Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
מקור: סמאא קורים באוניברסיטת ג'ונס הופקינס, MD, ארה"ב
בחלק הראשון של ניסוי זה, תכינו תמיסת נתרן פוספט ב-pH 7.0. מונוסודיום פוספט הוא חומצה חלשה עם הבסיס המצומד, דיסודיום פוספט. פתרונות מונוסודיום פוספט לא מותאמים בדרך כלל יש pH של כ 4 - 6.
המאגרים יעילים ביותר קרוב ל-pKa שלהם, שהוא 6.8 עד 7.2 עבור מונוסודיום פוספט. לכן, תשתמש ב- NaOH כדי לדחוף את שיווי המשקל לכיוון הבסיס המצומד מבלי לשנות את ההרכב הכולל של שיווי משקל החיץ.
| מסה מולרית של NaH2PO4 = 119.98 g/mol | |
| נפח תמיסה (מ"ל) | 200 |
| מולאריות (mM) | 50 |
| שומות של NaH2PO4 (mol) | |
| מסה דרושה (מ"ג) | |
| נפח התחלתי של 1 M NaOH (מ"ל) | |
| נפח סופי של 1 M NaOH (מ"ל) | |
| נפח NaOH בשימוש (מ"ל) | |
| נפח המים הדרוש DI (מ"ל) | |
ניתן להשתמש במאגרים כדי להעריך תרכובות בערכי pH ספציפיים. בסעיף זה, תתעד את ספקטרום הספיגה של המחוון אדום נייטרלי במאגרים שונים. הצורה הפרוטונית של אדום נייטרלי היא אדומה, והצורה המפורקת היא צהובה-כתומה, כלומר הם בולעים אור ירוק וכחול-סגול, בהתאמה. לפיכך, לצורות החומציות והבסיסיות יש אורכי גל בליעה שונים. קשירת חלבון משנה את התכונות של אדום נייטרלי, ומשנה הן את ספיגתו והן את ה- pKa שלו.
לאחר מדידת ספקטרום הספיגה של אדום נייטרלי חופשי במספר ערכי pH, תוסיפו חלבון קושר ריבופלבין, או RP, לתמיסות ותמדדו שוב את הספיגות שלהן. עוצמת הספיגה קשורה לריכוז, ולכן תשתמש בספקטרום כדי לקבוע את ה- pKa של אדום נייטרלי חופשי וקשור לאחר המעבדה.
| Cuvette # | Buffer pH | Abs. at λmax (Free NRH+) | Abs. at λmax (Bound NRH) |
| 1 | 5.0 | ||
| 2 | 5.5 | ||
| 3 | 6.0 | ||
| 4 | 6.5 | ||
| 5 | 7.0 | ||
| 6 | 7.5 | ||
| 7 | 8.0 | ||
| 8 | 8.5 | ||
| 9 | 11 | ||
| 10 | blank |
כעת, בואו ננתח את נתוני הספיגה שלנו כדי לקבוע את רמת ה-pKa של אדום נייטרלי.
| NRH+ חינם | NRH+ כרוך | |
| λמקסימום (NM) | ||
| ΔA (ננומטר) | ||
| נקודת אמצע (nm) | ||
| pKa |
בחלק הראשון של ניסוי זה, תכינו תמיסת נתרן פוספט חוצצת ב-pH 7.0. מונוסודיום פוספט היא חומצה חלשה עם הבסיס המצומד דיסודיום פוספט. לתמיסות מונוסודיום פוספט לא מותאמות יש בדרך כלל pH של כ-4 עד 6.
חוצצים יעילים ביותר קרוב ל-pKa שלהם, שהוא 6.8 עד 7.2 עבור מונוסודיום פוספט. לכן, תשתמש בנתרן הידרוקסיד כדי לדחוף את שיווי המשקל לכיוון הבסיס המצומד מבלי לשנות את ההרכב הכולל של שיווי המשקל של המאגר. לפני שתתחיל במעבדה, חשב את מסת המונוסודיום פוספט שתצטרך להכין 200 מיליליטר של תמיסה של 50 מילי-מולאר.
חלק זה של המעבדה משתמש בנתרן הידרוקסיד, שהוא מאכל ורעיל. היזהר בעת מזיגה והובלה של נתרן הידרוקסיד. עכשיו, בואו נתחיל.
ראשית, לבשו חלוק מעבדה, משקפי בטיחות עמידים בפני התזות וכפפות ניטריל. לאחר מכן, מלאו בקבוק כביסה מפלסטיק בנפח 250 מיליליטר במים נטולי יונים. סמן שתי כוסות של 100 מיליליטר לפסולת מימית ניטרלית ובסיסית, בהתאמה.
