTA. Pour obtenir des cellules B de macaque rhésus primaire splénique, des splénectomies partielles (25% à 50%) ou totales ont été réalisées à l’aide de techniques rapportées précédemment31. Les animaux ont été à jeun pendant la nuit avant l’opération. Brièvement, pendant la chirurgie, l’abdomen a été coupé et préparé avec des gommages alternés de chlorhexidine et d’alcool isopropylique à 70% trois fois. Une incision (5-10 cm) a été faite dans l’abdomen pour identifier et isoler la rate. Le système vasculaire de la rate était ligaturé avec des sutures ou des pinces vasculaires. L’incision a été fermée en deux couches avec des sutures de polydioxanone 4-0 PDS. La splénectomie a été réalisée une seule fois pour un animal individuel. Des suspensions unicellulaires ont été préparées à partir de rate de macaque par macération à l’aide de crépines cellulaires. Les cellules mononucléaires provenant de suspensions de sang et de cellules spléniques ont été préparées par centrifugation à gradient de densité et stockées dans de l’azote liquide.

<table><tbody><tr><td>Tube stérile de 1,5 ml, exempt de Dnase, de Rnase et de purogène</td> Pipette sérologique de 10 ml <td>Stellar Scientific</td><td>T17-125</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Pipette sérologique de 10 ml, polystyrène, stérile, apyrogène, sans DNase/RNase et sans ADN humain</td><td>Corning</td><td>4488</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire de 15 cm</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>15 mL de polypropylène conique Falcon</td><td></td><td>352097</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Pipette sérologique de 25 mL, polystyrène, stérile, apyrogène, sans DNase/RNase et sans ADN humain</td><td>Corning</td><td>4489</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>250 mL de polypropylène conique</td><td>Corning</td><td>430776</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>293AAV Cell</td><td>Line Cell Biolabs</td><td>AAV-100</td><td></td></tr><tr><td>2-B-mercapto-éthanol, 55mM (1000x)</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Culture tissulaire à 48 puits Pipette</td> sérologique <td>Corning</td><td>3548</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>de 5 ml, en polystyrène, stérile, apyrogène, sans DNase/RNase et sans ADN humain</td><td>Corning</td><td>4487</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Seringues de 5 mL avec Luer-Lok Tip</td><td>BD</td><td>309646</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Tybe conique en polypropylène de 50 ml Falcon</td><td></td><td>352070</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Pipette sérologique de 50 mL, polystyrène, stérile, apyrogène, sans DNase/RNase et sans ADN humain</td><td>Corning</td><td>4490</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Plaque de culture tissulaire à 6 puits</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>AAV-6 Système d’emballage (plasmides)</td><td>Cell Biolabs</td><td>VPK-406</td><td></td></tr><tr><td>AAV6 Matériaux de référence (capsides complètes)</td><td>Charles River</td><td>RS-AAV6-FL</td><td></td></tr><tr><td>Accu-jet S Contrôleur de pipette</td><td>Marque</td><td>26350</td><td>ou similaire Contrôleur de pipette</td></tr><tr><td>Antibiotique/Antimycosique 100x</td><td>Gibco</td><td>15260-062</td><td></td></tr><tr><td>anti-humain CD14 AlexaFluor647</td><td>Biolegend</td><td>301812</td><td></td></tr><tr><td>anti-humain CD14 biotine</td><td>BioLegend</td><td>301826</td><td></td></tr><tr><td>anti-humain CD16 AlexaFluor700</td><td>BD Biosciences</td><td>557920</td><td></td></tr><tr><td>biotine CD16 anti-humaine</td><td>BioLegend</td><td>302004</td><td></td></tr><tr><td>biotine CD20 PECy7 anti-humaine</td><td>Biolegend</td><td>302312</td><td></td></tr><tr><td>biotine CD3 anti-humaine</td><td>Thermo Fisher</td><td>APS0309</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PE anti-humain</td><td>BD Biosciences</td><td>552127</td><td></td></tr><tr><td>biotine CD33 anti-humaine</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-347</td><td></td></tr><tr><td>biotine CD64 anti-humaine BioLegend</td><td></td><td></td><td></td>305004</tr><tr><td>biotine CD66 anti-humaine</td><td>Miltenyi</td><td>130-100-143</td><td></td></tr><tr><td>biotine CD89 anti-humaine</td><td>BioLegend</td><td>354112</td><td></td></tr><tr><td>biotine CD8a anti-humaine</td><td>BioLegend</td><td>301004</td><td></td></tr><tr><td>anti-humaine HLA-DR BV605</td><td>Biolegend</td><td>307640</td><td></td></tr><tr><td>Chaîne légère Ig anti-humaine lambda APC</td><td>Biolegend</td><td>316610</td><td></td></tr><tr><td>anti-humain IgM BV421</td><td>Biolegend</td><td>314516</td><td></td></tr><tr><td>anti-humain Kappa Light Chain FITC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18854</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Steris</td><td>Amsco Lab 250</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Incubateur de CO2 de culture cellulaire</td><td>Fisher Scientific</td><td>51026331</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Unité de filtration centrifuge (Amicon Ultra - 4, 100 kDa)</td><td>Millipore</td><td>UFC810024</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5920 R</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628188</td><td>ou toute autre centrifugeuse à godet oscillant refroidissable avec inserts pour plaques de 96 puits, tubes de 15, 50 et 250 ml</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Cpg ODN</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-2395</td><td></td></tr><tr><td>Diméthyl sulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34869-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, haute teneur en glucose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI (sans RNase)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303L</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sans