Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
בתחילת המאהה-20, דלקת ריאות הייתה אחראית לחלק גדול ממקרי המוות ממחלות זיהומיות1. על מנת לפתח חיסון יעיל נגד דלקת ריאות, פרדריק גריפית יצא לחקור שני זנים שונים של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס: זן לא אלים עם מראה מחוספס (זן R) וזן אלים עם מראה חלק (זן S) עקב קפסולת פוליסכריד חיצונית2. שכבה חיצונית זו של החיידקים מזן S אפשרה להם לעמוד בפני מערכת החיסון המארחת, מה שהוביל בסופו של דבר למחלה מסכנת חיים. כאשר גריפית' הזריק בנפרד לעכברים חיידקים מומתי חום משני הזנים, העכברים חיו. עם זאת, כאשר הוא הזריק לעכברים שילוב של זן S שנהרג בחום עם זן R חי, העכברים מתו2. כאשר הוא ניתח את הדגימות שהתקבלו מעכברים מתים שהוזרקו להם השילוב, הוא הבחין בנוכחות חיידקים חיים מזן S. בשנת 1928 ציין גריפית' כי חייב היה להתרחש תהליך "טרנספורמציה" כדי לשנות את החיידקים הלא אלימים לזן האלים. כתגלית הידועה הראשונה של טרנספורמציה חיידקית, תגליתו סללה את הדרך לפיתוח כלי חיוני בהנדסה גנטית - טרנספורמציה3.
טרנספורמציה היא השינוי הגנטי בתא עקב צריכת DNA מהסביבה. בניסוי של גריפית', הדנ"א המקודד את ציפוי הרב-סוכר המגן של החיידק מזן S לא התפרק מהלם החום והוכנס לזן R, מה שמאפשר לאחרון לעקוף את המערכת החיסונית של העכבר. בעוד תהליך זה מתרחש כל הזמן בטבע בין אורגניזמים ואפילו מינים שונים, מדענים משנים חיידקים בסביבות מעבדה למטרות מחקר4.
חיידקים הם האורגניזמים האידיאליים לטרנספורמציה מכיוון שהם יכולים בקלות לקלוט חומר גנטי אקסוגני לתוך הגנום שלהם ולהגביר אותו במהירות3,5. יש להם כרומוזום מעגלי אחד ומספר חתיכות עגולות קטנות של דנ"א דו-גדילי הנקראות פלסמידים בתוך הציטופלסמה. פלסמידים אלה יכולים להשתכפל באופן עצמאי מה- DNA הכרומוזומלי ובדרך כלל מספקים יתרונות פונקציונליים מסוימים, כגון עמידות לאנטיביוטיקה6,7. בסביבתם הטבעית, חיידקים עוברים "טרנספורמציה חיידקית" על-ידי קליטת פלסמידים מחיידקים אחרים בתהליך שנקרא צימוד8. יתר על כן, כאשר הם מתרבים, כל אחד מצאצאיהם מקבל עותק של הפלסמיד החדש.
פלסמידים המשמשים למטרות ניסוי נקראים וקטורי פלסמיד. בתנאי מעבדה, מדענים יכולים ליצור באופן מלאכותי "פלסמידים רקומביננטיים" שאורכם כ-5,000-10,000 זוגות בסיסים על-ידי החדרת מקטעי דנ"א לווקטור פלסמיד. לפלסמידים רקומביננטיים אלה יש בדרך כלל מרכיבים מסוימים: מקור השכפול (ORI), גן עמידות לאנטיביוטיקה, אתר שיבוט מרובה, מקדם, סמן ברירה וגן המעניין. מקור השכפול הוא המקום שבו מתחיל השכפול. הגן לעמידות לאנטיביוטיקה מאפשר לחיידקים שקולטים את הפלסמיד לשרוד על צלחות בנוכחות תרופה אנטיביוטית מסוימת. אף על פי שפלסמידים הם פיסות דנ"א קטנות יחסית, מדענים צריכים לטפל בתאים המארחים כדי לאפשר את חדירת הפלסמיד דרך קרום התא. לפיכך, יעילות השינוי קשורה ישירות לנקבוביות של קרום המארח. גישה נפוצה אחת היא לחשמל בחום את החיידקים שטופלו בתמיסת סידן כלורי9. החיידקים שאינם משלבים את הפלסמיד לא ישתנו, ולכן אין להם התנגדות לשרוד על הצלחת ולהיות גלויים. אתרי השיבוט המרובים מסייעים בהחדרת DNA על ידי הכלת אתרים לאנזימי הגבלה לחיתוך הפלסמיד שבו ניתן להחדיר ולקשור את הגן המעניין. המקדם מניע שעתוק של הגן המעניין. הוא מתויג על ידי סמן, בדרך כלל חלבון פלואורסצנטי כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), או יכול להיות גן נוסף עמידות לאנטיביוטיקה. גן העמידות לאנטיביוטיקה וסמני הבחירה האחרים עוזרים לנו לקבוע אם החיידקים שנאספו מכילים את הפלסמיד המעניין.