לאחר מכן, כייל את מד ה-pH שלך באמצעות המאגרים המצורפים. אחסן את הגשושית בתמיסת האחסון שלה כשתסיים. כעת, הביאו כוס של 400 מיליליטר לאזור האיזון האנליטי כדי להשיג את המונוסודיום פוספט שתצטרכו.
קח פיסת נייר שקילה והשתמש במרית נקייה כדי למדוד את הכמות הנדרשת של מונוסודיום פוספט בהתאם לחישובים שלך. מונוסודיום פוספט סופג לחות מהאוויר, לכן עבדו במהירות כדי להשיג מדידה מדויקת, וסגרו את המיכל היטב כשתסיימו איתו. רשום את הכמות המדויקת של מונוסודיום פוספט שאתה מודד במחברת המעבדה שלך.
לאחר מכן, הניחו את המונוסודיום פוספט בכוס ונקו את המרית בעזרת מגבון מעבדה. זרוק את נייר השקילה ואת מגבון המעבדה לפני שתחזור למכסה המנוע. כעת, השתמש בצילינדר מדורג כדי למדוד 175 מיליליטר של מים נטולי יונים.
שופכים את המים לכוס מונוסודיום פוספט ומוסיפים מוט ערבוב מגנטי. מערבבים את התמיסה על צלחת ערבוב עד שהמלח נמס לחלוטין והתמיסה נראית הומוגנית. זה בדרך כלל לוקח שתיים עד שלוש דקות.
לאחר מכן, מדוד 15 מיליליטר מים נטולי יונים בעזרת גליל מדורג. שופכים את המים נטולי היונים לכוס וממשיכים לערבב את התמיסה עד שהיא נראית שוב הומוגנית, מה שבדרך כלל לוקח דקה עד שתיים. לאחר מכן, כבה את מנוע הערבוב.
שטפו את בדיקת ה-pH במים נטולי יונים, ולאחר מכן הדקו אותה בתמיסה עם החיישן מעל מוט הערבוב. כעת, הביאו צילינדר מדורג של 10 מיליליטר וזכוכית שעון למכסה המנוע, ומדדו 10 מיליליטר של נתרן הידרוקסיד מולארי אחד. כסו את הנתרן הידרוקסיד שלכם בזכוכית השעון, והביאו אותו בזהירות למכסה המנוע.
שימו לב לנפח המדויק בצילינדר המדורג. לאחר מכן, המשך לערבב את תמיסת המונוסודיום פוספט. תוך כדי ניטור קריאת ה-pH, השתמש בפיפטה חד פעמית כדי להוסיף לאט נתרן הידרוקסיד לתמיסת הערבוב בצורה טיפתית.
ברגע שה-pH של המאגר מגיע ל-7.0, החזר כל נתרן הידרוקסיד שעדיין בפיפטה לגליל המדורג. לאחר מכן, חשב את נפח הנתרן הידרוקסיד שהוספת מהנפחים הראשוניים והסופיים בגליל המדורג. הפחיתו את הנפח הזה מ-10 מיליליטר כדי לקבוע כמה מים נטולי יונים עליכם להוסיף למאגר שלכם כדי להגיע לנפח תמיסה כולל של 200 מיליליטר.
מדוד את המים נטולי היונים הדרושים לך עם גליל נוסף של 10 מיליליטר והוסף אותם לתמיסת הערבוב כדי לסיים את הכנת המאגר. שטפו את חיישן ה-pH במים נטולי יונים, כסו אותו במכסה המלא בתמיסת האחסון ונתק או כבה את הבדיקה. לאחר מכן, סמן בקבוק פוליאתילן של 250 מיליליטר כמאגר מונוסודיום פוספט של 50 מילי-מולרי, pH 7.0'השתמש במלקחיים כדי להוציא את מוט הערבוב המגנטי מהתמיסה.
לאחר מכן, הניחו משפך בפי הבקבוק ושפכו את תמיסת החיץ לתוך הבקבוק. הסר את המשפך וכסה את הבקבוק בחוזקה. כעת אתה מוכן לעבור לחלק ספקטרוסקופיה של ספיגה.
ניתן להשתמש במאגרים כדי להעריך תרכובות בערכי pH ספציפיים. בחלק זה, תתעד את ספקטרום הספיגה של המחוון אדום ניטרלי במאגרים שונים. הצורה הפרוטונית של אדום ניטרלי היא אדומה, והצורה הדפרוטונציה היא צהובה-כתומה, כלומר הם סופגים אור ירוק וכחול-סגול, בהתאמה.