calcium, sans magnésium</td> Kit <td>d’électroporation 14190144</td><td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>(Neon Transfection System 10 &micro ; L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td>ou autres tailles ou kit de transfection de 100 μL MPK 10096</td></tr><tr><td>Système d’électroporation (système de transfection au néon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03*</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-PM400 (Ficoll-Paque PLUS)</td><td>Hotte Cytiva</td><td>17144002</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>FH3943810244</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Glutamine 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Cylindre gradué 1L</td><td>Corning</td><td>3022-1L</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z375357-1EA</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur magnétique à plaque chauffante</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88857200</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>BAFF</td><td>humain Peprotech&nbsp ;</td><td>310-13</td><td></td></tr><tr><td>Humain BD Fc Block</td><td>BD</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>Humain IL-10</td><td>Peprotech&nbsp ;</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humaine</td><td>Peprotech&nbsp ;</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtres pour seringues en polyéthersulfone hydrophile, (membrane Supor), stériles - 0,2 & micro ; m, 25 mm&nbsp ;</td><td>Pall</td><td>4612</td><td></td></tr><tr><td>Insuline-Transférin-Sélénium, 100x</td><td>Gibco</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>ITR amorce avant : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>ITR primer reverse : CGGCCTCAGTGAGCGA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow biosafety cabinet</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Grande colonne d’appauvrissement magnétique (LD)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur magnétique (séparateur MidiMACS et multistand)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-329</td><td></td></tr><tr><td>Barre d’agitation magnétique</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-127</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Billes magnétiques de streptavidine (Streptavidin MicroBeads)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>Kit Maxiprep</td><td>Machery-Nagel</td><td>740414.5</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Média Flacons 2L avec bouchon</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34514-26</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>MegaCD40L</td><td>Enzo</td><td>ALX-522-110-C010</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 384-well Reaction Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000014</td><td>ou toute autre centrifugeuse de table pour tubes de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Four à micro-ondes</td><td>Panasonic</td><td>NN-SD987SA</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Nikon TMS Microscope à contraste de phase inversé</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td>ou tout autre microscope à contraste de phase inversé pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels, 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Tampon duplex sans nucléases</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>11-01-03-01</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>Qiagen</td><td>129115</td><td></td></tr><tr><td>pH-mètre</td><td>Mettler Toledo</td><td>30019028</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Pipetman Classic Starter Kit, 4 Pipettes Kit, P2, P20, P200, P1000 et pointes</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td>ou similaire set de pipettes et pointes</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 10 %</td><td>Gibco</td><td>24040-032</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol 8000</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylénimine, linéaire, MW 25000, qualité de transfection (PEI 25K</td><td>Polysciences</td><td>23966-100</td><td></td></tr><tr><td>Balance de précision</td><td>Mettler Toledo</td><td>ME4001TE</td><td>ou filtres de</td></tr><tr><td>pré-séparation similaires (30 &micro ; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Bécher en verre Pyrex 2 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34502-13</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Bécher en verre Pyrex 250 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS1000250</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Instrument qPCR Fisher</td><td>Scientific</td><td>4485691</td><td>ou antigène</td></tr><tr><td>RC1 similaire biotinylé aléatoirement</td><td>Bjorkman lab, CalTech</td><td>en interne</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>S.p. Cas9 Nucléase</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1081059</td><td></td></tr><tr><td>Scientific 1203 Bain d’eau</td><td>VWR</td><td>24118</td><td>ou n’importe quel ensemble de bain-marie à&nbsp ; 37 &deg ; C</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium 100 mM</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Unités de filtration jetables stériles avec membranes PES</td><td>Thermo&nbsp ; Nalgene scientifique&nbsp ;</td><td>567-0020&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Vecteur adénoviral auto-silencieux compatible avec la tétracycline RepCap6&nbsp ;</td><td>Oxgene</td><td>TESSA-RepCap6</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4 %</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>système de purification de l’eau</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZEQ7000TR</td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Zombie-NIR</td><td></td><td>Biolegend 423106</td><td></td></tr></tbody></table>

