Préparation d’îlots fœtaux de primates non humains congelés pour le séquençage combiné de l’ARN à noyau unique et du séquençage ATAC, et la métabolomique en vrac
8 novembre 2024
Ce protocole décrit les procédures d’isolement de noyaux de haute qualité à partir d’îlots pancréatiques de primates non humains congelés pour une utilisation dans le séquençage simultané de l’ARN et le séquençage ATAC d’un seul noyau, tout en préservant la fraction cytosolique en vrac pour les analyses métabolomiques à partir des mêmes échantillons.
Nous utilisons un modèle de primate non humain hautement translationnel pour évaluer comment l’alimentation maternelle et la consommation de médicaments pendant la grossesse influencent le développement embryonnaire et la fonction postnatale des îlots pancréatiques chez la progéniture. Des changements programmés par le développement pourraient modifier la susceptibilité à la maladie plus tard dans la vie. Lorsque l’on travaille avec des échantillons difficiles à acquérir, tels que ceux provenant de primates non humains, il est difficile d’évaluer efficacement plusieurs questions provenant du même individu.
Malheureusement, l’extraction simultanée d’informations du métabolome et du génome peut être difficile en raison de l’incompatibilité des réactifs de dosage dans la dégradation sensible au temps des molécules à quantifier. Notre protocole permet l’extrapolation de l’abondance des métabolites, de l’accessibilité de la chromatine et de l’expression différentielle des gènes à partir du même matériel de départ. Cette approche à plusieurs niveaux donne un aperçu de la façon dont le métabolisme peut modifier le génome des îlots pancréatiques.
Aperçu
Ce protocole décrit des méthodes permettant d'isoler des noyaux de haute qualité à partir d'îlots pancréatiques de primates non humains congelés, afin de réaliser simultanément un séquençage ARN et un séquençage ATAC. Il préserve également la fraction cytosolique globulaire pour des analyses métabolomiques, permettant ainsi une compréhension approfondie des interactions métaboliques et génomiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie
- Métabolomique
Contexte
- Les modèles de primates non humains sont essentiels pour l'étude des mécanismes des maladies humaines.
- L'alimentation maternelle et les médicaments peuvent influencer le développement des îlots pancréatiques chez la descendance.
- L'analyse simultanée du métabolome et du génome est difficile en raison de la dégradation des échantillons.
- Cette étude répond au besoin d'analyses multiplex efficaces à partir d'échantillons limités.
Objectif de l'étude
- Évaluer l'impact des facteurs maternels sur le développement embryonnaire des îlots pancréatiques.
- Explorer la manière dont les changements métaboliques peuvent influencer l'expression génomique.
- Développer un protocole permettant une analyse complète à partir du même échantillon.
Méthodes utilisées
- Isolation de noyaux à partir d'îlots pancréatiques.
- Séquençage simultané de l'ARN et de l'ADN accessible (ATAC).
- Conservation des fractions cytosoliques pour des études métabolomiques.
- Analyse multicouche pour évaluer l'abondance des métabolites et l'expression génique.
Résultats principaux
- Isolation réussie de noyaux et de fractions cytosoliques de haute qualité.
- Apports de connaissances sur la manière dont l'alimentation maternelle affecte la fonction des îlots pancréatiques.
- Démonstration de la faisabilité d'analyses génomiques et métabolomiques simultanées.
- Mise en évidence de liens potentiels entre le métabolisme et l'expression génique dans les îlots.
Conclusions
- Ce protocole permet une analyse complète des îlots pancréatiques.
- Les résultats pourraient orienter les futures études sur la susceptibilité aux maladies.
- Mettre en évidence l'importance des influences maternelles sur la santé de la descendance.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'intégration de la séquence d'ARN monocellulaire (single-nucleus RNA-seq), de la séquence ATAC (ATAC-seq) et de la métabolomique globale à partir d'îlots de primates non humains congelés permet de surmonter un goulot d'étranglement critique dans la découverte multi-omique utilisant des échantillons rares ou précieux. Cette approche permet un profilage moléculaire complet à partir de matériel limité, renforçant la confiance prédictive dans la validation précoce des cibles et la réduction des risques mécanistiques. Le protocole maximise le rendement de données par échantillon, éclairant ainsi les décisions de portefeuille ajustées au risque dans la recherche sur les maladies métaboliques et développementales.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet d'interroger les mécanismes métaboliques et épigénétiques sous-jacents à l'identité cellulaire dans des systèmes pertinents pour les maladies.
- Prend en charge la validation fonctionnelle des cibles en associant l'abondance des métabolites à l'expression génique et à l'accessibilité de la chromatine.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en intégrant des données moléculaires multicouches provenant d'une même source biologique.
Développement de tests et criblage
- Prépare des fractions nucléaires et cytosoliques validées pour des applications en séquençage à haut débit et en métabolomique.
- Améliore la reproductibilité et la standardisation des tests en minimisant les effets de lot dans les études multicohortes.
- Permet des sorties quantitatives multi-omiques pour une évaluation robuste de composés ou d'altérations.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les réponses moléculaires avec des biomarqueurs métaboliques et épigénétiques pertinents pour la maladie dans des modèles translationnels.
- Permet une continuité du stade de découverte à la validation préclinique en exploitant des systèmes de primates non humains.
- Offre des perspectives prédictives sur les mécanismes de programmation du développement et de prédisposition aux maladies.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole relie la découverte précoce, la validation de cibles et la recherche translationnelle en permettant un profilage multi-omique à partir d'échantillons tissulaires rares.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur les interactions métaboliques-épigénétiques au cours du développement des îlots.
- Criblage : Fournit des préparations reproductibles de noyaux et de métabolites pour des tests omiques évolutifs.
- Analytique : Fournit des données quantitatives sur l'expression génique, l'accessibilité de la chromatine et l'abondance des métabolites pour des analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes moléculaires à des phénotypes pertinents pour la maladie dans des modèles de primates non humains.
- Réutilisation en entreprise : Établit un flux de travail réutilisable afin de maximiser l'extraction de données à partir d'échantillons limités ou archivés.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les recherches en phase précoce.
- Valeur opérationnelle : Standardise la préparation des échantillons multi-omiques et minimise les effets de lot.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions « aller/ne pas aller » plus éclairées et d'utiliser de manière économiquement efficace des échantillons rares.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des programmes sur les maladies métaboliques et développementales.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en isolement de noyaux, séquençage à l'échelle du noyau unique et protocoles de métabolomique.
- Exige un accès à une infrastructure de séquençage à haut débit et de spectrométrie de masse.
- Implique une standardisation rigoureuse entre équipes pour contrôler les effets de lot.
- Adaptable à d'autres types de tissus, mais peut nécessiter une optimisation du protocole selon les matrices d'échantillons.
- La rareté des échantillons et leur sensibilité à la dégradation imposent des limites pratiques en termes de débit et de chronologie.
