Extraction de microtubules modifiés de cellules de mammifères pour étudier les complexes microtubule-protéine par cryomicroscopie électronique

Les études structurales des protéines interagissant avec les microtubules par cryo-microscopie électronique sont cruciales pour comprendre les mécanismes cellulaires. La préparation de microtubules homogènes liés à des protéines en interaction sur une grille cryo-EM est cruciale pour le succès. Ce protocole est simple, bon marché, et il permet de préparer des microtubules avec des modifications post-traductionnelles contrôlées en quantité et qualité suffisantes pour la cryo-microscopie électronique.

Les microtubules sont très sensibles à la température. Il est donc important de garder les solutions contenant des microtubules au chaud pour éviter la dépolymérisation. Pour commencer, cultivez la lignée cellulaire HCT116 génétiquement modifiée dans un milieu de culture cellulaire DMEM jusqu’à ce que six à 12 plaques confluentes soient obtenues.

Lavez doucement les cellules avec 10 millilitres de PBS pour éliminer tout milieu de culture cellulaire. Détacher les cellules des plaques en les incubant pendant cinq minutes à température ambiante avec trois millilitres de PBS glacé complété par de l’EDTA à cinq millimolaires, puis à l’aide d’un grattoir de cellules. Recueillir les cellules dans un tube de 50 millilitres sur de la glace et tourner à 250 G pendant 10 minutes.

Notez le volume des cellules récoltées avec l’échelle volumétrique sur le tube. Remettez en suspension la pastille de cellule récoltée dans un volume égal de tampon de lyse et de cellules de lyse par sonication. Après la sonication, pour l’analyse SDS-PAGE, ajoutez deux microlitres de lysat dans un tube contenant 18 microlitres d’eau et cinq microlitres de tampon d’échantillon FDS 5X.

Pipeter les cellules lysées restantes dans un tube centrifuge et faire tourner à 100 000 G pendant une heure à quatre degrés Celsius dans un rotor ultracentrifuge pour éliminer le lysat. À l’aide d’une seringue, retirer le lysat dégagé sans déranger la pastille et la couche flottante sur le dessus. Ajouter deux microlitres de lysat dégagé dans un tube contenant 18 microlitres d’eau et cinq microlitres de tampon d’échantillon FDS 5X.

Rincez soigneusement la pastille et ramassez un peu de la pastille en faisant tourbillonner une pointe de pipette P-10 à travers la pastille. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’eau et 50 microlitres de tampon SDS. Ajouter du GTP millimolaire et 20 micromolaires de paclitaxel dans un surnageant recueilli pour polymériser les microtubules et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour permettre aux microtubules de s’assembler.

Préparez le tampon coussin en ajoutant 600 microlitres de glycérol à 400 microlitres de tampon de lyse et complétez le mélange avec 20 micromolaires de paclitaxel. Préchauffez le tampon à 37 degrés Celsius. Ajouter 800 microlitres de tampon coussin à un tube ultracentrifugeux.

Ensuite, pipeter soigneusement le lysat supplémenté en GTP-paclitaxel sur le tampon coussin. Placez le tube dans un rotor à ultracentrifugeuses pour tourner à 100 000 G à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Marquez le bord orienté vers l’extérieur du tube pour reconnaître facilement où la pastille de microtubule doit se former.

Après centrifugation, retirer soigneusement le tampon coussin à l’aide d’une pipette sans déranger la pastille. Ajoutez soigneusement un tampon de lyse à côté de la pastille, tournez le tube plusieurs fois pour éliminer autant de glycérol que possible de la pastille et des parois du tube, puis aspirez et répétez l’étape de lavage trois fois. Remettez doucement en suspension la pastille lavée avec une pointe coupée dans un tampon de remise en suspension préchauffé de 50 microlitres et placez le tube à 37 degrés Celsius.

Ajouter deux microlitres de fraction de granulés en suspension dans 18 microlitres d’eau et cinq microlitres de tampon d’échantillon FDS 5X. Préparez le dispositif de congélation en installant le papier buvard. Réglez la température de l’appareil à 30 degrés Celsius et l’humidification à 100 %Laissez l’appareil s’équilibrer pendant 30 minutes.

Préparez les réglages du congélateur pour deux applications. Pour la première application, réglez la force sur 10, deux secondes de temps de transfert et zéro seconde de temps d’attente. Pour la deuxième application, définissez la force sur 10, 6,5 secondes de temps de transfert et 10 secondes de temps d’attente.

Placez les grilles avec leur côté carbone vers le haut dans le véhicule de décharge de lueur métallique. La lueur décharge la cryo-microscopie électronique, ou grilles EM, à 30 milliampères pendant 60 secondes. Refroidir le récipient en polystyrène avec de l’azote liquide et préparer l’éthane liquide dans une tasse métallique en condensant l’éthane gazeux dans une tasse métallique froide.

Diluer la protéine interagissant avec les microtubules en volume égal avec un tampon de dilution avant de l’appliquer sur les grilles pour abaisser la concentration cellulaire. Placez le mélangeur à 37 degrés Celsius. Utilisez un bloc métallique chaud dans une boîte isolante en polystyrène s’il n’y a pas de bloc chauffant près du dispositif de congélation.

Prenez une grille déchargée avec une pince à épiler et cliquez-les dans le congélateur. Placez le récipient en polystyrène avec de l’éthane liquide dans le congélateur et passez en revue le programme préparé. Tout d’abord, appliquez 3,5 microlitres de solution de microtubules sur la grille.

Laissez le congélateur plonger éponger la grille. Ensuite, appliquez immédiatement 3,5 microlitres de protéines diluées. Et enfin, laissez le piston éponger et plongez congeler la grille dans de l’éthane liquide.

Transférer les grilles dans une boîte de stockage de grille et les stocker dans un Dewar d’azote liquide jusqu’à l’imagerie. La qualité et la concentration des microtubules extraits ont été évaluées par un gel SDS coloré à Coomassie. Une droite de régression non linéaire des quantités relatives de BSA, dérivée de l’interpolation de la bande de microtubules autour de 50 kilodaltons dans la voie P2 avec la courbe BSA, indique une concentration finale de 1,42 milligramme par millilitre.

Cela correspond bien au nombre mesuré avec un spectrophotomètre par deux personnes. Les microtubules fraîchement extraits ont été utilisés pour fabriquer des échantillons cryo-EM. Les microtubules semblent intacts et abondants sur les micrographies.

La densité des microtubules par micrographie ne doit pas être trop élevée pour éviter que les microtubules ne se croisent. Les microtubules brisés indiquent que les microtubules sont dépolymérisés ou que la concentration de microtubules était trop dense. Les microtubules liés à MATCAP avaient des bords rugueux caractérisés par des points denses en électrons sur la surface des microtubules.

Les microtubules liés à MATCAP et non liés à MATCAP ont également pu être distingués dans les classes 2D calculées. La réalisation de grilles cryo-EM avec cette méthode peut permettre d’étudier la structure des microtubules liés à une protéine spécifique en interaction. Cela peut conduire à une meilleure compréhension des mécanismes de la biologie cellulaire structurale.