לפיכך, לצורות החומציות והבסיסיות יש אורכי גל ספיגה מובחנים. קשירת חלבון משנה את תכונותיו של אדום ניטרלי, ומשנה הן את יכולת הספיגה שלו והן את ה-pKa שלו. לאחר מדידת ספקטרום הספיגה של אדום ניטרלי חופשי במספר ערכי pH, תוסיף לתמיסות חלבון קושר ריבופלבין, או RP, ותמדוד שוב את הספיגה.
עוצמת הספיגה קשורה לריכוז, כך שתשתמש בספקטרום כדי לקבוע את ה-pKa של אדום ניטרלי חופשי וקשור לאחר המעבדה. לפני שתתחיל בחלק זה, צייר טבלה במחברת המעבדה שלך, המפרטת את מספר הקובטה, חומץ החומיץ, הספיגה בלמבדה מקסימום עבור אדום ניטרלי פרוטונציה חופשי, וספיגה בלמבדה מקסימום עבור אדום ניטרלי פרוטונציאלי קשור. מספר את הקובטות מ-1 עד 10 ורשום את תשעת ערכי ה-pH של המאגר שבהם תשתמש.
הקובט העשירי יהיה ריק מים נטול יונים. החזיקו תמיד את הקובט בצדדים בעלי המרקם ונגבו את הצדדים השקופים ממש לפני הכנסת הקובט לספקטרופוטומטר. זכור ליישר את הצדדים השקופים עם אלומת האור בספקטרופוטומטר.
עכשיו, בואו נתחיל. השג עשר קובטות וכובעים של 1.5 מיליליטר, וסמן את הכובעים 1 עד 10 כך שיתאימו לטבלה במחברת המעבדה שלך. סמן כוס של 25 מיליליטר כ-DIH2O ומלא אותה במים נטולי יונים.
לאחר מכן, שטפו את הפסולת המימית הנייטרלית שלכם לביוב, ותייגו מחדש את הכוס כפסולת חיץ מימית'כמו כן, סמנו כוס של 400 מיליליטר לקצות מיקרופיפטה משומשות. לאחר מכן, חבר קצה למיקרופיפטה של 1 מיליליטר, והשתמש בו כדי להוציא 1000 מיקרוליטר מים נטולי יונים לקובטה 10. זה יהיה ריק הממס שלך.
כעת, הוציאו את הקצה, כוונו את המיקרופיפטה להוציא 925 מיקרוליטר והצמידו קצה חדש. הנח 925 מיקרוליטר ממאגר מונוסודיום פוספט pH 7.0 בקובט חמש. יש להוציא את הקצה ולכסות את הקובטה.
לאחר מכן, הביאו את הקובטות הריקות הנותרות לטבלת החיץ. בהנחיית הטבלה במחברת המעבדה שלך, החלק 925 מיקרוליטר מכל מאגר לקובטה המתאימה באמצעות המיקרו-פיפטות המסומנות בתווית. היזהר לא להשתמש באותו קצה פיפטה עבור חוצצים שונים.
לאחר שתסיים, החזר את המאגרים לשולחן העבודה שלך. שם, הגדר מיקרופיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להוציא 75 מיקרוליטר ולחבר קצה למיקרופיפטה. כעת, השיגו בקבוקון או שפופרת של תמיסה אדומה ניטרלית, אותה ניתן לחלוק עם קבוצת תלמידים אחרת.
הוצא 75 מיקרוליטר של אדום ניטרלי לכל אחת מתשע קובטות החיץ. החלף את קצה הפיפטה אם הוא נוגע במאגר. הוציאו את קצה הפיפטה וכסו את הקובטות בסיום.
כעת, הפוך כל קובטה מספר פעמים כדי לערבב היטב את התמיסות. לאחר שערבבתם אדום ניטרלי עם כל מאגר, צלמו תמונה או רשמו את צבעי הפתרונות. לאחר מכן, הפעל ספקטרופוטומטר ידני והמתן עד שמקור האור יתחמם.
ברגע שהוא מוכן, צור ניסוי חדש למדידת ספיגה לעומת אורך גל עבור האדום הנייטרלי החופשי. לאחר מכן, הכנס את קובטת המים נטולי היונים. רכוש ספקטרום של המים נטולי היונים, והגדר אותו כרקע ממס או ריק.
לאחר מכן, הסר את הריק מהספקטרופוטומטר והכנס את הקובטה של אדום ניטרלי במאגר ה-pH הנמוך ביותר, שיהיה בעל הריכוז הגבוה ביותר של אדום ניטרלי פרוטונציה. רכשו ספקטרום, שאמור להראות שיא חזק אחד. זהה את אורך הגל המתאים לנקודה הגבוהה ביותר של שיא זה, או המקסימום.