שיטות טרנספורמציה יעילות אפשרו למדענים לבודד וליצור פרופיל של גנים ותוצרי גנים והובילו לפיתוחים רבים במדעי החיים וברפואה, כגון פיתוח תרופות יעילות, יצירת גידולים מהונדסים גנטית וכלי אבחון מתקדמים10. בנוסף, עם ההתקדמות הטכנולוגית, שיטות חדשות של טרנספורמציה התפתחו. לדוגמה, שיבוט שער מאפשר החדרה של מקטעי דנ"א מרובים לווקטורים שונים וכן העברת רצפי DNA בין פלסמידים11. יתר על כן, Clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 היא טכניקת עריכת גנים המשנה ישירות נוקלאוטידים בגנום ואינה דורשת שימוש בפלסמידים12. לאחר הטרנספורמציה, חוקרים לעתים קרובות מבודדים ופרופיל את הגן המעניין ואת תוצריו. לאחר מכן, כל תהליך השיבוט הגנטי פתח תחום חדש של מניפולציה גנטית. הודות לשיבוט גנטי, חוקרים יכולים לתמרן חיידקים כדי לייצר כמויות גדולות של חלבונים אנושיים ספציפיים, כגון אינסולין לטיפול בחולי סוכרת10. לשיבוט יש חשיבות רבה גם בחקלאות המודרנית. אורגניזמים מהונדסים גנטית (GMO) הם תוצאה ישירה של שיבוט גנטי וטרנספורמציה חיידקית10. לדוגמה, מדענים פועלים ליצירת יבולים מהונדסים גנטית עם גנים מקבעי חנקן המשולבים בגנום שלהם כדי להגביר את ייצור המזון ולהפחית את השימוש בדשנים, ובכך להפחית את ההשפעה הכלכלית והסביבתית של דשנים13. לסיכום, טרנספורמציה חיידקית היא הצעד הראשון של הביוטכנולוגיה המודרנית והבסיס לתגליות מחקר עתידיות.
בתחילת המאה ה-20, בקטריולוג בריטי בשם פרדריק גריפית' עבד עם החיידק הגורם לדלקת ריאות Streptococcus pneumoniae. הוא ביצע ניסוי פשוט באמצעות שני זנים שונים. זן אחד ידוע בשם זן S בגלל קפסולת הגנה שגורמת למושבות או לגושים שהוא יוצר להיראות חלקים, וגם הופכת אותו לאלים או מזיק. השני היה זן R, גרסה של החיידק חסר קפסולת המגן, מה שמעניק למושבות מראה מחוספס והופך אותו ללא אלים.
ראשית, גריפית' לקח חלק מהחיידקים של זן S וחימם אותם, ויצר גרסה מוהמתת בחום של זן S. לאחר מכן, הוא אסף כמה עכברים וחילק אותם לארבע קבוצות. הוא הזריק לקבוצה הראשונה את זן ה-S האלים, ולשנייה את זן ה-R הלא-אלים. הוא נתן לקבוצה השלישית מינון של זן S שנהרג בחום, ולבסוף, שילב את זן ה-S המומת בחום ואת זן ה-R יחד, והזריק את התערובת הזו לקבוצה הרביעית. כצפוי, העכברים בקבוצה הראשונה מתו, ואלה בקבוצה השנייה והשלישית חיו. אך להפתעתו של גריפית', העכברים בקבוצה האחרונה מתו גם הם.
כשפרסם את מחקרו ב-1928, הוא קרא לתהליך המסתורי הזה טרנספורמציה, שכן הוא שיער את קיומו של עיקרון טרנספורמציה בסיסי, שאיפשר לזן שקודם לכן לא היה אלים להפוך לקטלני. מאוחר יותר, ב-1943, דיווחו אוורט, מקלאוד ומקארתי כי עיקרון הטרנספורמציה הזה הוא ככל הנראה חומצה דסוקסיריבונוקלאית, או DNA, שכיום אנו יודעים שהוא חומר התורשה. בעיקרו של דבר, מה שקרה בניסוי של גריפית' היה שכאשר החיידקים שולבו, חלק מהדנ"א דלף מזן ה-S שנהרג בחום לתוך תאי הזן R, והפך את החיידקים הלא-אלימים הללו והעביר את המידע ליצירת קפסולת המגן, מה שהופך את זן ה-R לזן אלים, המסוגל כעת להרוג את בעלי החיים בקבוצה הרביעית.
מהר קדימה להיום, מדענים פיתחו דרך הרבה יותר פשוטה לחקור טרנספורמציה חיידקית, באמצעות החיידקים E. coli ולולאות מעגליות קטנות של דנ"א שנקראות פלסמידים. בדרך כלל, הפלסמיד המשמש בניסויי טרנספורמציה כולל גן לפונקציה מיוחדת, כמו עמידות לאנטיביוטיקה. E. coli הם נושא מצוין לטרנספורמציה מכיוון שהם יכולים להציג תכונה שנקראת יכולת, היכולת לקלוט DNA מהסביבה. בעיקרו של דבר, משמעות הדבר היא שבתנאים סביבתיים מסוימים, כמו כימיקל או הלם חשמלי או הלם חום, דופן התא של E. coli יכולה להפוך לחדירה זמנית ולאפשר קליטה של דנ"א מהסביבה. ברגע שהפלסמיד נמצא בתוך E. coli, הוא יכול להסתובב בציטופלזמה של התא המארח החדש שלו ולהיות משוכפל ולבוא לידי ביטוי לאורך דורות לצד הגנום, או שהוא עשוי לשלב את עצמו במלואו בגנום של המארח. אם החיידקים מאבדים את הפלסמיד בשלב כלשהו, התא יאבד גם את עמידותו לאנטיביוטיקה, ולכן מדענים מגדלים את החיידקים במדיה המכילה את האנטיביוטיקה כדי להבטיח שהשורדים היחידים הם אלה המכילים את הפלסמיד המעניין.
במעבדה זו תלמדו כיצד להתמיר תאי E. coli עם פלסמיד המכיל גן עמידות לאנטיביוטיקה, תוך תרגול טכניקות מיקרוביולוגיות סטריליות.
