Préparation de Mycobacterium abscessus enrobé de perle de gélose pour inoculer des souris immunocompétentes par voie intratrachéale

Nous développons un modèle murin d’abcès chroniques de mycobactéries infection pulmonaire pour tester l’efficacité des antibiotiques dans des études précliniques. Le premier défi consiste à surmonter la résistance intrinsèque des souris aux abcès de mycobactéries. Le deuxième défi consiste à générer un lot reproductible de bactéries intégrées dans la gélose pour l’infection intratrachéale. Nous voulons partager un protocole détaillé de préparation de la gélose et de l’infection qui peut être facilement mis en œuvre par d’autres laboratoires pour tester de nouveaux médicaments chez la souris.

L’infection avec des bactéries incrustées dans le combat contre la gélose au lieu de bactéries libres surmonte partiellement la capacité des souris immunocompétentes à éliminer spontanément l’infection. Ce modèle fournit un outil préclinique robuste pour évaluer de nouveaux antibiotiques contre Mycobacterium abscessus, facilitant ainsi la découverte et le développement d’antibiotiques indispensables contre les infections pulmonaires.

[Instructeur] Pour commencer, obtenez des cultures en suspension de mycobacterium abscessus à croissance exponentielle ajustées à une densité optique de 30. Transférez 27 millilitres de vis de soja triptyque fondue pré-équilibrée à 50 degrés Celsius dans un tube contenant trois millilitres de suspension bactérienne. Mélanger la suspension par pipetage. Pipetez soigneusement le mélange de vis bactérienne dans un flacon contenant 60 millilitres d’huile minérale dans un flacon. Placez le ballon dans un récipient secondaire et commencez immédiatement à agiter à vitesse moyenne sur un brassage magnétique à l’aide d’une barre d’agitation magnétique. Assurez-vous qu’un vortex visible se forme dans le mélange de vis à huile et continuez à remuer pendant six minutes à température ambiante. Placez de la glace dans le récipient secondaire pour permettre à la suspension de refroidir. Transférez ensuite le mélange de boue dans des tubes à centrifuger de 250 millilitres. Centrifugez la suspension à 3 700 G pendant six minutes à quatre degrés Celsius pendant les cinq premiers cycles, puis remettez en suspension la pastille de perle de tarière avec du DPBS. Assemblez également une crépine de cellule d’entonnoir, une bague de connecteur et un tube de 50 millilitres en une seule unité. Après le 10e lavage, remettez le granulé en suspension et diluez la suspension de la bille quatre fois. Ajoutez le matériau de l’échantillon dilué dans la passoire pour filtrer la suspension de billes. Lentement, tirez sur le piston d’une seringue de 30 millilitres fixée à la bague de connexion pour créer une aspiration et améliorer la filtration. Centrifugez ensuite la suspension diluée à 1000 G pendant deux minutes pour la concentrer. Après avoir tiré les pastilles de perles dans un tube de 50 millilitres, conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine, mais préparez des billes fraîches pour chaque lot d’expériences. Pour commencer, immobilisez les souris CD 1 sous sédatif à l’aide d’un support tridimensionnel imprimé incliné conçu sur mesure. Fixez la souris par ses incisives à l’aide d’une corde de suture fixée à la tige centrale du support. Positionner la souris dans une posture couchée ventrale avec la tête levée. Fixez une aiguille d’alimentation animale en métal de calibre 24 à une seringue en verre remplie d’une suspension de perle de tarière de mycobacterium abscessus. Placez des clips ou des bouchons en nylon sur le piston pour assurer un volume d’inoculum contrôlé de 50 microlitres par souris. Maintenant, positionnez l’aiguille de gavage en métal verticalement au-dessus de la souris. Insérez délicatement l’aiguille par le haut et faites-la glisser plus bas dans la trachée. Retirez le clip ou le bouchon en nylon et distribuez lentement 50 microlitres de suspension de billes de tarière de mycobacterium abscessus dans les poumons. Laissez la souris reposer pendant cinq minutes. Ensuite, répétez la procédure d’inoculation une deuxième fois pour assurer un dépôt profond et reproductible de l’inoculum complet dans les poumons. Les billes de tarière contenant mycobacterium abscessus exprimaient la protéine fluorescente rouge cerise et variaient en taille d’environ 70 à 250 micromètres. La charge bactérienne sur six préparations de billes indépendantes a montré une grande reproductibilité. Le dénombrement des bactéries avant et après le passage à travers la seringue en verre n’a montré aucune perte significative de charge bactérienne. La méthode d’inoculation inter-trachéale était reproductible sur trois préparations de billes indépendantes, comme le montre le nombre d’UFC pulmonaires 24 heures après l’infection. La reproductibilité de l’infection entre trois opérateurs indépendants a été confirmée, car le nombre d’UFC pulmonaires 24 heures après l’infection est resté constant dans tous les groupes.