רשום את אורך הגל הזה במחברת המעבדה שלך כ-lambda max עבור אדום ניטרלי חופשי עם פרוטונים. שמור את הנתונים והסר את הקובטה. רשום את הספיגה במחשב הנייד שלך ולאחר מכן אסוף ספקטרום עבור קובטות 2 עד 9 באמצעות אותו הליך.
כל הספקטרום צריך לחצות בנקודה אחת, הנקראת הנקודה האיזוסבסטית. רשום את אורך הגל של נקודה זו במחברת המעבדה שלך. אם ספקטרום לא חוצה בנקודה זו, רוקן ונקה את הקובטה, הכין דגימה טרייה ונסה שוב.
לאחר שתסיים לאסוף ספקטרום עבור כל 9 הקובטות, שמור וייצא את הנתונים. לאחר מכן, צור ניסוי חדש למדידת ספיגה לעומת אורך גל עבור האדום הנייטרלי הקשור התאם קצה חדש למיקרופיפטה של 200 מיקרוליטר וקבל מיכל משותף של חלבון קושר ריבופלבין.
הוסף 75 מיקרוליטר של תמיסת חלבון קושרת ריבופלבין לכל קובטה, כולל הריק. הוציאו את הקצה, אבטחו את מכסי הקובט והפכו את הקובט מספר פעמים כדי לערבב את התמיסות. כעת, הכנס קובטה 10 לספקטרופוטומטר והגדר אותה כריק הממס.
לאחר מכן, רכוש ספקטרום של דגימת ה-pH הנמוכה ביותר וזהה את אורך הגל המתאים למקסימום של השיא האינטנסיבי ביותר. רשום את זה במחברת המעבדה שלך כמקסימום למבדה של אדום ניטרלי כרוך פרוטונים. לאחר מכן, רכשו ספקטרום עבור קובטות 2 עד 9 באותו אופן שעשיתם עבור הדגימות האדומות הנייטרליות החינמיות.
רשום את העוצמות בלמבדה מקסימום עבור אדום ניטרלי קשור פרוטונציה בשולחן שלך, יחד עם אורך הגל בנקודה האיזוסבסטית. כשתסיים, שמור את הנתונים שלך, ייצא אותם לניתוח מאוחר יותר וכבה את הספקטרופוטומטר. הניחו בצד את המיקרופיפטות, קופסאות הקצה, מד ה-pH והספקטרופוטומטר.
השלך את קצות הפיפטה המשומשות שלך למיכל אשפה מאושר או לפח אשפה. כעת, רוקנו את הקובטות לכוס הפסולת המימית ושטפו את הקובטות לתוך הכוס במים נטולי יונים. במכסה המנוע שלך, רוקן את עודפי הנתרן הידרוקסיד לפסולת הבסיסית ושטוף את הגליל המדורג במים.
שטפו את הפסולת המימית הבסיסית לביוב עם מי ברז בשפע, יחד עם הפסולת המימית האחרת. שטפו את כלי הזכוכית, כובעי הקובטה ומוט הערבוב בהתאם לנהלים הסטנדרטיים של המעבדה שלכם. לבסוף, נקו את משטחי העבודה שלכם עם מגבת נייר לחה והשליכו מגבות נייר משומשות ומגבוני מעבדה לפח המעבדה.
כעת, בואו ננתח את נתוני הספיגה שלנו כדי לקבוע את ה-pKa של אדום ניטרלי. ראשית, שרטט את שתי קבוצות נתוני העוצמה עם עוצמת ספיגה בלמבדה מקסימלית על ציר ה-y, ו-pH על ציר ה-x, כאשר הנקודות מחוברות בקווים חלקים. לאחר מכן, עבור כל סדרת נתונים, חשב את ההפרש בין עוצמות הספיגה ההתחלתית והסיום.
השתמש בזה כדי לחשב את הספיגה באמצע הדרך בין ספיגת ההתחלה והסיום עבור כל סדרה, או את נקודות האמצע של הספיגה. כעת, מצא היכן מתרחשת נקודת האמצע בכל קו, וזהה את ערך ה-pH באותה נקודה. ערכי pH אלה הם ה-pKa של אדום ניטרלי חופשי וכבול.
כאן, אנו רואים עלייה ב-pKa של כ-1 בין אדום נייטרלי חופשי לאדום קשור, מה שמצביע על כך שאדום ניטרלי פרוטון קשור הוא חומצה חלשה יותר מאדום ניטרלי פרוטונציה חופשי בסדר גודל.
