Why is monosodium phosphate an effective buffer near pH 7?

Monosodium phosphate is effective near pH 7 because its pKa range is 6.8 to 7.2, which overlaps with the target pH. Buffers are most effective close to their pKa, where the weak acid and conjugate base are present in significant concentrations. This allows the buffer to resist pH changes when small amounts of acid or base are added.

What is the role of NaOH when preparing a monosodium phosphate buffer?

NaOH is added drop-wise to shift the equilibrium toward the conjugate base, disodium phosphate, without altering the overall buffer composition. Unadjusted monosodium phosphate solutions typically have a pH of 4–6, so NaOH raises the pH to the target value of 7.0 while maintaining the buffer's capacity to resist pH changes.

How do the protonated and deprotonated forms of neutral red differ in color and light absorption?

The protonated form of neutral red is red and absorbs green light, while the deprotonated form is yellow-orange and absorbs blue-violet light. These distinct absorption wavelengths allow researchers to track the ionization state of neutral red across different pH values using absorption spectroscopy.

How does protein binding affect the properties of neutral red?

Protein binding alters both the absorbance and pKa of neutral red. When riboflavin-binding protein binds to neutral red, the pKa increases by approximately one unit, indicating that bound-protonated neutral red is a weaker acid than free protonated neutral red by an order of magnitude.

What is the isosbestic point in an absorption spectrum?

The isosbestic point is the wavelength where all absorption spectra cross at a single point, regardless of pH. Recording this wavelength helps verify data quality and indicates a clean transition between the protonated and deprotonated forms of neutral red across the pH range tested.

How do you determine the pKa of neutral red from absorbance data?

Plot absorbance intensity at lambda max versus pH for both free and bound neutral red. Calculate the midpoint between the highest and lowest absorbance values, then find the pH at which this midpoint occurs on the plotted line. That pH value is the pKa of the compound.

Why is it important to handle cuvettes correctly during spectrophotometry?

Cuvettes must be held by their textured sides and have transparent sides wiped clean before measurement to ensure accurate absorbance readings. The transparent sides must align with the spectrophotometer's light beam. Proper handling prevents fingerprints and contamination that would interfere with light transmission and distort results.

מאגרי

מושגים הכנת המדריך נוהל לתלמידים

0 צפיות04:35 דק׳

מאגרים הם פתרונות הפועלים לשמירה על pH קבוע במערכת ללא קשר לתוספת של חומצות חזקות או בסיסים. בהיעדר חוצצים, תוספת של חומצה חזקה או בסיס לתמיסה משנה את ה- pH באופן משמעותי. חוצצים הם קריטיים בחיי היומיום. לדוגמה, הדם פועל כחיץ והוא מסוגל לשמור על pH בין 7.35 ל 7.45 מאז pH מעל 7.8 או מתחת 6.8 יכול לגרום למוות.

אז איך עובד חיץ? חיץ הוא למעשה חומצה או בסיס חלש ובסיסו המצומד או החומצה שלו בשיווי משקל זה עם זה. קחו, למשל, חיץ עשוי חומצה אצטית ונתרן אצטט. תמיסת החיץ מכילה חומצה חלשה ומלח מצומד שלה, אשר מתנתק ליצירת אצטט בסיס מצומד. התמיסה היא חומצית מכיוון שה-K_a של חומצה אצטית גבוה מה-K_b של הבסיס המצומד.

זכור כי קבוע הדיסוציאציה, K_a או K_b, מגדיר את חוזק החומצה או הבסיס, בהתאמה, שכן הוא קבוע שיווי המשקל לדיסוציאציה של התרכובת במים. קבוע הדיסוציאציה יכול להיות מיוצג גם כ-pK_a, או היומן השלילי של K_a, כאשר ככל שה-pK_a קטן יותר, כך החומצה חזקה יותר. כנ"ל לגבי pK_b, שם ככל שה-pK_b קטן יותר, כך הבסיס חזק יותר.

אם נחזור למאגר האצטט, אם נוסיף בסיס חזק, כמו נתרן הידרוקסידי, יוני ההידרוקסיד יגיבו עם יוני ההידרוניום הנמצאים בתמיסה. זה גורם ליותר חומצה אצטית להגיב עם מים כדי לחזור לשיווי משקל, ובכך ליצור יותר יוני הידרוניום. אם נוסיף חומצה חזקה, כמו חומצה הידרוכלורית, נוצרים יותר יוני הידרוניום בתמיסה. יונים אלה מגיבים עם יוני אצטט ליצירת חומצה אצטית נוספת. בשני המקרים, יש שינוי קטן מאוד ב- pH של התמיסה.

