Séparation et caractérisation différentielle des vésicules extracellulaires microbiennes intestinales chez des rats sensibles au sel dans des conditions de régime riche en sel

Cette recherche explore le rôle des vésicules extracellulaires microbiennes intestinales chez les rats hypertendus sensibles au sel suivant un régime riche en sel, en examinant comment un régime riche en sel modifie les vésicules et influence les interactions hypertendues et immunitaires. Parmi les avancées récentes dans ce domaine, citons la compréhension du rôle des vésicules extracellulaires microbiennes intestinales dans l’hypertension, l’évaluation de l’impact des régimes riches en sel sur la diversité microbienne et la mise en œuvre d’interventions à base de plantes ciblant les vésicules de la régulation métabolique et immunitaire. Les défis expérimentaux actuels comprennent l’isolement des vésicules extracellulaires hautement prioritaires, la distinction entre les vésicules également dérivées des vésicules du microbiome, la minimisation de la perte d’échantillons dans les protocoles de teinture standard pour assurer la reproductibilité d’une étude à l’autre. Cette grille de densité et ce protocole de centrifugation accordent une priorité plus élevée aux vésicules extracellulaires avec une intégrité et une reproductibilité améliorées par rapport aux méthodes traditionnelles, ce qui permet une recherche plus fiable sur les vésicules extracellulaires du microbiome intestinal dans les études sur l’hypertension.

[Narrateur] Pour commencer, transférez cinq grammes d’excréments dans un tube à centrifuger pré-pesé de 50 millilitres. Ajoutez 50 millilitres de PBS préchauffé à 37 degrés Celsius sans endotoxines dans le tube et faites pivoter le tube pendant 30 minutes. Refroidissez la centrifugeuse à grande vitesse à 4 degrés Celsius. Ensuite, placez l’échantillon symétriquement dans la centrifugeuse et faites-le tourner à 8 000 G pendant 15 minutes. Après la centrifugation, aspirez le surnageant et transférez-le dans un nouveau tube à centrifuger stérile. Après une nouvelle centrifugation pendant 15 minutes, aspirez soigneusement le surnageant et utilisez-le pour une analyse plus approfondie. Placez une unité de filtre stérile de 0,22 micromètre sur de la glace. Transférez le surnageant sur le dessus du filtre et allumez la pompe à vide pour recueillir les échantillons filtrés. Transférez le filtrat dans un filtre centrifuge d’une coupure de 10 kilodaltons et d’une capacité de 15 millilitres. Centrifuger à 4 degrés Celsius 3000G pendant 30 minutes pour concentrer l’échantillon à au moins 1 400 microlitres. Placez immédiatement l’échantillon sur de la glace. Mélangez un volume de tampon de gradient A avec cinq volumes de milieu de gradient de densité pour préparer la solution de travail. Préparez une solution d’iodixanol à 10 % en mélangeant une unité de solution de travail avec quatre unités de tampon B. De même, mélanger deux unités de solution de travail avec trois unités de tampon B pour une solution d’iodixanol à 20 % et quatre unités de solution de travail avec une unité de tampon B pour une solution d’iodixanol à 40 %. Mélangez maintenant l’échantillon concentré préparé précédemment avec sept millilitres de milieu à gradient de densité pour obtenir une solution d’iodixanol à 50 %. Pour préparer un gradient de densité, ajoutez une solution de bleu de trypan aux solutions d’iodixanol à 40 % et à 10 %. Transférez huit millilitres de solution d’iodixanol à 50 % au fond d’un tube à centrifuger en polypropylène à paroi mince. Inclinez le tube à 70 degrés et transférez huit millilitres de solution d’iodixanol à 40 % à la surface du liquide. Ensuite, ajoutez huit millilitres de solution d’iodixanol à 20 %, suivis de sept millilitres de solution d’iodixanol à 10 % et de deux millilitres de PBS sans endotoxines. Prenez le tube à gradient de densité préparé et placez-le dans une ultracentrifugeuse pré-refroidie. Réglez les paramètres d’ultracentrifugation sur 100 000 G 20 heures et 10 degrés Celsius et démarrez le cycle. Pour la séparation manuelle de la densité du gradient pour la collecte, le gradient de densité est d’environ 34 millilitres de liquide. Deux millilitres de solution sont lentement extraits du centre de la surface du liquide, et chaque solution de deux millilitres est un gradient. Ainsi, la solution du gradient de densité est divisée en 17 gradients. Enfin, à l’aide d’une pipette, transférez les fractions de densité dans des tubes d’échantillon stériles et placez-les immédiatement sur de la glace. L’analyse du suivi des nanoparticules a révélé la taille, la distribution et les profils de concentration des vésicules extracellulaires collectées à partir de différentes fractions de gradient de densité. La majorité des vésicules extracellulaires de toutes les fractions étaient concentrées dans la gamme de tailles de 30 à 100 nanomètres, suivant un modèle de distribution typique. La concentration de vésicules extracellulaires a atteint son niveau le plus élevé dans la fraction neuf, culminant à environ 3,85 fois 10 à la puissance neuf particules par millilitre. La teneur en protéines, mesurée à l’aide d’un kit d’acide bicinchoninique, était également la plus élevée dans la fraction neuf, à 0,417 microgramme par microlitre. De plus, les niveaux d’expression des lipopolysaccharides, déterminés à l’aide d’un kit de détection d’endotoxines, étaient significativement élevés dans les fractions neuf et 10. De plus grandes quantités de protéines ont également été observées dans la fraction neuf lors de l’analyse par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium polyacrylamide. La microscopie électronique à transmission, ou images MET, a révélé que les vésicules extracellulaires possédaient une morphologie circulaire semblable à une membrane.