מיצוי נוגדני של כרומטין- ChIP

Chromatin immunoprecipitation, או בקיצור ChIP, היא טכניקה לחקר אינטראקציות חלבון-DNA המווסתות ביטוי גנים.

באיקריוטים, הדנ"א עטוף סביב חלבוני היסטון ויוצר קומפלקס המכונה נוקלאוזום, אשר ממשיך להתקבץ יחד למבנה המכונה כרומטין כדי לסייע באריזה הדוקה של הדנ"א בתאים.

ביטוי גנים מווסת באמצעות שינויים בהיסטון המשחררים או מהדקים מבנים אלה, כמו גם חלבונים הקשורים לאזורי ויסות CIS בדנ"א.

ב- ChIP, הכרומטין מתפרק ונוגדנים הנקשרים לשינויים בהיסטון או חלבונים רגולטוריים, משמשים לבידוד מולקולות המטרה עם ה- DNA המשויך.

השלב הראשון בתהליך זה הוא להצליב את החלבון לדנ"א בעזרת חומר קרוסלינקינג, כגון פורמלדהיד. זה משתק את החלבון על הדנ"א המסמן את אתר הקישור של החלבון. לאחר הצלבה, הכרומטין נחתך מכנית למקטעים קצרים הנעים בין 100 ל -200 זוגות בסיסים. תהליך זה ידוע בשם X-ChIP.

שיטה חלופית היא N-ChIP, שבה נוקלאזות מעכלות ישירות את הדנ"א מהכרומטין למקטעים קצרים, ללא כל קישור צולב מוקדם.

משקעים חיסוניים מתבצעים על ידי החדרת נוגדנים המכוונים לחלבונים הרגולטוריים בתמיסה המכילה DNA גזוז או מעוכל. נוגדנים אלה קשורים לסוכנים המסייעים בבידוד סלקטיבי.

אחת השיטות הנפוצות היא קישור הנוגדנים לחרוזים מגנטיים. מגנט משמש לבידוד הנוגדנים יחד עם כל המולקולות הקשורות.

הקומפלקס נשטף כדי לשטוף את כל המזהמים הקשורים באופן רופף. מולקולות המטרה מנותקות בעזרת חומר ניקוי, כגון SDS.

במקרה של X-Chip, crosslinking הוא הפוך בעזרת טמפרטורות גבוהות, ואת הרגולטורים הקשורים או histones הם התפרקו בעזרת proteases, משאיר מאחור את ה- DNA.

ריצוף הדנ"א המשויך יכול לסייע בזיהוי הרצף הרגולטורי CIS שהחלבון המעניין נקשר אליו או הגן שהביטוי שלו מווסת על ידי שינוי היסטון מסוים.