זכור שלכל מאגר יש טווח pH ספציפי שבו הוא יכול לאגור פתרון. כאן אנו מראים עקומת טיטרציה עבור מאגר החומצה האצטית שלנו. טווח האגירה מסומן. אזור זה נקבע על ידי משוואת הנדרסון-האסלבלך, שאומרת לנו שה- pH של החיץ נקבע על ידי K_a של החומצה החלשה והיחס בין הבסיס המצומד לחומצה החלשה.

הרחק מה- pH הזה, החומצה החלשה או הבסיס של החיץ מתרוקנים, והוא אינו יכול לחצוץ pH. לכן, בעת בחירת מאגר עבור היישום שלך, בחר אחד שה- pK_a שלו קרוב ל- pH הרצוי.

לבסוף, לכל המאגרים יש גבול ליכולת האגירה שלהם, כלומר כמות החומצה או הבסיס שניתן להוסיף לתמיסת החיץ לפני שה- pH משתנה באופן משמעותי. לדוגמה, אם נוסיף יותר מדי חומצה לתמיסת חיץ החומצה האצטית והנתרן אצטט שלנו, נבצע פרוטונציה של כל יוני האצטט ונצבור יוני הידרוניום רבים, ובכך נוריד את רמת החומציות.

באופן דומה, אם נוסיף יותר מדי בסיס, נפרק את כל החומצה האצטית ונצבור הרבה יוני הידרוקסיד, ובכך נגדיל את ה- pH. לפיכך, יכולת האגירה מושפעת מריכוז החומצה החלשה והמלח המצומד. לכן, למאגר אצטט מולארי 1 יש יכולת אגירה גבוהה יותר מאשר למאגר אצטט מולארי 0.1.

במעבדה זו תכינו ותבחנו מאגרים עם מגוון רחב של טווחי pH. לאחר מכן תשתמש במאגרים שלך כדי לקבוע את ה- pK_a של מחוון pH, הנקרא אדום נייטרלי, ולחקור את השינוי ב- pK_a של אדום נייטרלי כאשר חלבון קושר ריבופלבין מוצג.

Print Procedure Steps

מקור: סמאא קורים באוניברסיטת ג'ונס הופקינס, MD, ארה"ב

הכנת 50 mM NaH₂PO₄ Buffer, pH 7

בחלק הראשון של ניסוי זה, תכינו תמיסת נתרן פוספט ב-pH 7.0. מונוסודיום פוספט הוא חומצה חלשה עם הבסיס המצומד, דיסודיום פוספט. פתרונות מונוסודיום פוספט לא מותאמים בדרך כלל יש pH של כ 4 - 6.

המאגרים יעילים ביותר קרוב ל-pKa שלהם, שהוא 6.8 עד 7.2 עבור מונוסודיום פוספט. לכן, תשתמש ב- NaOH כדי לדחוף את שיווי המשקל לכיוון הבסיס המצומד מבלי לשנות את ההרכב הכולל של שיווי משקל החיץ.

לפני תחילת הניסוי, חשב את המסה של פוספט מונוסודיום כי תצטרך לעשות 200 מ"ל של פתרון 50 mM.

טבלה 1: הכנת 50 mM NaH₂PO₄ Buffer, pH 7.0

מסה מולרית של NaH₂PO₄ = 119.98 g/mol
נפח תמיסה (מ"ל)	200
מולאריות (mM)	50
שומות של NaH₂PO₄ (mol)
מסה דרושה (מ"ג)
נפח התחלתי של 1 M NaOH (מ"ל)
נפח סופי של 1 M NaOH (מ"ל)
נפח NaOH בשימוש (מ"ל)
נפח המים הדרוש DI (מ"ל)