Édition génique de cellules primaires de macaque rhésus b

Gene Editing of Primary Rhesus Macaque B Cells

Les lymphocytes B et leur descendance sont les sources d’anticorps fortement exprimés. Leurs capacités élevées d’expression protéique ainsi que leur abondance, leur accessibilité facile via le sang périphérique et leur facilité pour les transferts adoptifs simples en ont fait une cible attrayante pour les approches d’édition de gènes pour exprimer des anticorps recombinants ou d’autres protéines thérapeutiques. L’édition de gènes de cellules B primaires de souris et humaines est efficace, et les modèles murins pour les études in vivo se sont révélés prometteurs, mais la faisabilité et l’évolutivité pour des modèles animaux plus grands n’ont pas encore été démontrées. Nous avons donc développé un protocole pour éditer les cellules B primaires du macaque rhésus in vitro afin de permettre de telles études. Nous rapportons les conditions de culture in vitro et d’édition de gènes de cellules B de macaque rhésus primaire à partir de cellules mononucléées du sang périphérique ou de splénocytes à l’aide de CRISPR / Cas9. Pour réaliser l’intégration ciblée de grandes cassettes (<4,5 kb), un protocole rapide et efficace a été inclus pour la préparation du virus adéno-associé recombinant de sérotype 6 en tant que modèle de réparation dirigé par homologie à l’aide d’un vecteur auxiliaire adénoviral auto-silencieux activé par la tétracycline. Ces protocoles permettent l’étude de thérapies prospectives à base de cellules B chez les macaques rhésus.

Nous présentons une méthode de culture et d’édition de gènes de cellules B de macaque rhésus primaire utilisant CRISPR / Cas9 et le virus adéno-associé recombinant sérotype 6 pour l’étude des thérapies cellulaires B.

Édition génique de cellules primaires de macaque rhésus B

B cells and their progeny are the sources of highly expressed antibodies. Their high protein expression capabilities together with their abundance, easy ...

