15.13: DNA משלים

סקירה כללית

רק גנים המשועתקים ל-RNA שליח (mRNA) פעילים, או מתבטאים. מדענים יכולים, אם כן, לחלץ את ה-mRNA מתאי כדי לחקור ביטוי גנים בתאים ורקמות שונות. המד Scientist ממיר mRNA ל-DNA משלים (cDNA) באמצעות שעתוק הפוך. מכיוון ש-mRNA אינו מכיל אינטרונים (אזורים שאינם מקודדים) ורצפים רגולטוריים אחרים, cDNA בניגוד ל-DNA גנומי מאפשר לחוקרים לקבוע ישירות את רצף חומצות האמינו של הפפטיד המקודד על ידי הגן.

סינתזת cDNA

ניתן ליצור cDNA במספר שיטות, אך דרך נפוצה היא תחילה לחלץ RNA כולל מהתאים, ולאחר מכן לבודד את ה-mRNA מהסוגים השולטים יותר RNA מעביר (tRNA) וריבוזום (rRNA). ל-mRNA איקריוטי בוגר יש זנב פולי(A) מחרוזת נוקלאוטידים של אדנין שנוספו ל-3 הקצה שלו, בעוד שסוגים אחרים של RNA אינם. לכן, מחרוזת של נוקלאוטידים של תימין (oligo-dTs) יכולה להיות מחוברת למצע כגון עמודה או חרוזים מגנטיים, כדי להתאים ספציפית לבסיס עם זנבות הפולי(A) של mRNA. בעוד mRNA עם זנב poly(A) נלכד, סוגי ה-RNA האחרים נשטפים.

לאחר מכן, אנזים DNA פולימראז עובר שעתוק במהופך (רוורס טרנסקריפטאז ) מנגיפי רטרו ליצירת cDNA מה-mRNA. מכיוון שכמו רוב הפולימראזות של DNA, שעתוק במהופך יכול להוסיף נוקלאוטידים רק לקצה ה-3 של השרשרת, מתווסף פריימר פולי(T) שייקשר לזנב הפולי(A) כדי לספק נקודת מוצא לסינתזת cDNA. גדיל cDNA מסתיים ב-pinhead loop. לאחר מכן ה-RNA מפורק בדרך כלל עם טיפול אלקלי או אנזימי RNase ומותיר את ה-cDNA החד-גדילי ללא פגע.

גדיל DNA שני משלים ל-cDNA מסונתז על ידי DNA פולימראז, לעתים קרובות תוך שימוש ב- pinhead loop של גדיל ה-cDNA הראשון או חתיכה מחורצת של ה-mRNA בתור ראשוני .

ניתן להחדיר את ה-cDNA הדו-גדילי המתקבל לוקטורים חיידקיים או ויראליים ולשבט אותו באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות. ניתן גם לבנות ספריית cDNA המייצגת את כל ה-mRNA בתאים או ברקמה המעניינים למחקר נוסף.