לחץ כאן להורדת טבלה 1

כדי להתחיל, לבשו את ציוד המגן האישי הדרוש, כולל מעיל מעבדה, משקפי בטיחות עמידים בפני התזות וכפפות. הערה: חלק זה של המעבדה משתמש ב-NaOH, שהוא חומר מאכל ורעיל. יש לנקוט משנה זהירות בעת מזיגה והובלה של NaOH.
מלאו בקבוק שטיפה מפלסטיק בנפח 250 מ"ל במים נטולי יונים.
תייגו שתי כוסות של 100 מ"ל, אחת לפסולת מימית ניטרלית ואחת לפסולת מימית בסיסית.
כייל את מד ה- pH שלך באמצעות המאגרים שסופקו. אחסן את הבדיקה בפתרון האחסון שלה כשתסיים.
Tare נייר שקילה, והשתמש במרית נקייה כדי למדוד את הכמות הנדרשת של מונוסודיום פוספט על פי החישובים שלך. רשום את הכמות המדויקת של מונוסודיום פוספט במחשב המעבדה שלך. הערה: מונוסודיום פוספט סופג לחות מהאוויר, לכן עבוד במהירות כדי לקבל מדידה מדויקת וסגור את המיכל היטב כשתסיים איתו.
מניחים את המונוסודיום פוספט במיכל של 400 מ"ל ומנקים את המרית עם מגבון מעבדה. זרקו את נייר השקילה ואת מגבון המעבדה לפני שתחזרו למכסה האדים.
השתמש בגליל מדורג כדי למדוד 175 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה. יוצקים את המים לתוך של פוספט מונוסודיום ומוסיפים חטיף ערבוב מגנטי.
מערבבים את התמיסה עד שהמלח נמס לחלוטין והתמיסה נראית הומוגנית. זה בדרך כלל לוקח 2 - 3 דקות.
למדוד 15 מ"ל של מים deionized ולשפוך אותו לתוך הכד. ממשיכים לערבב את התמיסה עד שהיא נראית שוב הומוגנית (כדקה – 2 דקות). כבה את מנוע הערבוב.
שטפו את בדיקת ה-pH במים שעברו דה-יוניזציה, ולאחר מכן הדקו אותה בתמיסה עם החיישן שמעל מוט הערבוב.
הביאו גליל מדורג של 10 מ"ל וצפו בזכוכית למכסה המנוע ומדדו 10 מ"ל של 1 M NaOH. שים לב לנפח המדויק בצילינדר המדורג.
כסו את ה-NaOH שלכם בזכוכית השעון, והביאו אותו בזהירות למכסה המנוע שלכם.
המשך ערבוב תמיסת מונוסודיום פוספט. תוך כדי מעקב אחר קריאת ה-pH, השתמשו בפיפט חד פעמי כדי להוסיף באיטיות NaOH לתמיסת הערבוב בצורה טיפתית. ברגע שה-pH של החיץ מגיע ל-7.0, החזירו כל NaOH שעדיין נמצא בפיפטה לצילינדר המדורג.
חשב את עוצמת הקול של NaOH שהוספת למאגר. הפחת נפח זה מ- 10 מ"ל כדי לקבוע כמה מים נטולי יונים, עליך להוסיף למאגר שלך כדי להגיע לנפח תמיסה כולל של 200 מ"ל.
מדדו את המים שעברו דה-יוניזציה עם גליל מדורג נוסף של 10 מ"ל והוסיפו אותו לתמיסת הערבוב כדי לסיים את יצירת החיץ.
שטפו את חיישן ה- pH במים שעברו דה-יוניזציה, כסו אותו במכסה המלא בתמיסת האחסון ונתק או כבה את הבדיקה.
תייגו בקבוק פוליאתילן בנפח 250 מ"ל כמאגר מונוסודיום פוספט '50 mM, pH 7.0'. שלפו את מוט הערבוב המגנטי מהתמיסה.
השתמש במשפך כדי לשפוך את תמיסת החיץ לתוך הבקבוק המסומן ולסגור אותו היטב.

ספקטרוסקופיית קליטה של מחלקה אדומה < נייטרלית חופשית ומאוגדת="הרחב">הרחב
ניתן להשתמש במאגרים כדי להעריך תרכובות בערכי pH ספציפיים. בסעיף זה, תתעד את ספקטרום הספיגה של המחוון אדום נייטרלי במאגרים שונים. הצורה הפרוטונית של אדום נייטרלי היא אדומה, והצורה המפורקת היא צהובה-כתומה, כלומר הם בולעים אור ירוק וכחול-סגול, בהתאמה. לפיכך, לצורות החומציות והבסיסיות יש אורכי גל בליעה שונים. קשירת חלבון משנה את התכונות של אדום נייטרלי, ומשנה הן את ספיגתו והן את ה- pKa שלו.