La méthode est relativement simple et permet une édition efficace des gènes des cellules B du macaque rhésus. La méthode permet de tester des cellules B génétiquement modifiées à des fins thérapeutiques chez les macaques rhésus. Il convient également à la recherche préclinique sur la thérapie par cellules B.La méthode générale peut être adaptée à d’autres types de cellules. Si la procédure est suivie correctement, il ne faut pas s’attendre à des luttes. Cependant, l’efficacité de la coupe de l’ARNg et un lot de bonne qualité de gabarit recombinant AAV6 sont essentiels.Pour commencer, préchauffez le milieu de culture de cellules B dans un bain-marie de 37 degrés Celsius. Décongeler les stimulants des cellules B sur la glace. Préparez un tube de taille appropriée contenant un milieu de décongélation préchauffé.Décongeler un à deux flacons de splénocytes de macaque rhésus primaire ou PBMC dans un bain-marie de 37 degrés Celsius. Décanter les splénocytes dans le tube préparé contenant un milieu de décongélation préchauffé. Rincez les cryotubes pour recueillir toutes les cellules.Centrifuger les cellules à 200 G pendant 10 minutes à température ambiante. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 10 millilitres de milieu de décongélation pour le lavage. Répétez les centrifugations trois fois pour éliminer le milieu de congélation.Après la dernière centrifugation, remettre les cellules en suspension à environ cinq fois 10 à six cellules par millilitre dans un milieu de culture de cellules B. Combinez 10 microlitres de suspension cellulaire avec 10 microlitres de bleu trypan à 0,4% et comptez les cellules sur un hémocytomètre. Ajustez la concentration cellulaire à trois fois 10 à six cellules par millilitre avec le milieu de culture de cellules B en fonction du nombre de cellules.Ensuite, ajoutez les stimulants des cellules B à leurs concentrations finales et mélangez. Transférez les cellules dans une boîte de culture cellulaire et incuberez-les à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 48 heures. Après l’installation, les cellules devraient former une monocouche dense et de petits amas de cellules peuvent déjà être visibles.Après environ deux jours, les cellules devraient être saines, irrégulières et avoir formé des amas visiblement plus grands. Après avoir activé les cellules B, préparez les réactifs pour l’électroporation et la transduction. Préchauffez le tampon duplex sans nucléase DMSO, le tampon T et le tampon E ou E2 du kit d’électroporation à température ambiante.Décongelez le modèle de réparation dirigée par homologie rAAV6, ou HDRT, et les stimulants des cellules B sur la glace. Resuspendre l’ARN monoguide CRISPR Cas9, ou sgRNA, à 100 micromolaires dans un tampon duplex. Reconstituer pendant 10 minutes à température ambiante et mélanger par tourbillon et effleurement.Placer l’ARNg reconstitué sur de la glace jusqu’à utilisation. Pour l’électroporation de 10 microlitres, préparez 550 microlitres de milieu de culture de cellules B avec des stimulants et 1% de DMSO. Ajoutez 50 microlitres de ce milieu avec ou sans antibiotiques dans une plaque de culture cellulaire de 48 puits.Ensuite, ajoutez rAAV6 HDRT au milieu dans les puits, jusqu’à 20% du volume du puits. Préchauffer le plat préparé et le milieu restant dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, pour l’électroporation de 10 microlitres, préparez 1,15 microlitre de ribonucléoprotéine, ou RNP, en mélangeant 0,4 microlitre de Cas9 61 micromolaires avec 0,75 microlitre d’ARNg de 100 micromolaires dans un tampon duplex.Incuber le RNP pendant 15 minutes à température ambiante avant de le mélanger avec les cellules. Après l’incubation, plusieurs RNP peuvent être combinés si plus d’un locus doit être ciblé simultanément. Ensuite, préparez les cellules pour l’électroporation.Laissez les cellules à température ambiante pour éviter les chocs de température. Après l’incubation, récoltez les cellules dans un récipient approprié. Rincez le plat avec DPBS pour recueillir le maximum de cellules.Centrifuger les cellules à 200 G pendant 10 minutes. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans le DPBS à environ deux fois 10 à six cellules par millilitre, en fonction du nombre de cellules mises dans la culture. Combinez des volumes égaux de suspension cellulaire et de bleu de trypan à 0,4% et comptez à l’aide d’un hémocytomètre.Après avoir centrifugé et jeté le surnageant, remettre les cellules en suspension dans le tampon T préchauffé à 5,55 fois 10 à sept cellules par millilitre, en fonction du nombre de cellules. Configurez le système de transfection en allumant la machine et en la réglant sur 1 350 volts, 15 millisecondes et une impulsion. Placez la pipette à l’intérieur de la hotte à flux laminaire.Pour chaque jeu de 10 électroporations, préparez un tube de transfection avec trois millilitres de tampon E.Insérez le tube dans la station de pipette. Combinez 1,15 microlitre de RNP avec neuf microlitres de cellules par électroporation. Préparez au moins 20% de plus pour éviter les bulles et incuber à température ambiante pendant une minute avant l’électroporation.Aspirer 10 microlitres de RNP et de mélange cellulaire dans l’embout d’électroporation d’une pipette d’électroporation. Insérez la pipette chargée dans la station de pipette et démarrez l’électroporation. Assurez-vous que les embouts sont complètement exempts de bulles d’air pour éviter les arcs électriques.Éjecter immédiatement les cellules électroporées dans le petit volume de milieu préchauffé préparé, avec ou sans rAAV6, à l’intérieur du puits 48. Ajouter des échantillons témoins sans transfection dans les puits de culture. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant quatre à six heures.À la fin de l’incubation, ajouter 450 microlitres de milieu de culture de cellules B préchauffé contenant des stimulants, du DMSO, et avec ou sans antibiotiques dans la plaque. Effectuer une analyse de l’ADN génomique après 24 heures. Quantifier l’efficacité d’édition avec la réaction en chaîne de la polymérase numérique gouttelette, ou PCR, en utilisant une amorce à l’extérieur du bras d’homologie et une amorce à l’intérieur de l’insert.Effectuez la PCR pour amplifier le site d’insertion et le séquençage de Sanger pour vérifier l’édition correcte. Pour analyser les niveaux de protéines, cultiver les cellules pendant 40 à 48 heures après l’électroporation pour permettre des changements d’expression des protéines et effectuer une analyse par cytométrie en flux. La production de rAAV6 à l’aide d’un auxiliaire adénoviral auto-silencieux activé par la tétracycline a entraîné la production de quatre fois 10 à 10 GC par millilitre de milieu de culture cellulaire, surpassant la production en utilisant une triple transfection sans aide de 30 à 40 fois.La purification facultative a permis d’éliminer la majorité des lymphocytes T CD3+ et des lymphocytes myéloïdes CD14+et CD16+, avec des puretés de 80 à 95 % de cellules CD20+B obtenues régulièrement. L’édition de gènes de cellules primaires de macaque rhésus B est illustrée ici. Cette étude a maintenu une viabilité cellulaire élevée, tout en supprimant simultanément l’expression de la chaîne légère dans les cellules 80% B.La majorité des lymphocytes B exprimaient encore l’isotype IgM. L’ajout de rAAV6 codant pour l’anticorps 1485 HDRT a entraîné l’édition de gènes et l’expression de surface de l’anticorps 1485 dans 16 à 21% des cellules B, bien qu’à une intensité de fluorescence plus faible pour les chaînes d’anticorps que sur les cellules B non éditées. L’ajout de 1 % de DMSO et d’incubations étendues et concentrées avec le rAAV6 HDRT a généralement augmenté l’efficacité du montage.En utilisant cette méthode, une efficacité d’édition généralement de cinq à 20% et jusqu’à 40% a été atteinte, en fonction du macaque rhésus individuel et de la qualité du lot rAAV6 HDRT. Lors de l’électroporation, assurez-vous d’avoir suffisamment de mélange pour la transfection et il n’y a pas de bulles dans la pointe. Les cellules peuvent être analysées par n’importe quelle méthode souhaitée ou un transfert autologue dans le macaque rhésus donneur peut être effectué.