לאחר מדידת ספקטרום הספיגה של אדום נייטרלי חופשי במספר ערכי pH, תוסיפו חלבון קושר ריבופלבין, או RP, לתמיסות ותמדדו שוב את הספיגות שלהן. עוצמת הספיגה קשורה לריכוז, ולכן תשתמש בספקטרום כדי לקבוע את ה- pKa של אדום נייטרלי חופשי וקשור לאחר המעבדה.
- צייר את הטבלה הבאה במחברת המעבדה שלך. ספרו את הקוביטות 1 עד 10 ורשמו את תשעת ערכי החומציות של המאגר שבהם תשתמשו. הקובט העשירי יהיה ריק מים נטולי יונים. הערה: תמיד להחזיק cuvettes על ידי הצדדים מרקם לנגב את הצדדים השקופים ממש לפני לשים את cuvette לתוך ספקטרופוטומטר. זכרו ליישר את הצדדים השקופים עם קרן האור בספקטרופוטומטר.
  טבלה 2: ספיגה של אדום נייטרלי חופשי וכבול
  
  Cuvette # Buffer pH Abs. at λ_max(Free NRH⁺) Abs. at λ_max (Bound NRH)
  1 5.0
  2 5.5
  3 6.0
  4 6.5
  5 7.0
  6 7.5
  7 8.0
  8 8.5
  9 11
  10 blank
  לחץ כאן להורדת טבלה 2
- השג עשר קוביות וכובעים של 1.5 מ"ל ותייג את האותיות 1 עד 10 כך שיתאימו לטבלה במחשב המעבדה שלך.
- תייגו של 25 מ"ל כ-'DIH2O' ומלאו אותה במים שעברו דה-יוניזציה.
- שטפו את הפסולת המימית הניטרלית שלכם במורד הניקוז ותייגו מחדש את הכד כ'פסולת חיץ מימית'.
- תייגו של 400 מ"ל עבור קצות מיקרופיפטה משומשים.
- חבר קצה למיקרופיפטה של 1 מ"ל והשתמש בה כדי לפלוט 1000 μL של מים שעברו דה-יוניזציה לקובט 10. זהו ריק הממס שלך.
- מקם 925 μL של חיץ ה- pH 7.0 מונוסודיום פוספט שלך בקובט 5.
- הבא את הקוביות הריקות הנותרות לשולחן החיץ. מונחה על ידי הטבלה במחשב המעבדה שלך, לחלק 925 μL של כל חיץ לתוך הקובטה המתאימה באמצעות micropipettes המסומן. היזהר לא להשתמש באותו קצה פיפטה עבור מאגרים שונים.
- לאחר שתסיים, החזר את המאגרים לשולחן העבודה שלך. שם, הגדר מיקרופיפטה של 200 μL כדי להוציא 75 μL, וחבר קצה למיקרופיפטה.
- יש לחלק 75 μL של אדום נייטרלי לכל אחת מתשע קוביות החיץ. הפוך כל קובטה מספר פעמים כדי לערבב היטב את התמיסות. הערה: החלף את קצה פיפטה אם הוא נוגע בחיץ.
- לאחר שערבבת אדום נייטרלי עם כל חיץ, צלם תמונה או רשום את צבעי הפתרונות.
- הפעל ספקטרופוטומטר ידני ואפשר למקור האור להתחמם. ברגע שהוא מוכן, צור ניסוי חדש למדידת בליעה לעומת אורך גל עבור האדום הנייטרלי החופשי.
- הכנס את הקובטה של מים שעברו דה-יוניזציה וקבל ספקטרום של המים שעברו דה-יוניזציה. הגדר אותו כרקע ממס או ריק.
- לאחר מכן, הסר את הריק והכנס את הקובטה של אדום נייטרלי במאגר ה- pH הנמוך ביותר, שיהיה בעל הריכוז הגבוה ביותר של אדום נייטרלי פרוטוני.
- רכשו ספקטרום, שאמור להראות שיא אחד חזק. זהה את אורך הגל המתאים לנקודה הגבוהה ביותר של שיא זה, או למקסימום. הקלט אורך גל זה במחשב המעבדה שלך כ- lambda max לקבלת פרוטונים חופשיים בצבע אדום נייטרלי.
- שמור את הנתונים והסר את cuvette. רשום את הספיגה במחשב הנייד שלך, ולאחר מכן אסוף ספקטרום עבור קוביות 2 - 9 באותו הליך.
- הקלט את אורך הגל של הנקודה האיזוסבסטית במחשב המעבדה שלך. זה המקום שבו כל הספקטרום חוצה באורך גל אחד. אם ספקטרום אינו חוצה בשלב זה, רוקנו ונקו את הקוביה, הכינו דגימה טרייה ונסו שוב.
- לאחר שתסיים לאסוף ספקטרום עבור כל תשע הקוביות, שמור וייצא את הנתונים.
- צור ניסוי חדש למדידת בליעה לעומת אורך גל עבור אדום נייטרלי כבול
  .
- התאימו קצה חדש למיקרופיפטה של 200 μL והוסיפו 75 μL של תמיסת חלבון קושרת ריבופלבין לכל קובטה, כולל החסר. מוציאים את הקצה, מאבטחים את פקקי הקובט והופכים את הקובט מספר פעמים כדי לערבב את התמיסות.
- הכנס קובטה 10 לתוך הספקטרופוטומטר והגדר אותו כריק הממס.
- רכשו ספקטרום של דגימת ה-pH הנמוכה ביותר, וזהו את אורך הגל המתאים למקסימום של הפסגה החזקה ביותר. רשום אותו במחשב המעבדה שלך כ-lambda max של אדום נייטרלי כרוך פרוטונים.
- רכוש ספקטרום עבור cuvettes 2 - 9 באותו אופן שבו עשית עבור דגימות אדומות ניטרליות חופשיות. רשום את העוצמות ב- lambda max עבור אדום נייטרלי הקשור לפרוטונים בטבלה שלך, יחד עם אורך הגל בנקודה האיזוסבסטית.
- כשתסיים, שמור את הנתונים שלך, ייצא אותם לניתוח מאוחר יותר וכבה את הספקטרופוטומטר.
- הניחו בצד את כל הציוד והשליכו את קצות הפיפטה המשומשים שלכם למיכל פסולת מאושר או לפח אשפה.
- רוקנו את הקוביטות לתוך פסולת החיץ המימית ושטפו את הקוביטות לתוך הכד במים שעברו דה-יוניזציה.
- רוקנו את עודפי ה-NaOH לפסולת הבסיסית ושטפו את הגליל המדורג במים.
- שטפו את הפסולת המימית הבסיסית במורד הניקוז במי ברז בשפע, יחד עם פסולת מימית אחרת.
- שטפו את כלי הזכוכית, כובעי הקוביות ומוט הערבוב בהתאם לנהלים הסטנדרטיים במעבדה. נקו את משטחי העבודה שלכם עם מגבת נייר לחה והשליכו מגבות נייר משומשות ומגבוני מעבדה לפח המעבדה.
Results
כעת, בואו ננתח את נתוני הספיגה שלנו כדי לקבוע את רמת ה-pKa של אדום נייטרלי.

טבלה 3: קביעת pKa's אדום נייטרלי

NRH⁺ חינם NRH⁺ כרוך
λ_{מקסימום} (NM)
ΔA (ננומטר)
נקודת אמצע (nm)
pKa

לחץ כאן להורדת טבלה 3
- התווה את שתי קבוצות נתוני העוצמה עם עוצמת ספיגה ב- lambda max בציר y ו- pH בציר x, כאשר הנקודות מחוברות בקווים חלקים.
- חשב את ההפרש בין עוצמות הספיגה של התחלה וסיום עבור כל סדרת נתונים.
- קבע את הספיגה באמצע הדרך בין בליעת ההתחלה והסיום עבור כל סדרה, או את נקודות האמצע של הבליעה.
- מצא היכן מתרחשת נקודת האמצע בכל שורה וזהה את ערך ה- pH באותה נקודה. ערכי pH אלה הם pKa's של אדום נייטרלי חופשי וכבול.
- כאן, אנו רואים עלייה ב-pKa של בערך אחד בין אדום נייטרלי חופשי לאדום, מה שמצביע על כך שאדום נייטרלי קשור הוא חומצה חלשה יותר מאדום נייטרלי פרוטוני חופשי בסדר גודל.

Browse More Videos

Neutral Red

pKa

Cuvette #	Buffer pH	Abs. at λ_max(Free NRH⁺)	Abs. at λ_max (Bound NRH)
1	5.0
2	5.5
3	6.0
4	6.5
5	7.0
6	7.5
7	8.0
8	8.5
9	11
10	blank

	NRH⁺ חינם	NRH⁺ כרוך
λ_{מקסימום} (NM)
ΔA (ננומטר)
נקודת אמצע (nm)
pKa

מאגרי

טבלה 1: הכנת 50 mM NaH2PO4 Buffer, pH 7.0

טבלה 2: ספיגה של אדום נייטרלי חופשי וכבול

טבלה 3: קביעת pKa's אדום נייטרלי

Browse More Videos

טבלה 1: הכנת 50 mM NaH₂PO₄ Buffer, pH 7.0