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Ingénierie génomique des cellules B humaines primaires à l’aide de CRISPR/Cas9

L’objectif de ce protocole est de permettre l’édition CRISPR/Cas9 transparente du génome de C. elegans en utilisant des complexes de ribonucléoprotéines assemblés et le marqueur co-CRISPR dpy-10 pour le dépistage. Ce protocole peut être utilisé pour effectuer une variété de modifications génétiques chez C. elegans, y compris des insertions, des délétions, des remplacements de gènes et des substitutions de codon.

CRISPR/Cas9 Édition du gène C. elegans rbm-3.2 à l’aide du marqueur de criblage co-CRISPR dpy-10 et des complexes de ribonucléoprotéines assemblés.

Ce protocole décrit la procédure d’édition du génome dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris à l’aide de complexes ribonucléoprotéiques Cas9-sgRNA assemblés in vitro et délivrés par électroporation.

Perturbation génique à haute efficacité dans les macrophages primaires dérivés de la moelle osseuse à l’aide de complexes d’ARNsg Cas9-sgRNA électroporés

La délivrance des éditeurs génomiques sous forme d’ARN est un moyen particulièrement puissant de modifier les génomes des cellules et lignées cellulaires primaires de mammifères. L’objectif de ce protocole est de délivrer des éditeurs de génome sous forme d’ARNm dans les cellules et lignées cellulaires primaires de mammifères, suivis d’un séquençage ciblé Illumina et d’une analyse afin de quantifier les résultats d’édition.

Édition génomique dans les cellules primaires de mammifères via électroporation de l’ARN éditeur

Découvrez l'édition génique CRISPR/Cas9 de cellules B primaires de macaque rhésus pour la recherche préclinique sur les thérapies cellulaires. Cette méthode utilise rAAV6 et électroporation pour une modification efficace des gènes.

Édition génique de cellules primaires de macaque rhésus B

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